Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att injicera fästingembryon. Embryoinjektion är den föredragna tekniken för genetisk manipulation för att generera transgena linjer.
Abstract
Fästingar kan överföra olika virala, bakteriella och protozoa patogener och anses därför vara vektorer av medicinsk och veterinär betydelse. Trots den växande bördan av fästingburna sjukdomar har forskningen om fästingar släpat efter insektssjukdomsvektorer på grund av utmaningar med att tillämpa genetiska omvandlingsverktyg för funktionella studier på fästingarnas unika biologi. Genetiska ingrepp har fått uppmärksamhet för att minska myggburna sjukdomar. Utvecklingen av sådana ingrepp kräver emellertid stabil bakterieomvandling genom injektion av embryon. En sådan embryoinjektionsteknik saknas för chelicerat, inklusive fästingar. Flera faktorer, såsom ett yttre tjockt vaxlager på fästingembryon, hård korion och högt intra-ovalt tryck, är några hinder som tidigare förhindrade embryoinjektionsprotokollutveckling hos fästingar. Det aktuella arbetet har övervunnit dessa hinder, och en embryoinjektionsteknik för den svartbenta fästingen, Ixodes scapularis, beskrivs här. Denna teknik kan användas för att leverera komponenter, såsom CRISPR/Cas9, för stabila bakterietransformationer.
Introduction
Fästingar är vektorer av medicinsk och veterinär betydelse, som kan överföra en mängd olika virala, bakteriella, protozoa patogener och nematoder 1,2. I östra USA är den svartbenta fästingen, Ixodes scapularis, en viktig vektor av borreliapatogenen (LD), spiroketen Borrelia burgdorferi. Över 400 000 fall av LD rapporteras varje år i USA, vilket gör det till den främsta vektorburna infektionssjukdomen i USA1. Förutom B. burgdorferi överförs sex andra mikroorganismer av I. scapularis- inklusive fyra bakterier (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi och Ehrlichia muris eauclarensis), en protozo parasit (Babesia microti) och ett virus (Powassan-virus), vilket gör denna fästingart till ett stort folkhälsoproblem3 . Medan fästingburna sjukdomar har blivit vanligare de senaste åren, har forskning om fästingar hamnat efter andra leddjursvektorer, såsom myggor, på grund av fästingarnas unika biologi och utmaningar i samband med tillämpning av genetiska och funktionella genomiska verktyg 4,5.
Genredigeringstekniker, särskilt CRISPR/Cas9, har nu gjort funktionsgenomikstudier möjliga i icke-modellorganismer. För att skapa ärftliga mutationer i en organism förblir embryoinjektion den föredragna metoden för att leverera konstruktioner för att ändra könslinjen 6,7,8,9. Men fram till nyligen4 ansågs fästingägg vara för svåra eller till och med omöjliga att injicera utan att döda embryot10,11. Ett tjockt vaxlager på ägg, hård korion och högt intra-ovalt tryck var några av de största hindren som förhindrade embryoinjektion i fästingar. Vuxen, blodmatad I. scapularis deponerar en enda koppling på upp till 2,000 ägg12 under 3-4 veckor (cirka 100 ägg / dag). Ägg läggs ensamt och varje ägg beläggs med vax som utsöndras av utsprång eller "horn" av körteln Genés organ13,14,15 av modern. Detta vax skyddar äggen från uttorkning och innehåller antimikrobiella föreningar15. För att framgångsrikt injicera fästingägg är det viktigt att ta bort vaxskiktet, mjuka korionen och torka äggen för att minska det intraovala trycket så att injektionen inte irreversibelt skadar ägget. För att förstå den kritiska betydelsen av embryoinjektioner för framgångsrik bakterietransformation utvecklas ett protokoll för I. scapularis, som kan användas för att leverera en CRISPR / Cas9-konstruktion och generera stabila bakteriemutationer4. Förutom dess bidrag till I. scapularis-forskningen kan detta protokoll också optimeras för andra fästingarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ixodes scapularis vuxna köptes antingen från Oklahoma State University (OSU) eller uppföddes vid University of Nevada, Reno (UNR) (IACUC-protokoll #21-001-1118).
1. Beredning av kvinnliga fästingar för embryosamling
OBS: För att samla ägg av lämplig ålder är det viktigt att synkronisera äggläggning. Även om äggläggningssignaler i fästingar förblir oklara, under de vanliga insektsförhållandena (27 ° C temperatur och >90% relativ luftfuktighet (RH)), börjar I. scapularis-honor lägga ägg cirka 8 dagar efter värdens lossning. Denna tidslinje kan förlängas genom att lagra fyllda honor vid 4 °C. Vi har lagrat blodmatade honor vid 4 °C upp till 8 veckor utan någon negativ effekt på äggläggning. Dessa villkor kan behöva ändras för varje insektsområde.
- Förvara alla fylliga honor vid 4 °C med >90 % RH i en 6-kvarts plastlåda fodrad med fuktigt filterpapper tills den används för mikroinjektioner.
- En vecka före injektioner, överför honor från 4 °C till en 27 °C inkubator för initiering av äggläggning.
- När honorna börjar lägga ägg (3-4 dagar efter att de flyttat till 27 °C), ta bort eventuella ägg med en finspetsad pensel och förbered honorna för Genés organablation (vaxkörtel).
OBS: Genés organ sträcker sig från området mellan scutum och capitulum (mundelarnas dorsala bas), mundelar böjer sig över den ventrala kroppsytan (parallellt med ytan) och den förlängda genens organ täcker ägg så snart äggen läggs (figur 1). Ägg som läggs före Genés organborttagning eller tömning av vax kommer att ha en vaxbeläggning och är inte lämpliga för injektioner och måste kasseras. - För att antingen ta bort eller tömma Genés organ, använd lera för att placera den uppslukade honan på en glasskiva under ett mikroskop orienterat så att mundelar är synliga på både ventrala och dorsala sidor (figur 1B,C).
- Stick försiktigt området exakt mellan scutum och mundelar med fina pincett och volframnålar gjorda i labbet med volframtråd enligt ett tidigare publicerat protokoll16 (nålar kan också köpas kommersiellt och fästas på en mikrodissekerande sond, se Materialförteckning).
- Arbeta vägen in med volframnålen, dra ut vaxkörteln (figur 1D,E). Det kan ta flera minuter att ta bort körteln. Torka bort eventuell flytande vaxsekretion med hjälp av laboratorieservetter.
OBS: Körteln kan också tas bort från den ventrala sidan precis under mundelarna; genom att nå i ryggen mot scutum med en nål och pincett. Applicering av kisellim runt mundelar blockerar också Gene organeversion och kan användas istället för att ta bort eller tömma vaxet (personlig kommunikation med Dr. Ladislav Simo, INRAE, Frankrike). Engorged fästingar kommer inte att stanna på dubbelsidig tejp. Att använda lera för att "swaddle" fästingen hjälper till att hålla dem på plats under manipulation. Använd pincett för att hålla fästingen och volframnålen för dissektion. Den ventrala delen är lättare att genomborra med en nål och föredras av författarna.
- För att tömma körteln, ordna gravidfästingen som nämns i steg 1.4. Punktera försiktigt området bakom mundelarna på dorsalsidan och applicera tryck på den ventrala sidan med pincett.
OBS: Alternativt är det inte nödvändigt att ta bort vaxkörteln; tömning av vaxkörteln kommer att pågå i flera dagar. Äggläggande kvinnor har ett vitt område runt mundelarna som indikerar vaxkörtelns placering och kan användas som referens.- Placera kanten på en luddfri labbservett och ta bort det flytande vaxet som kommer ut från punkteringsstället. Se till att undvika hemolymfsekretion, vilket är en klar vätska jämfört med något gulaktigt visköst vax. Det kan ta 5-10 min tills det mesta av vaxet har tagits bort.
- Efter manipulation, placera honor i en inkubator vid 27 ° C (>90% RH) och låt dem återhämta sig i 1-2 dagar.
OBS: Behandlade honor tar vanligtvis 1-2 dagar att återhämta sig och börja lägga ägg igen. - När honorna börjar lägga ägg igen, använd en fin pensel för att samla nyligen deponerade ägg (0-18 h efter äggläggning) och placera dem i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
OBS: Om du använder ägg från samma kvinna över tiden måste denna procedur upprepas efter 4-5 dagars äggläggning om körtlarna inte togs bort.
2. Embryobehandling för mikroinjektioner
- Tillsätt ~ 200 μL (eller tillräcklig volym för att täcka äggen, beroende på antalet ägg) av 5% (vikt / volym) bensalkoniumklorid / vatten (se materialtabell) i röret som innehåller 0-18 h gamla ägg. Virvla försiktigt äggen med penseln i 5 minuter för att undvika att äggen sätter sig i botten av röret (för detaljer, se Sharma et al.4). Ta bort supernatanten med en mikropipett och lämna äggen kvar i röret.
VARNING: Bensalkoniumklorid är frätande för hud och ögon, använd handskar och ögonskydd. - Tillsätt ~ 200 μL destillerat (DI) vatten till röret som innehåller ägg, virvla med en pensel och ta bort vattnet från mikrocentrifugröret med en mikropipett. Upprepa tvätten med DI-vatten en gång till.
- Efter tvättning med DI-vatten, tillsätt ~ 200 μL 5% (w / v) natriumklorid (NaCl) och virvla försiktigt med en pensel i 5 min. Ta bort lösningen från röret efter 5 min och tvätta äggen två gånger med DI-vatten.
- Tillsätt ~ 100 μL 1% (w / v) NaCl-lösning i mikrocentrifugröret som innehåller ägg. Förvara äggen i 1% (w/v) NaCl-lösning tills de används för injektion.
- Starta mikroinjektioner efter ungefär en timme. Denna tidslinje hjälper till med korrekt uttorkning av äggen och förhindrar att de spricker.
OBS: Ägg kan förvaras i 1% (w / v) NaCl-lösning i 7-8 timmar utan att signifikant påverka överlevnaden. Om äggen är svåra att injicera eller brista, är äggen inte tillräckligt torkade och kan behandlas ytterligare med 5% (w / v) NaCl i ytterligare 5 minuter.
3. Beredning av injektionsnålar
- Sätt in ett aluminosilikatkapillärglas (med filament, se Materialförteckning) i nåldragaren enligt tillverkarens anvisningar.
- Justera nåldragaren till följande inställningar: Värme: 575, Drag: 20, Hastighet: 50, tid: 200 och Tryck: 700.
- Aktivera nåldragarens dragfunktion och upprepa processen för ytterligare nålar.
- Förvara de dragna nålarna genom att fästa dem i rader av modellerarens lera i en ren petriskål.
- Ladda nålen med injektionsblandningen med en mikrolastarspets (se Materialförteckning).
OBS: Jämförelsen av nålar som används för injektion av fästing- och myggembryon visas i figur 2.
4. Bildinställning för mikroinjektionerna
- Använd dubbelsidig tejp och fäst två glasmikroskopglas tillsammans och lämna ett mellanrum på cirka 0,5 cm för att stödja inriktning av ägg och förhindra att de rullar över under injektioner (figur 3A).
- Applicera en bit transparent filmförband (se Materialförteckning) på den dubbelsidiga tejpen i gapet mellan bilderna. Se till att justera filmförbandet perfekt med gapet.
5. Embryo mikroinjektioner
- Rikta in 8-10 ägg åt gången på bildinställningen (ovan) med en enhårig pensel.
OBS: Ägg som är inriktade på den längre axeln vinkelrätt (figur 3B) mot glidkanten är lättare att injicera än ägg vars längsgående axel är inriktad parallellt med kanten (figur 3C). Ägg i vinkelrät riktning (figur 3B) tål bättre injektion vilket resulterar i högre överlevnad. - Placera bilden med inriktade ägg på scenen i ett sammansatt mikroskop. Använd en bit luddfri torkning för att ta bort 1% NaCl-lösningen där de förvaras.
- Fäst den fyllda injektionsnålen på en mikroinjektor ansluten till en mikromanipulator (se Materialförteckning).
- Öppna nålen genom att försiktigt gnida den mot äggytan med en högtrycksinställning på mikroinjektorn (>5 000 hPa).
- När nålen har öppnats, minska trycket (1 000-2 500 hPa) på mikroinjektorn beroende på nålens öppning.
OBS: En liten öppning kräver jämförelsevis högre tryck, medan en större öppning kräver ett lägre tryck. Detta för att kontrollera volymen av den injicerade konstruktionen. Beroende på nålöppningens storlek varierar injektionsvolymen från 1-5 pL. - Injicera alla ägg på bilden i en 10 ° -15 ° vinkel så snabbt som möjligt och flytta omedelbart bilden till hög luftfuktighet i en petriskål fodrad med fuktigt papper. Så snart äggen injiceras börjar de torka.
OBS: Att injicera ett litet antal ägg åt gången ökar injektionsframgången och överlevnadssannolikheten. Nålar blir igensatta av embryoåterflöde. Om spetsen fortfarande är skarp, för att rensa tilltäppta nålar, flytta nålen i en liten droppe med 1% NaCl som läggs till kanten av bilden. Kapillärverkan kommer att lossna den lilla igensättningen. Om nålen redan är trubbig, byt den.
6. Vård av embryon efter injektion
- Placera bilden som innehåller injicerade embryon i en stor petriskål fodrad med fuktigt filterpapper.
OBS: Det är viktigt att inte störa äggen i minst 5-6 timmar. Detta gör att injektionssåret kan tätas ordentligt. Injektionssåret kan öppna sig när det är upprört, och cytoplasma kan börja sippra ut, vilket resulterar i äggdödlighet. - Efter 5-6 h, tillsätt en liten droppe DI-vatten till den transparenta filmförbandet med injicerade embryon fästa. Flytta äggen försiktigt med en pensel. Överför äggen till en liten petriskål (10 cm) och sänk ner dem i DI-vatten.
OBS: Filmförbandet möjliggör enkel borttagning av ägg efter injektioner. I det ögonblick som en vattendroppe läggs till filmförbandet börjar äggen röra sig tillsammans med vattnet. - Håll äggen nedsänkta i vatten och placera petriskålen i en 6-kvarts plastlåda i en inkubator vid 27 ° C och > 90% RH.
- Kontrollera äggen regelbundet, dagligen de första dagarna och sedan var 3-4: e dag tills larverna börjar kläckas.
OBS: Om ett stort antal ägg skadas under mikroinjektioner, kommer försiktigt tömning av DI-vattnet efter en vecka att förhindra svamptillväxt på de döda äggen. - När larverna börjar kläckas från de injicerade embryona (21-25 dagar efter injektion för den nuvarande laboratorieinställningen), kontrollera dem dagligen och överför eventuella kläckta larver till glasflaskor med en skärm ovanpå. Larver kan kläckas under vattnet och överleva i ~ 1-2 veckor.
- Screena larverna4 om äggen injicerats med en konstruktion som kan resultera i en synlig fenotyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett framgångsrikt embryoinjektionsprotokoll för I. scapularis beskrivs i denna artikel. Äggläggande kvinnor hölls vid hög luftfuktighet för att undvika uttorkning av delvis vaxade ägg. Vaxskiktet avlägsnades för att injicera fästingembryon genom att ablatera genens organ (vaxkörtel) hos den gravida honan (figur 1A-E). Vi använde aluminosilikatglasnålar med kortare hals (figur 2). Denna form var idealisk för fästingägginjektion eftersom den tål trycket bättre än den långhalsade (avsmalnande) nålen som används för insektsägginjektioner. Den sfäriska formen på fästingägg kräver en glidplattform backstage (figur 3A) för att undvika att ägget rullas av bilden under nålinsättning. Den tidiga embryonala utvecklingen av I. scapularis är okänd, så tidpunkten och platsen för bakteriecellsbildning är också okänd. Därför valde vi att injicera ägg tidigt i utvecklingen (12-18 h gamla) och fann att inriktning av äggets längre axel vinkelrätt mot kanten av bilden resulterar i högre överlevnad (figur 3B, C). Med hjälp av detta protokoll injicerades flera tusen ägg. Av dessa injicerade ägg överlevde upp till 8,5% och larver kläcktes (tabell 1). Behandlade men oinjicerade ägg hade en mycket högre överlevnad (upp till 70%), vilket tyder på förbättring av injektioner (antingen genom timing, injektionsställe eller nål) kan förbättra äggöverlevnaden. Detta protokoll utvecklades för att injicera ägg tidigt i embryogenesen (12-18 h gammal); Detta kan dock användas för ägg upp till 10 dagar gamla med längre behandling med NaCl och bensalkoniumklorid.
Figur 1: Manipulering av I. scapularis Genés organ. (A) Diagram över Genens organ. Överst: Genens organ under scutum. Botten: everted körtel och mundelar nedfällda. (B) En fylld hona under mikroskopet säkrad av lera. (C) En hona flyttar sina mundelar på den ventrala ytan under äggläggning för att förlänga Gens organ. Gula pilar visar vita fläckar och kan användas som referens för Gene's organplats. Dessa områden är synliga hos kvinnor som lägger ägg i 2-3 veckor. (D,E) Genens organ (en liten bubbla i D och utsträckt i E) är synligt mellan scutum och capitulum. Hornen på Genés organ sträcker sig när mundelarna böjer sig nedåt (E). Den blå pilen visar platsen för att sätta in en volframnål för att ta bort körteln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Jämförelse av formen på glasinjektionsnålar. Den mellersta används för fästingembryon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Äggjustering för injektioner . (A) Glasskiva som används för embryoinjektioner. Mikroskopglasskivor fästs och lämnar ett mellanrum med dubbelsidig tejp och det transparenta filmförbandet placeras på tejpen. Äggen är inriktade på kanten av bilden. (B) Optimal inriktning av ägg med en lång axel vinkelrätt mot kanten av bilden. (C) Mindre effektiv inriktning av ägg med den långa axeln parallellt med kanten på glidinställningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Konstruera injicerad | Tid efter äggläggning | Antal ägg som injicerats | Antal kläckta larver | Överlevnad i procent |
| sgRNA + Cas9 | ≤12 timmar | 2,396 | 147 | 6.14 |
| Gen 1 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12 timmar | 3, 135 | 269 | 8.58 |
| Gen 2 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12 timmar | 2, 460 | 139 | 5.65 |
| Gen 3 | ||||
| Wolbachia | ≥ 24 timmar (24-36 timmar) | 1, 765 | 72 | 4.08 |
| sgRNA + Cas9 | 48-60 timmar | 191 | 5 | 2.62 |
| Gen 2 |
Tabell 1: Framgångsrik ägginjektion och larvkläckning i Ixodes scapularis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta är det första protokollet som utvecklats för att injicera tidiga fästingembryon framgångsrikt. En överlevnad på ~4%-8% har uppnåtts, vilket är jämförbart med embryoinjektion i andra väletablerade insektsmodeller5.
Eftersom detta är det ursprungliga protokollet förväntas detta protokoll förfinas ytterligare och specialiseras till enskilda fästingarter. I synnerhet kommer injektionstiden att variera från art till art, beroende på embryogenes, särskilt tidpunkten för cellularisering. De preliminära uppgifterna tyder på att I. scapularis ägg inte går igenom snabb kärndelning under de första 24 timmarna efter läggning och cellularisering sker några dagar senare (opublicerade data). Vi har redan använt detta protokoll för plasmidleverans 4, CRISPR-medierad gen knockout4 och leverans av bakterier (Wolbachia) (tabell 1). Det förväntas att detta embryoinjektionsprotokoll kommer att ge möjligheter att generera transgena fästingar och kommer att göra gen knockout och knock-in-studier möjliga i alla laboratorier. Detta kommer att visa sig vara värdefullt för att påskynda studier som utforskar fästingbiologi och fästing-patogen-värdgränssnitt.
Kritiska steg i protokollet
Det är viktigt att samla ägg inom 24 timmar efter läggning eftersom detta protokoll har standardiserats för tidiga embryon. Om ägg samlas in efter denna tid behövs en längre behandling av bensalkoniumklorid och NaCl, och överlevnaden är lägre i äldre ägg (tabell 1). Korionen hårdnar med tiden, vilket gör det svårt att göra kontrollerad uttorkning för mikroinjektioner i ägg äldre än 24 timmar. Det märktes att injektion av färre ägg åt gången hjälper till med överlevnad eftersom de behandlade äggen tenderar att torka snabbt när de tas bort från 1% NaCl-lösningen. Om äggen torkar för mycket kommer de att dö, men de kommer att brista under mikroinjektion om de inte torkas på lämpligt sätt. Därför är det nödvändigt att optimera lämplig uttorkningstid för olika fästingarter eller stammar. Dessutom är det viktigt att hålla äggen ostörda efter mikroinjektioner under förhållanden med hög luftfuktighet.
Begränsningar och framtida riktningar
När embryona har avvaxats tenderar de att torka snabbt, så processen att anpassa dem på bilden och injicera dem måste genomföras snabbt. Den snabba förbättringen av hastighet och noggrannhet kan endast uppnås genom konstant övning och tålamod. Vårt framtida arbete kommer att fokuseras på att förbättra överlevnadsprocenten för embryon efter injektion och identifiera tidpunkten för bildning av könsceller för att säkerställa ärftliga mutationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Channa Aluvihare och Yonus Gebermicale, ITF, UMD, för insikt och stöd under den inledande fasen av protokollutveckling. Volframnålar var en generös gåva från David O'Brochta, ITF, UMD. Vi är tacksamma mot Dr. Ladislav Simo för att ha testat detta protokoll i I. ricinus och för insiktsfulla diskussioner. Detta projekt finansierades av NIH-NIAID R21AI128393 och Plymouth Hill Foundation, NY till MG-N, startmedel från University of Nevada till AN, National Science Foundation Grant nr 2019609 till MG-N och AN, och ett Peer-to-Peer-bidrag från IGTRCN till AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
