Summary
본 프로토콜에서, 턱밑샘(SMG)의 내피 장벽 기능은 이광자 레이저 스캐닝 현미경 하에 생체 내에서 시험 동물 모델의 각 정맥에 상이한 분자 가중 형광 추적자를 주입함으로써 평가되었다.
Abstract
타액은 구강 및 전반적인 건강에 중요한 역할을합니다. 혈관의 손상되지 않은 내피 장벽 기능은 타액 분비를 가능하게하는 반면, 내피 장벽 기능 장애는 많은 타액선 분비 장애와 관련이 있습니다. 본 프로토콜은 마우스 턱밑샘 (SMG)에서 내피 조밀 접합부 (TJ)의 기능을 평가하기 위한 생체내 초세포 투과성 검출 방법을 기술한다. 먼저, 상이한 분자량 (4 kDa, 40 kDa 또는 70 kDa)을 갖는 형광 표지 된 덱스 트란을 마우스의 각 정맥에 주입 하였다. 그 후, 일방적 인 SMG를 해부하여 2 광자 레이저 스캐닝 현미경으로 맞춤형 홀더에 고정 한 다음 혈관, acini 및 덕트에 대한 이미지를 캡처했습니다. 이 방법을 사용하여 혈관에서 acini의 기저측으로, 심지어 acinar 상피를 가로질러 덕트로 다양한 크기의 추적자의 실시간 동적 누출을 모니터링하여 생리적 또는 병리생리학적 조건에서 내피 장벽 기능의 변화를 평가했습니다.
Introduction
다양한 타액선은 주로 감염에 대한 첫 번째 방어선 역할을하고 소화를 돕는 타액을 생성하여 구강 및 전반적인 건강에 필수적인 역할을합니다1. 혈액 공급은 일차 타액을 형성하는 물, 전해질 및 분자를 지속적으로 제공하기 때문에 타액선 분비에 중요합니다. 단단한 접합 (TJ) 복합체에 의해 조절되는 내피 장벽 기능은 물, 용질, 단백질 및 순환 혈관에서 타액선 조직으로 이동하는 세포에도 투과성이 높은 모세 혈관의 투과를 엄격하고 섬세하게 제한합니다 2,3. 우리는 이전에 콜린성 자극에 반응하여 내피 TJ의 개방이 타액 분비를 촉진하는 반면, 내피 장벽 기능의 손상은 쇼그렌 증후군4의 턱밑샘(SMG)의 저분비 및 림프구 침윤과 상호 연결되어 있음을 발견했습니다. 이러한 데이터는 내피 장벽 기능의 기여가 다양한 타액선 질환에 대해 충분한주의를 기울일 필요가 있음을 시사합니다.
이광자 레이저 스캐닝 현미경은 생체 내 온전한 조직에서 세포의 역학을 관찰하기 위한 강력한 도구입니다. 이 기술의 장점 중 하나는 표본이 NIR에 의해 여기될 때 근적외선(NIR)이 가시광선 또는 자외선보다 조직 침투가 더 깊고적절한 조건에서 조직에 명백한 빛 손상을 일으키지 않는다는 것입니다5,6. 실제로, 타액선은 매우 균질하고 표면적인 조직이며, 표면 acinar 세포는 샘 표면 7,8에서 약 30μm 떨어져 있습니다. 생체 내 컨포칼 현미경은 살아있는 마우스 타액선에서 세포하 분해능8에서 외분비 분비와 액틴 세포골격을 연구할 수 있는 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구하고 이광자 레이저 스캐닝 현미경은 기존 컨포칼 현미경의 장점이 있을 뿐만 아니라 더 깊은 조직과 이미지를 보다 명확하게 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서, paracellular 투과성 추적자로 자주 사용되고 크기가 다른 장점을 갖는 형광 표지 덱스 트란은 TJ 기공9의 크기를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 본 연구에서는 마우스 SMG에서 내피 장벽 기능의 현장 평가를 위해 생체 내 실시간 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 기술이 확립되었습니다. 마우스 SMG에서 생체내 혈관 투과성 검출을 위한 각각의 작업 단계는 현재 프로토콜에 기재되어 있다. 다음은 마우스 SMG 덕트 결찰 모델에서 내피 장벽 기능을 검출하는 예입니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 북경대학 보건과학센터 동물연구윤리위원회의 승인을 받았으며 실험동물의 관리 및 사용 가이드(NIH 간행물 제85-23호, 1996년 개정)를 준수했습니다. 8-10주의 연령 그룹의 수컷 야생형(WT) 마우스를 본 연구에 사용하였다. 실험동물은 통증과 불편함을 최소화하기 위해 조심스럽게 처리하였다.
1. 동물 절차
- 마취제와 추적자를 준비하고 투여하십시오.
- 연구 전반에 걸쳐 멸균 상태를 유지하고 오토클레이빙을 통해 기기를 멸균합니다. 마우스를 두 그룹으로 나눕니다.
참고: 대조군은 치료하지 않은 상태로 두었고, 1일 동안 일방적 SMG 덕트 결찰을 받은 다른 그룹은 실험군으로 봉사했습니다. 그룹화 할 때, 체중과 연령이 혈관 투과성에 미치는 영향을 줄이기 위해 체중과 나이가 비슷한 마우스를 선택해야합니다. - 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 덱스트란(분자량: 4kDa; FD4) 및 로다민 B 표지된 덱스트란(분자량: 70 kDa; RD70) ( 재료 표 참조) 투과성 분석을 위해 형광 신호 간의 간섭을 최소화하기 위해 (각각 FITC 또는 로다민 B 필터 사용) 별개의 여기/방출 스펙트럼을 사용합니다.
참고: FD4 및 RD70의 여기 파장은 각각 488nm 및 594nm이고 선택된 방출 파장은 각각 511-564nm 및 617-669nm입니다. - 추적자를 멸균 인산염 완충 식염수(1x PBS)에 희석하여 100mg/mL 스톡으로 희석하고 빛으로부터 보호되는 분취량을 -20°C에서 보관합니다.
참고: 분자량이 4kDa인 덱스트란은 병리학적 상태가 없어도 마우스 SMG의 혈액에서 빠르게 누출됩니다10. - 트리브로모에탄올(25g 마우스에 대한 용량은 약 600μL)을 복강주사하여 마우스를 마취시킨다. 지역 동물 윤리위원회의 권고에 따라 진통제를 제공하십시오.
알림: 마취 유도 후 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용하십시오. 동물을 잘 돌봐11. 마우스가 기계적 자극(예: 운동 반응 없이 발가락 꼬집음)을 견딜 때까지 기다리십시오. - 분자량이 다른 두 개의 세포 투과성 추적자 (FD4 및 RD70)의 혼합물을 각 정맥 (0.5 mg / g 체중)에 주입합니다. 각 마우스에 100μL 추적 용액 혼합물을 주입하고 각 염료 50μL를 1:1 비율로 혼합합니다.
- 마취 후 마우스의 머리와 목을 부드럽게 잡고 안구의 한쪽이 약간 튀어 나오도록합니다. 형광 추적자가 들어있는 인슐린 주사기 (주사기에 공기가 들어 가지 않도록주의)를 눈의 모서리를 따라 눈과 직각으로 삽입하십시오.
참고: 각맥이 올바르게 삽입되면 염료 용액이 정맥에 쉽게 주입되고 주입 중에 저항이 없습니다. 또한 마우스의 꼬리 정맥 주사도 정맥 추적 분자의 후보가 될 수 있습니다.
- 마취 후 마우스의 머리와 목을 부드럽게 잡고 안구의 한쪽이 약간 튀어 나오도록합니다. 형광 추적자가 들어있는 인슐린 주사기 (주사기에 공기가 들어 가지 않도록주의)를 눈의 모서리를 따라 눈과 직각으로 삽입하십시오.
- 연구 전반에 걸쳐 멸균 상태를 유지하고 오토클레이빙을 통해 기기를 멸균합니다. 마우스를 두 그룹으로 나눕니다.
- 아래 단계에 따라 SMG 격리를 수행합니다.
알림: 수술에는 조직 가위와 분리 니켈을 포함한 멸균 도구를 사용하십시오.- 입체 현미경으로 주변 혈관과 신경을 손상시키지 않도록 일방적 인 샘을 조심스럽게 분리하십시오.
- paracellular 투과성 추적자를 주입 한 후 마우스를 판지 위에 빠르게 놓고 팔다리와 머리를 테이프로 붙인 앙와위 자세로 놓습니다. 목 피부에 제모 크림을 바르면 마우스의 머리카락이 제거됩니다. 수술 전에 75 % 에탄올을 사용하여 피부를 소독하십시오.
- 그런 다음 실체 현미경으로 일반 조직 가위로 목의 표피를 잘라 SMG의 양쪽을 노출시킵니다 (이 실험에서는 오른쪽 샘을 처리했습니다). 다음으로, 뭉툭한 조직 분리 니켈( 재료 표 참조)을 사용하여 샘 조직과 혈관을 손상시키지 않도록 주의하면서 샘 표면에서 캡슐을 부드럽게 분리합니다.
- 선 구조를 손상시키지 않고 샘 표면에서 캡슐을 분리하십시오. 또한 마우스 구속 및 글 랜드 분리의 전체 과정이 10 분 이내에 완료되도록하십시오.
- 입체 현미경으로 주변 혈관과 신경을 손상시키지 않도록 일방적 인 샘을 조심스럽게 분리하십시오.
2. 이광자 현미경 설정
- 맞춤형 홀더를 음압 장치에 연결하고 음압 효과가 제대로 달성되었는지 미리 확인하십시오.
참고: 홀더는 중앙에 평평한 둥근 유리 조각이 있는 소형 돋보기 모양입니다(직경: 4.32mm, 그림 1). 음압 장치는 홀더가 배수 병과 연결된 고무 튜브에 연결되고 병이 짧은 고무 튜브를 통해 음압 컨트롤러에 부착되는 방식으로 사내에서 설계되었습니다. 이러한 방식으로 음압 컨트롤러는 조직이 홀더로 빨려 들어가도록 압력을 조정할 수 있습니다.- 홀더의 한쪽을 음압 장치와 연결합니다. 음압 장치가 손상되지 않고 적절한지 테스트하려면 홀더를 거꾸로 뒤집고 물 한 방울을 넣고 음압 값을 20 단위로 설정하십시오. 물이 완전하고 빠르게 흡입되면 음압 장치가 홀더와 함께 성공적으로 설치됩니다.
- 노출된 마우스의 SMG를 맞춤형 홀더에 부드럽게 놓고 음압 흡입으로 조직을 마우스 몸에서 최대한 멀리 빨아들여 호흡 및 기타 조건으로 인한 동평을 줄입니다.
- 25x/NA 1.0 수침 대물렌즈(NIR 전용)에서 글랜드에 부착된 지지 재료를 이미지화합니다.
참고: 이 실험에서는 직립 이광자 현미경( 재료 표 참조)을 사용하십시오. 혈관은 추적 주사 후 명백한 형광으로 즉시 볼 수 있어야합니다.
3. 선박 이미징 및 투과성 감지
- 글 랜드의 시력이 선택된 직후 이미징을 시작하십시오.
참고: 일반적으로 실험 설계에 따라 20초 이상 동안 45-50개 이미지의 시계열이 캡처됩니다. - 글랜드 표면에서 최대 70-140μm까지 2μm 간격으로 Z축을 따라 순차적인 이미지를 획득하여 3차원(3D) 구조를 생성합니다.
- SMG의 혈관 투과성을 측정하기 위해 혈관의 타임 랩스 이미징을 획득합니다.
참고: 현미경 소프트웨어를 실행한 후 프로그램 메뉴의 조건을 다음과 같이 설정하십시오( 재료 표 참조).- 탐색기 대화 상자에서 새 폴더 추가를 클릭하고 파일 이름을 변경합니다.
- 획득 열로 돌아갑니다. XY에서 형식은 512 x 512이고 속도는 400Hz입니다. 양방향 X를 켭니다.
- 확대/축소 비율을 0.75 및 확대/축소의 경우 1.5로 설정합니다.
- 타임랩스 이미징을 획득하려면 획득 모드에서 xyt를 선택합니다. 실험 필요에 따라 지속 시간을 20초, 30분 또는 그 이상으로 설정합니다.
- 3D 구성을 만들려면 획득 모드를 xyz로 설정합니다. Z-Step 크기는 실제 상황에 따라 설정할 수 있습니다.
- 조건을 설정 한 후 라이브 를 클릭하여 사진 형성 프레임에서 두 채널과 겹치는 채널의 혈관 영상을 관찰하고 관심 영역을 선택합니다.
- 시작을 클릭하여 이미징을 시작합니다.
참고: 마우스를 마취 상태에서 이미징 과정 중에 방치해서는 안 됩니다.
4. 데이터 분석
- 혈관 투과성을 평가하려면 Image J 소프트웨어를 사용하여 외부 및 내부 혈관 사이의 FD4 및 RD70의 형광 강도 비율을 계산하고 이를 혈관외 및 혈관 내 강도로 표시합니다4.
참고: 덱스트란의 수송 추적을 통한 혈관 투과성의 변화는 내피 장벽 기능의 변화를 반영합니다. 또한, 혈관 변화의 직경과 개수를 계산하여 혈관 형태 및 밀도를 관찰한다.- Image J 소프트웨어를 실행합니다(재질 표 참조).
- 파일을 클릭하고 열기를 선택하여 이광자 현미경으로 캡처한 혈관 이미지를 엽니다.
- 이미지를 선택하고 유형을 16비트로 설정하여 이미지 형식을 변환합니다.
- 분석을 선택하고 측정 설정에서 면적, 평균, IntDen을 선택합니다. 확인을 클릭하여 확인합니다.
- 분석에서 도구를 선택하고 ROI 관리자를 연 다음 모두 표시 및 레이블을 선택합니다.
- 혈관 내 형광 강도 값 측정: 메인 인터페이스에서 올가미 도구를 클릭하여 혈관의 윤곽을 스케치합니다. ROI 관리자에서 추가를 클릭합니다. 여러 선박을 계속 선택하려면 이 단계를 따르십시오. ROI 관리자의 모든 개체를 선택하고 측정을 클릭합니다.
- 총 형광 강도 값 측정: 전체 이미지의 윤곽을 그리고 측정을 클릭하면 결과는 이미지의 총 형광 강도 값입니다.
- 혈관외 형광 강도 값을 계산한다. 계산을 위해 데이터를 Excel에 복사합니다. 혈관외 형광 강도 비율 = (1 - 혈관내 형광 강도 값/총 형광 강도 값) × 100%.
5. 다운스트림 애플리케이션
- 실험 중에 적혈구(이광자 현미경에서 검은색 점으로 표시됨) 4가 일정 시간 동안 겪는 거리를 측정하여 혈류량을 계산합니다.
- 내피 세포를 가로지르는 혈액 세포의 움직임을 시각화하려면 형광으로 혈액 세포를 표시하십시오. 그런 다음 형광 표지된 세포를 마우스 꼬리 정맥을 통해 FD4 또는 RD70으로 주사합니다. 5 분 동안 순환 한 후 관심있는 세포를 일정 기간 추적하십시오.
참고: 총 2 x 106 CFSE (카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르, 막 투과성 형광 염료) 기증자 마우스의 비장에서 유래한 표지된 림프구를 꼬리 정맥 주사에 의해 수용자에게 전달하고, SMG에 림프구의 침윤을 실험 동물 모델4에서 조사하였다.
6. 동물 관리 및 회복
- 실험 내내 동물을 잘 돌보십시오.
알림: 수술을받은 동물은 실험 중에 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사로 반환되지 않도록하십시오. - 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
알림: 생쥐의 호흡 상태를 지속적으로 관찰하고 동물 가열 패드에 올려 따뜻하게 유지하십시오. 지역 동물 윤리위원회의 권고에 따라 수술 후 통증 회복 주택과 진통제를 제공합니다.
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Representative Results
프로토콜에 따라 일방적 인 SMG는 맞춤형 홀더에 부착되었으며 글 랜드는 호흡이 운동 아티팩트를 일으키지 않도록 마우스 몸에서 최대한 멀리 유지되었습니다. 혈관에서 적혈구 (검은 점)의 빠른 흐름을 현미경으로 관찰했습니다. 안구 렌즈 아래에서 조직 필드를 찾은 후에는 현미경 소프트웨어를 조작하도록 전환해야 합니다. 대조군에서는 두 추적자 모두 마우스 SMG의 혈관에 존재했습니다. 특히, 분자량이 작기 때문에 FD4는 혈관에서 acini 및 덕트의 기저부로 누출 될 수 있었기 때문에 acini와 덕트의 모양을 명확하게 묘사 할 수있었습니다 (그림 2A에서 A와 D가 지적한 것처럼). 대조적으로, 40kDa 및 70kDa와 같은 더 높은 분자량을 갖는 덱스트란은 SMG 형태를 구별할 수 없었다. 실제로 RD70은 대형 혈관과 미세 혈관에 우세하게 분포했습니다. 덕트 결찰 그룹에서 FD4와 RD70은 모두 acini의 기저측으로 혈관을 유출했으며, 이는 덕트 결찰이 내피 장벽 기능을 방해하고 큰 분자에 대한 투과성을 증가시킬 수 있음을 나타냅니다. 반정량적 FD4 및 RD70 형광 강도 결과 또한 위와 같은 현상을 확인하였다(도 2B). 게다가, 혈관의 직경이 증가하였고, 이는 1일 동안 덕트 결찰이 혈관의 확장을 유도함을 나타낸다. 또한, 3D 이미지는 결찰 그룹의 혈관 주위에 FD4 및 RD70의 훨씬 더 가려진 형광을 보여주었습니다 (그림 2C).
그림 1: 맞춤형 홀더를 보여주는 회로도. 홀더는 중앙에 둥근 유리의 평평한 조각 (직경 : 4.32mm)이있는 소형 돋보기 모양입니다. 홀더의 한쪽은 음압 장치와 연결되어 유리 아래의 조직을 빨아들이고 홀더의 다른 쪽은 죽습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 생쥐 턱밑샘(SMG)의 혈관 에 대한 생체 내 혈관 투과성 분석 및 3D 이미지. 마우스를 대조군과 덕트 결찰군으로 나누었다. 두 그룹의 일방적 인 땀샘이 노출되고 관찰되었습니다. (A) 4 kDa FITC 표지 덱스트란 (FD4) 및 70 kDa 로다민 B 표지 덱스트란 (RD70)을 각 정맥에 주입하여 생체 내 혈관 투과성 분석을 수행하였다. 화살촉은 SMG의 추적자 분포 변화를 나타냅니다. 에이, 아시니. D, 덕트. 스케일 바 = 100 μm. (B) 상기 이미지의 반정량 분석을 위해, FD4 및 RD70을 포함한 형광 강도를 혈관내(혈관내) 및 혈관외부(혈관외)로 Image J 소프트웨어로 측정하였다. (C) SMG의 혈관 및 미세 혈관의 3D 이미지. 화살촉은 SMG의 추적자 분포 변화를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
내피 장벽 기능의 유지 및 조절은 혈관 항상성에 필수적입니다. 내피 세포와 그 세포 간 접합부는 혈관 완전성을 유지하고 제어하는 데 중요한 역할을합니다12. 혈류의 전단력, 성장 인자 및 염증 인자는 혈관 투과성의 변화를 일으킬 수 있으므로 고혈압, 당뇨병 및자가 면역 질환과 같은 전신 질환의 발생 및 발달에 참여할 수 있습니다13,14,15. 타액선의 혈관 분포와 혈류는 모든 장기와 조직에서 가장 풍부한 것 중 하나이지만 타액선의 혈관 시스템에 대한 연구는 널리 수행되지 않았습니다. 타액선 혈관, 특히 내피 장벽 기능에 대한 더 깊고 포괄적 인 이해는 타액 분비 메커니즘에 대한 새로운 단서를 제공하고 혈관 생물학 연구를 촉진 할 것입니다.
생체 내 이광자 레이저 주사 현미경 기술은 동물을 희생시키지 않고 형광 염료를 정맥 주사하여 혈관 투과성을 정량화할 수 있습니다. 분자량 또는 크기가 다른 마이크로스피어를 갖는 형광 표지된 덱스트란은 내피 손상의 정도를 더 잘 평가할 수 있습니다. 한편, 혈관 투과성의 동적 동역학은 혈관 투과성의 생체 내 평가 시스템을 사용하여 실시간으로 결정됩니다. 또 다른 장점은 세동맥, 세정맥 및 모세혈관(16)과 같은 혈관의 유형을 구별하는 것이 용이하다는 것이다. 또한 혈관 내피 장벽의 파괴와 면역 세포의 이동은 필연적으로 염증과 관련이 있지만 단일 요인을 조사하는 많은 연구가 있으며 두 측면 사이의 연결에 초점을 맞춘 연구는 소수에 불과합니다17,18. Uhl 등은 최근 생체 내에서 형광 표지 덱스트란과 면역 세포 특이적 항체에 서로 다른 형광 마커를 동시에 주입하여 타액선 질환에서 다양한 병원성 인자의 역할을 분석하는 연구 방법을 확립했습니다.19. 여기에서 형광 표지 면역 세포는 꼬리 정맥 주사를 통해 추적하여 현재 작업 모델에서 병인을 탐색할 수도 있습니다. 따라서, 본 실험 방법은 생체내에서 SMG 질환 동물 모델에서 혈관외 유출과 내피 장벽 완전성 사이의 상호작용을 연구하기 위한 독특한 시스템을 제공할 수 있다.
그럼에도 불구하고 마취제에 대한 마우스의 반응성이 다르며 이미징 시간이 길수록 마취 시간이 길어지고 마우스가 회복하기가 더 어렵다는 점을 무시해서는 안됩니다. 따라서이 실험은 이미징 후 후속 생체 내 실험이 필요하지 않은 경우 조사하는 데 더 잘 사용됩니다. 또한, 또 다른 한계는 이 기술이 장시간의 실험에는 적합하지 않다는 것이다. 덱스트란은 수용성이고 대사가 용이하여 이미징 시간이 길고 형광이 약하므로 이미징 시간을 30분 이내로 유지하는 것이 좋습니다.
전체적으로이 연구는 혈관 및 미세 혈관에서 선 조직으로의 초 세포 투과성 추적자 및 세포의 침투에 중점을두고 마우스 SMG의 내피 장벽 기능을 평가하기위한 혈관 투과성을 측정하는 고급 방법으로 조영제 강화 생체 내 동적 2 광자 레이저 스캐닝 현미경을 엄격하게 확립했습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 및 81974151)과 베이징 자연 과학 재단 (보조금 7202082)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
References
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