Summary
En el presente protocolo, la función de barrera endotelial de la glándula submandibular (SMG) se evaluó inyectando diferentes trazadores fluorescentes ponderados molecularmente en las venas angulares de modelos animales de prueba in vivo bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones.
Abstract
La saliva juega un papel importante en la salud oral y general. La función de barrera endotelial intacta de los vasos sanguíneos permite la secreción de saliva, mientras que la disfunción de la barrera endotelial está relacionada con muchos trastornos secretores de las glándulas salivales. El presente protocolo describe un método de detección de permeabilidad paracelular in vivo para evaluar la función de las uniones estrechas endoteliales (TJ) en glándulas submandibulares de ratón (SMG). Primero, se inyectaron dextranos marcados con fluorescencia con diferentes pesos moleculares (4 kDa, 40 kDa o 70 kDa) en las venas angulares de ratones. Posteriormente, el SMG unilateral se diseccionó y fijó en el soporte personalizado bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones, y luego se capturaron imágenes de vasos sanguíneos, acinos y conductos. Utilizando este método, se monitorizó la fuga dinámica en tiempo real de los trazadores de diferentes tamaños de los vasos sanguíneos hacia los lados basales de los acinos e incluso a través del epitelio acinar hacia los conductos para evaluar la alteración de la función de barrera endotelial en condiciones fisiológicas o fisiopatológicas.
Introduction
Varias glándulas salivales producen saliva, que actúa principalmente como la primera línea de defensa contra las infecciones y ayuda a la digestión, desempeñando así un papel esencial en la salud oral y general1. El suministro de sangre es crucial para la secreción de las glándulas salivales, ya que proporciona constantemente agua, electrolitos y moléculas que forman la saliva primaria. La función de barrera endotelial, regulada por el complejo de unión estrecha (TJ), limita estricta y delicadamente la permeación de los capilares, que son altamente permeables al agua, solutos, proteínas e incluso células que se mueven desde los vasos sanguíneos circulantes hacia los tejidos de las glándulas salivales 2,3. Hemos encontrado previamente que la apertura de los TJ endoteliales en respuesta a un estímulo colinérgico facilita la secreción de saliva, mientras que el deterioro de la función de barrera endotelial está interrelacionado con la hiposecreción y la infiltración linfocítica en las glándulas submandibulares (SMG) en el síndrome de Sjögren4. Estos datos sugieren que la contribución de la función de barrera endotelial debe prestarse suficiente atención con respecto a una variedad de enfermedades de las glándulas salivales.
Un microscopio de escaneo láser de dos fotones es una herramienta poderosa para observar la dinámica de las células en el tejido intacto in vivo. Una de las ventajas de esta técnica es que la luz infrarroja cercana (NIR) tiene una penetración tisular más profunda que la luz visible o ultravioleta cuando las muestras son excitadas por NIR y no causa daño obvio a los tejidos en condiciones apropiadas 5,6. De hecho, las glándulas salivales son un tejido muy homogéneo y superficial, en el que las células acinares superficiales están a sólo unos 30 μm de distancia de la superficie de la glándula 7,8. Se ha demostrado que la microscopía confocal intravital puede estudiar la secreción exocrina y el citoesqueleto de actina en glándulas salivales de ratón vivas a resolución subcelular8. Sin embargo, la microscopía de barrido láser de dos fotones no solo tiene la ventaja de la microscopía confocal convencional, sino que también se puede usar para detectar tejidos e imágenes más profundos con mayor claridad. Aquí, los dextranos marcados con fluorescencia, que se utilizan con frecuencia como trazadores de permeabilidad paracelular y tienen la ventaja de diferentes tamaños, se pueden usar para probar la magnitud del poro TJ9. En el presente estudio, se establece una técnica intravital de microscopía de barrido láser de dos fotones en tiempo real para la evaluación in situ de la función de barrera endotelial en SMG de ratón. Cada paso de trabajo para la detección de permeabilidad vascular in vivo en SMG de ratón se describe en el protocolo actual. Aquí hay un ejemplo de detección de la función de barrera endotelial en el modelo de ligadura del conducto SMG del ratón.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación Animal, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín, y cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicación NIH No. 85-23, revisada en 1996). Para el presente estudio se utilizaron ratones machos de tipo salvaje (WT) en el grupo de edad de 8-10 semanas. Los animales experimentales fueron tratados cuidadosamente para minimizar su dolor y malestar.
1. Procedimientos con animales
- Preparar y administrar los anestésicos y trazadores.
- Mantener condiciones estériles durante todo el estudio y esterilizar los instrumentos en autoclave. Divide los ratones en dos grupos.
NOTA: El grupo de control no se trató, y el otro grupo con ligadura unilateral del conducto SMG durante 1 día sirvió como grupo experimental. Al agrupar, los ratones con peso corporal y edad similares deben seleccionarse para reducir la influencia del peso y la edad en la permeabilidad vascular. - Elija trazadores apropiados, como el dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (peso molecular: 4 kDa; FD4) y dextrano marcado con rodamina B (peso molecular: 70 kDa; RD70) (ver Tabla de materiales) con espectros de excitación/emisión distintos para minimizar la interferencia entre señales de fluorescencia (utilizando el filtro FITC o rodamina B, respectivamente) para el ensayo de permeabilidad.
NOTA: Las longitudes de onda de excitación de FD4 y RD70 son 488 nm y 594 nm, respectivamente, y las longitudes de onda de emisión seleccionadas son 511-564 nm y 617-669 nm, respectivamente. - Diluir los marcadores en solución salina estéril tamponada con fosfato (1x PBS) en existencias de 100 mg/ml y almacenar las alícuotas protegidas de la luz a −20 °C.
NOTA: El dextrano con un peso molecular como 4 kDa se filtrará rápidamente de la sangre en SMG de ratón incluso sin condiciones patológicas10. - Inyectar intraperitonealmente el tribromoetanol (la dosis para un ratón de 25 g fue de aproximadamente 600 μL) para anestesiar a los ratones. Proporcionar analgesia según lo recomendado por el comité local de ética animal.
NOTA: Después de la inducción de la anestesia, use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad. Cuida bien de los animales11. Espere hasta que el ratón tolere la estimulación mecánica, por ejemplo, pellizcar el dedo del pie sin respuesta motora. - Inyectar una mezcla de dos trazadores de permeabilidad paracelular con diferentes pesos moleculares (FD4 y RD70) en la vena angular (0,5 mg/g de peso corporal). Inyecte cada ratón con una mezcla de solución trazadora de 100 μL, con 50 μL de cada colorante mezclado en una proporción de 1:1.
- Después de la anestesia, sostenga suavemente la cabeza y el cuello del ratón para hacer que un lado del globo ocular sobresalga ligeramente. Inserte una jeringa de insulina que contenga marcadores fluorescentes (tenga cuidado de no introducir aire en la jeringa) a lo largo de la esquina del ojo en ángulo recto con respecto al ojo.
NOTA: Si la vena angular se inserta correctamente, la solución de tinte se inyectará fácilmente en la vena y no habrá resistencia durante la inyección. Además, la inyección de venas de la cola en ratones también podría ser un candidato para moléculas trazadoras intravenosas.
- Después de la anestesia, sostenga suavemente la cabeza y el cuello del ratón para hacer que un lado del globo ocular sobresalga ligeramente. Inserte una jeringa de insulina que contenga marcadores fluorescentes (tenga cuidado de no introducir aire en la jeringa) a lo largo de la esquina del ojo en ángulo recto con respecto al ojo.
- Mantener condiciones estériles durante todo el estudio y esterilizar los instrumentos en autoclave. Divide los ratones en dos grupos.
- Realice el aislamiento de SMG siguiendo los pasos a continuación.
NOTA: Use herramientas estériles, incluyendo tijeras de tejido y níquel de separación, para la cirugía.- Separe una glándula unilateral cuidadosamente para no dañar los vasos sanguíneos y nervios circundantes bajo un microscopio estereoscópico.
- Después de la inyección de trazadores de permeabilidad paracelular, coloque rápidamente los ratones sobre el cartón y colóquelos en posición supina con sus extremidades y cabezas pegadas con cinta adhesiva. Aplique crema depilatoria en la piel del cuello para eliminar el vello del ratón. Use etanol al 75% para desinfectar la piel antes de la cirugía.
- Luego, bajo un microscopio estereoscópico, corte la epidermis del cuello con tijeras de tejido general para exponer ambos lados de los SMG (la glándula derecha fue tratada en este experimento). Luego, use un níquel de separación de tejido romo (consulte la Tabla de materiales) para separar suavemente la cápsula de la superficie de la glándula, teniendo cuidado de no dañar el tejido glandular y los vasos sanguíneos.
- Separe la cápsula de la superficie de la glándula sin dañar la estructura glandular. Además, asegúrese de que todo el proceso de restricción del ratón y separación de la glándula se realice en 10 minutos.
- Separe una glándula unilateral cuidadosamente para no dañar los vasos sanguíneos y nervios circundantes bajo un microscopio estereoscópico.
2. Configuración del microscopio de dos fotones
- Conecte el soporte personalizado al dispositivo de presión negativa y verifique si el efecto de presión negativa se logra correctamente de antemano.
NOTA: El soporte tiene la forma de una lupa en miniatura con una pieza plana de vidrio redondo en el centro (diámetro: 4,32 mm, Figura 1). El dispositivo de presión negativa se diseñó internamente de tal manera que el soporte está conectado a un tubo de goma, que está conectado con una botella de drenaje, y la botella está unida al controlador de presión negativa a través de un tubo de goma corto. De esta manera, el controlador de presión negativa puede ajustar la presión para garantizar que el tejido sea aspirado por el soporte.- Vincule un lado del soporte con el dispositivo de presión negativa. Para probar si el dispositivo de presión negativa está intacto y es apropiado, voltee el soporte boca abajo, agregue una gota de agua y establezca el valor de presión negativa en 20 unidades. Si el agua se aspira completa y rápidamente, el dispositivo de presión negativa se instala correctamente con el soporte.
- Coloque suavemente el SMG expuesto del ratón en el soporte personalizado y aspire el tejido mediante succión de presión negativa lo más lejos posible del cuerpo del ratón para reducir los artefactos de movimiento causados por la respiración y otras afecciones.
- Imagen del material de soporte unido a la glándula bajo un objetivo de inmersión en agua 25x/NA 1.0 (especial para NIR).
NOTA: Utilice un microscopio vertical de dos fotones (consulte la Tabla de materiales) en este experimento. Los vasos sanguíneos deben ser visibles inmediatamente con fluorescencia obvia después de la inyección del marcador.
3. Obtención de imágenes de vasos y detección de permeabilidad
- Comience a tomar imágenes poco después de que se haya elegido la vista de la glándula.
NOTA: Normalmente, las series temporales de 45-50 imágenes en 20 s o más generalmente se capturan dependiendo del diseño experimental. - Adquiera imágenes secuenciales a lo largo del eje Z, escalonado a 2 μm de distancia, desde la superficie de la glándula hasta 70-140 μm en el tejido para generar una construcción tridimensional (3D).
- Adquirir imágenes de lapso de tiempo de los vasos para medir la permeabilidad vascular en el SMG.
NOTA: Establezca las condiciones del menú del programa de la siguiente manera después de ejecutar el software del microscopio (consulte la Tabla de materiales).- En el cuadro de diálogo Explorador, haga clic en Agregar nueva carpeta y cambie el nombre del archivo.
- Vuelva a la columna Adquisición . En XY, el formato es 512 x 512 y la velocidad es 400 Hz. Activa la X bidireccional .
- Establezca el factor de zoom en 0,75 y 1,5 para zoom.
- Para adquirir imágenes de lapso de tiempo, seleccione xyt en Modo de adquisición. Establezca la duración en 20 s, 30 min o más según la necesidad experimental.
- Para realizar la construcción 3D, establezca el Modo de adquisición en xyz. El tamaño Z-Step se puede ajustar de acuerdo con la situación real.
- Después de establecer las condiciones, haga clic en Live para observar las imágenes vasculares de dos canales y canales superpuestos en el marco de formación de fotos y elija las áreas de interés.
- Haga clic en Iniciar para iniciar la creación de imágenes.
NOTA: El ratón no debe dejarse desatendido durante el proceso de obtención de imágenes mientras está bajo anestesia.
4. Análisis de datos
- Para evaluar la permeabilidad de los vasos, utilice el software Image J para calcular la relación de intensidad de fluorescencia de FD4 y RD70 entre los vasos externos e internos y denotarlos como intensidad extra e intravascular4.
NOTA: La alteración de la permeabilidad vascular a través del rastreo del transporte de dextranos refleja el cambio en la función de barrera endotelial. Además, observe la morfología vascular y la densidad calculando el diámetro y el número de cambios en los vasos.- Ejecute el software Image J (consulte Tabla de materiales).
- Haga clic en Archivo y seleccione Abrir para abrir las imágenes de los vasos sanguíneos capturadas bajo el microscopio de dos fotones.
- Seleccione Imagen y establezca Tipo en 16 bits para convertir el formato de imagen.
- Seleccione Analizar y seleccione Área, Media, IntDen en Establecer medidas. Haga clic en Aceptar para confirmar.
- En Analizar, seleccione Herramientas, abra ROI Manager y seleccione Mostrar todo y etiquetas.
- Mida el valor de intensidad de fluorescencia intravascular: haga clic en la herramienta lazo en la interfaz principal para dibujar el contorno del vaso sanguíneo. Haga clic en Agregar en ROI Manager. Siga este paso para continuar seleccionando varios buques. Seleccione todos los objetos del ROI Manager y haga clic en Medir.
- Mida el valor de intensidad de fluorescencia total: describa toda la imagen, haga clic en Medir y el resultado será el valor de intensidad de fluorescencia total de la imagen.
- Calcular el valor de intensidad de fluorescencia extravascular. Copie los datos en Excel para el cálculo. Relación de intensidad de fluorescencia extravascular = (1 − valor de intensidad de fluorescencia intravascular/valor de intensidad de fluorescencia total) × 100%.
5. Aplicaciones posteriores
- Durante el experimento, calcule la tasa de flujo sanguíneo midiendo la distancia que experimenta un glóbulo rojo (que se muestra como un punto negro bajo el microscopio de dos fotones)4 en un período de tiempo.
- Para visualizar el movimiento de las células sanguíneas a través de las células endoteliales, marque las células sanguíneas por fluorescencia. Luego, inyecte las células marcadas con fluorescencia con FD4 o RD70 a través de la vena de la cola del ratón. Después de circular durante 5 minutos, rastree las células interesadas durante un período.
NOTA: Un total de 2 linfocitos marcadoscon CFSE (carboxifluoresceína succinimidyl ester, un colorante fluorescente permeable a la membrana) derivados del bazo de ratones donantes se transfirieron a receptores mediante inyección en venas de cola, y la infiltración de linfocitos en SMG se investigó en modelos animales experimentales4.
6. Cuidado y recuperación de animales
- Cuida bien a los animales durante todo el experimento.
NOTA: Asegúrese de que el animal que se ha sometido a cirugía no sea devuelto a la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente durante el experimento. - No deje al animal desatendido hasta que recupere suficiente conciencia.
NOTA: Observe el estado respiratorio de los ratones continuamente y manténgalos calientes poniéndolos en la almohadilla térmica del animal. Proporcionar alojamiento de recuperación del dolor postquirúrgico y analgesia, según lo recomendado por el comité local de ética animal.
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Representative Results
Siguiendo el protocolo, el SMG unilateral se unió a un soporte hecho a medida, y la glándula se mantuvo lo más lejos posible del cuerpo del ratón para evitar que la respiración causara artefactos de movimiento. El flujo rápido de los glóbulos rojos (puntos negros) en los vasos sanguíneos se observó bajo el microscopio. Después de encontrar el campo de tejido debajo de una lente ocular, uno debe cambiar para manipular el software del microscopio. En el grupo de control, ambos trazadores existían en los vasos sanguíneos del SMG del ratón. En particular, debido a su pequeño peso molecular, FD4 fue capaz de filtrarse de los vasos sanguíneos a los lados basales de acinos y conductos, representando así claramente la forma de los acinos y conductos (como A y D señalan en la Figura 2A). Por el contrario, los dextranos con pesos moleculares más altos, como 40 kDa y 70 kDa, no pudieron diferenciar la morfología SMG. De hecho, RD70 se distribuyó predominantemente en vasos sanguíneos y microvasos de gran tamaño. En el grupo de ligadura de conductos, tanto FD4 como RD70 se extravasaron a los lados basales de los acinos, lo que indicó que la ligadura del conducto podría interrumpir la función de barrera endotelial y luego aumentar la permeabilidad a moléculas grandes. Los resultados semicuantitativos de intensidad de fluorescencia FD4 y RD70 también confirmaron los fenómenos anteriores (Figura 2B). Además, el diámetro de los vasos sanguíneos aumentó, lo que indica que la ligadura de conductos durante 1 día indujo la dilatación de los vasos sanguíneos. Además, las imágenes en 3D mostraron una fluorescencia mucho más oscura de FD4 y RD70 alrededor de los vasos sanguíneos en el grupo de ligadura (Figura 2C).
Figura 1: Un diagrama esquemático que muestra el soporte personalizado. El soporte tiene la forma de una lupa en miniatura con una pieza plana de vidrio redondo en el centro (diámetro: 4,32 mm). Un lado del soporte está conectado con el dispositivo de presión negativa para aspirar los tejidos debajo del vidrio, mientras que el otro lado del soporte está muerto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ensayo de permeabilidad vascular in vivo e imágenes 3D de vasos sanguíneos en glándulas submandibulares (SMG) de ratones. Los ratones se dividieron en grupos de control y ligadura de conductos. Las glándulas unilaterales en ambos grupos fueron expuestas y observadas. (A) El ensayo de permeabilidad vascular in vivo se realizó inyectando 4 kDa dextrano marcado con FITC (FD4) y 70 kDa dextrano marcado con rodamina B (RD70) en la vena angular. Las puntas de flecha indican los cambios en la distribución de los trazadores en el SMG. A, acini. D, conducto. Barra de escala = 100 μm. (B) Para el análisis de semicuantificación de las imágenes anteriores, la intensidad de fluorescencia, incluyendo FD4 y RD70 dentro de los vasos sanguíneos (intravascular) y fuera de los vasos sanguíneos (extravascular), se midió mediante el software Image J. (C) Imágenes en 3D de vasos sanguíneos y microvasos en SMG. Las puntas de flecha indican los cambios en la distribución de los trazadores en el SMG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El mantenimiento y la regulación de la función de barrera endotelial son esenciales para la homeostasis vascular. Las células endoteliales y sus uniones intercelulares juegan un papel crítico en el mantenimiento y control de la integridad vascular12. La fuerza de corte del flujo sanguíneo, los factores de crecimiento y los factores inflamatorios pueden causar cambios en la permeabilidad vascular y, por lo tanto, participar en la ocurrencia y desarrollo de enfermedades sistémicas como hipertensión, diabetes y enfermedades autoinmunes13,14,15. La distribución vascular y el flujo sanguíneo de la glándula salival es uno de los más abundantes en todos los órganos y tejidos, pero la investigación sobre el sistema vascular de la glándula salival no se ha llevado a cabo ampliamente. Una comprensión más profunda y completa de los vasos sanguíneos de las glándulas salivales, particularmente la función de barrera endotelial, proporcionará nuevas pistas sobre el mecanismo de secreción salival y promoverá la investigación de la biología vascular.
La técnica de microscopía de barrido láser de dos fotones in vivo puede cuantificar la permeabilidad vascular mediante inyección intravenosa de colorante fluorescente sin sacrificar al animal. Los dextranos marcados con fluorescencia con microesferas de diferentes pesos o tamaños moleculares pueden evaluar mejor la extensión de la lesión endotelial. Mientras tanto, la cinética dinámica de la permeabilidad vascular se determina en tiempo real mediante el uso del sistema de evaluación intravital de la permeabilidad vascular. Otra ventaja es que es fácil distinguir los tipos de vasos sanguíneos, como arteriolas, vénulas y capilares16. Además, la destrucción de la barrera endotelial vascular y la migración de las células inmunes están inevitablemente relacionadas con la inflamación, pero hay muchos estudios que investigan un solo factor, y solo unos pocos estudios se han centrado en la conexión entre ambos aspectos17,18. Uhl et al. establecieron recientemente un método de investigación para analizar el papel de diferentes factores patógenos en las enfermedades de las glándulas salivales mediante la inyección de dextranos marcados con fluorescencia y anticuerpos específicos de células inmunes con diferentes marcadores fluorescentes simultáneamente in vivo19. Aquí, las células inmunes marcadas con fluorescencia también se pueden rastrear a través de la inyección de venas de la cola para explorar la patogénesis en el modelo de trabajo actual. Por lo tanto, el presente método experimental puede proporcionar un sistema único para estudiar la interacción entre la extravasación de leucocitos y la integridad de la barrera endotelial en modelos animales de enfermedad SMG in vivo.
Sin embargo, no debe ignorarse que la capacidad de respuesta de los ratones a los anestésicos es diferente, y cuanto más tiempo toma la imagen, mayor es el tiempo de anestesia necesario y más difícil es para los ratones recuperarse. Por lo tanto, este experimento se utiliza mejor para investigar cuando no se requieren experimentos in vivo posteriores después de la imagen. Además, otra limitación es que esta técnica no es adecuada para experimentos con un largo período de tiempo. Los dextranos son solubles en agua y fáciles de metabolizar, lo que resulta en una fluorescencia más débil con un tiempo de imagen más largo y, por lo tanto, es mejor mantener el tiempo de imagen dentro de los 30 minutos.
En conjunto, el estudio se centra en la penetración de trazadores de permeabilidad paracelular y células de vasos sanguíneos y microvasos en tejidos glandulares y ha establecido rigurosamente la microscopía de barrido láser dinámico intravital de dos fotones con contraste como un método avanzado para medir la permeabilidad vascular para evaluar la función de barrera endotelial en el SMG de ratón.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 y 81974151) y la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (subvención 7202082).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
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