Summary
في البروتوكول الحالي ، تم تقييم وظيفة الحاجز البطاني للغدة تحت الفك السفلي (SMG) عن طريق حقن مقتفيات فلورية مختلفة مرجحة جزيئيا في الأوردة الزاوية لنماذج الاختبار في الجسم الحي تحت مجهر المسح بالليزر ثنائي الفوتون.
Abstract
يلعب اللعاب دورا مهما في صحة الفم والصحة العامة. تتيح وظيفة الحاجز البطاني السليمة للأوعية الدموية إفراز اللعاب ، في حين يرتبط خلل الحاجز البطاني بالعديد من اضطرابات إفراز الغدد اللعابية. يصف البروتوكول الحالي طريقة للكشف عن نفاذية الخلايا في الجسم الحي لتقييم وظيفة الوصلات الضيقة البطانية (TJs) في الغدد تحت الفك السفلي للفأر (SMG). أولا ، تم حقن dextrans المسمى بالتألق بأوزان جزيئية مختلفة (4 كيلو دالتون أو 40 كيلو دالتون أو 70 كيلو دالتون) في الأوردة الزاوية للفئران. بعد ذلك ، تم تشريح SMG أحادي الجانب وتثبيته في الحامل المخصص تحت مجهر المسح بالليزر ثنائي الفوتون ، ثم تم التقاط صور للأوعية الدموية والعنيبيات والقنوات. باستخدام هذه الطريقة ، تم رصد التسرب الديناميكي في الوقت الفعلي للمتتبعات ذات الأحجام المختلفة من الأوعية الدموية إلى الجوانب القاعدية للأسيني وحتى عبر ظهارة العنيب إلى القنوات لتقييم تغيير وظيفة الحاجز البطاني في ظل الظروف الفسيولوجية أو الفيزيولوجية المرضية.
Introduction
تنتج الغدد اللعابية المختلفة اللعاب ، الذي يعمل في المقام الأول كخط دفاع أول ضد الالتهابات ويساعد على الهضم ، وبالتالي يلعب دورا أساسيا في صحة الفم والصحة العامة1. يعد إمداد الدم أمرا بالغ الأهمية لإفراز الغدد اللعابية لأنه يوفر باستمرار الماء والكهارل والجزيئات التي تشكل اللعاب الأساسي. وظيفة الحاجز البطاني ، التي ينظمها مجمع الوصلة الضيقة (TJ) ، تحد بشكل صارم ودقيق من تغلغل الشعيرات الدموية ، والتي تكون شديدة النفاذية للماء والمواد المذابة والبروتينات وحتى الخلايا التي تنتقل من الأوعية الدموية المتداولة إلى أنسجة الغدد اللعابية 2,3. لقد وجدنا سابقا أن فتح TJs البطانية استجابة لمحفز كوليني يسهل إفراز اللعاب ، في حين أن ضعف وظيفة الحاجز البطاني مرتبط بنقص الإفراز وتسلل اللمفاويات في الغدد تحت الفك السفلي (SMGs) في متلازمة سجوجرن4. تشير هذه البيانات إلى أن مساهمة وظيفة الحاجز البطاني تحتاج إلى إيلاء اهتمام كاف فيما يتعلق بمجموعة متنوعة من أمراض الغدد اللعابية.
يعد مجهر المسح بالليزر ثنائي الفوتون أداة قوية لمراقبة ديناميكيات الخلايا في الأنسجة السليمة في الجسم الحي. تتمثل إحدى مزايا هذه التقنية في أن ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) له اختراق أعمق للأنسجة من الضوء المرئي أو الأشعة فوق البنفسجية عندما تكون العينات متحمسة بواسطة NIR ولا تسبب أضرارا ضوئية واضحة للأنسجة في ظل الظروف المناسبة 5,6. في الواقع ، الغدد اللعابية هي نسيج متجانس وسطحي للغاية ، حيث تكون الخلايا العنيبية السطحية على بعد حوالي 30 ميكرومتر فقط من سطح الغدة 7,8. لقد ثبت أن الفحص المجهري متحد البؤر داخل الجسم يمكنه دراسة إفراز الإفرازات والهيكل الخلوي الأكتين في الغدد اللعابية للفأر الحية بدقةتحت الخلوية 8. ومع ذلك ، فإن الفحص المجهري بالليزر ثنائي الفوتون لا يتمتع فقط بميزة الفحص المجهري التقليدي متحد البؤر ولكن يمكن استخدامه أيضا للكشف عن الأنسجة العميقة والصورة بشكل أكثر وضوحا. هنا ، يمكن استخدام dextrans المسمى بالتألق ، والذي يستخدم بشكل متكرر كمتتبعات نفاذية شبه خلوية وله ميزة الأحجام المختلفة ، لاختبار حجم مسام TJ9. في هذه الدراسة ، تم إنشاء تقنية الفحص المجهري بالليزر في الوقت الحقيقي ثنائي الفوتون للتقييم في الموقع لوظيفة الحاجز البطاني في رشاشات الفئران. يتم وصف كل خطوة عمل للكشف عن نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي في SMGs الماوس في البروتوكول الحالي. فيما يلي مثال على اكتشاف وظيفة الحاجز البطاني في نموذج ربط مجاري الهواء SMG للفأر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية ، مركز العلوم الصحية بجامعة بكين ، وامتثلت لدليل رعاية واستخدام المختبر (منشور المعاهد الوطنية للصحة رقم 85-23 ، المنقح عام 1996). تم استخدام ذكور الفئران البرية (WT) في الفئة العمرية من 8-10 أسابيع للدراسة الحالية. عولجت التجارب بعناية لتقليل آلامها وانزعاجها.
1. إجراءات الحيوان
- إعداد وإدارة التخدير والمتتبعات.
- الحفاظ على ظروف معقمة طوال فترة الدراسة وتعقيم الأدوات عن طريق التعقيم. قسم الفئران إلى مجموعتين.
ملاحظة: تركت المجموعة الضابطة دون علاج ، وكانت المجموعة الأخرى مع ربط مجاري SMG من جانب واحد لمدة 1 يوم بمثابة المجموعة التجريبية. عند التجميع ، يجب اختيار الفئران ذات وزن الجسم والعمر المتشابهين لتقليل تأثير الوزن والعمر على نفاذية الأوعية الدموية. - اختيار أدوات التتبع المناسبة مثل ديكستران الفلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) المسمى (الوزن الجزيئي: 4 كيلو دالتون; FD4) وديكستران المسمى رودامين ب (الوزن الجزيئي: 70 كيلو دالتون; RD70) (انظر جدول المواد) مع أطياف إثارة / انبعاث مميزة لتقليل التداخل بين إشارات التألق (باستخدام مرشح FITC أو rhodamine B ، على التوالي) لفحص النفاذية.
ملاحظة: الأطوال الموجية للإثارة ل FD4 و RD70 هي 488 نانومتر و 594 نانومتر ، على التوالي ، والأطوال الموجية للانبعاث المختارة هي 511-564 نانومتر و 617-669 نانومتر ، على التوالي. - قم بتخفيف مواد التتبع في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (1x PBS) إلى مخزون 100 مجم / مل وتخزين القسمة المحمية من الضوء عند -20 درجة مئوية.
ملاحظة: ديكستران مع الوزن الجزيئي مثل 4 كيلو دالتون سوف يتسرب بسرعة من الدم في رشاشات الفئران حتى بدون ظروف مرضية10. - حقن داخل الصفاق ثلاثي برومو إيثانول (كانت جرعة الفأر 25 جم حوالي 600 ميكرولتر) لتخدير الفئران. توفير التسكين على النحو الموصى به من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية.
ملاحظة: بعد تحريض التخدير ، استخدم مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف. اعتني جيدا بالحيوانات11. انتظر حتى يتحمل الماوس التحفيز الميكانيكي ، على سبيل المثال قرصة إصبع القدم دون استجابة حركية. - حقن خليط من اثنين من متتبعات نفاذية الخلايا بأوزان جزيئية مختلفة (FD4 و RD70) في الوريد الزاوي (0.5 مجم / جم من وزن الجسم). حقن كل فأر بمزيج محلول تتبع 100 ميكرولتر ، مع خلط 50 ميكرولتر من كل صبغة بنسبة 1: 1.
- بعد التخدير ، أمسك رأس وعنق الماوس برفق لجعل جانب واحد من مقلة العين يبرز قليلا. أدخل حقنة الأنسولين التي تحتوي على مقتفيات الفلورسنت (احرص على عدم إدخال أي هواء في المحقنة) على طول زاوية العين بزاوية قائمة على العين.
ملاحظة: إذا تم إدخال الوريد الزاوي بشكل صحيح ، فسيتم حقن محلول الصبغة بسهولة في الوريد ، ولن تكون هناك مقاومة أثناء الحقن. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون حقن الوريد الذيل في الفئران مرشحا أيضا لجزيئات التتبع الوريدية.
- بعد التخدير ، أمسك رأس وعنق الماوس برفق لجعل جانب واحد من مقلة العين يبرز قليلا. أدخل حقنة الأنسولين التي تحتوي على مقتفيات الفلورسنت (احرص على عدم إدخال أي هواء في المحقنة) على طول زاوية العين بزاوية قائمة على العين.
- الحفاظ على ظروف معقمة طوال فترة الدراسة وتعقيم الأدوات عن طريق التعقيم. قسم الفئران إلى مجموعتين.
- قم بإجراء عزل SMG باتباع الخطوات أدناه.
ملاحظة: استخدم أدوات معقمة ، بما في ذلك مقص الأنسجة والنيكل المنفصل ، للجراحة.- افصل الغدة أحادية الجانب بعناية حتى لا تتلف الأوعية الدموية والأعصاب المحيطة تحت المجهر المجسم.
- بعد حقن متتبعات نفاذية الخلايا ، ضع الفئران بسرعة على الورق المقوى وضعها في وضع ضعيف مع تسجيل أطرافها ورؤوسها. ضع كريم إزالة الشعر على جلد الرقبة لإزالة شعر الماوس. استخدم 75٪ إيثانول لتطهير الجلد قبل الجراحة.
- ثم ، تحت المجهر المجسم ، قم بقطع بشرة الرقبة بمقص الأنسجة العام لفضح جانبي الرشاشات (تم علاج الغدة اليمنى في هذه التجربة). بعد ذلك ، استخدم نيكل فصل الأنسجة الحادة (انظر جدول المواد) لفصل الكبسولة برفق عن سطح الغدة ، مع الحرص على عدم إتلاف أنسجة الغدة والأوعية الدموية.
- افصل الكبسولة عن سطح الغدة دون الإضرار بالبنية الغدية. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من إنجاز العملية الكاملة لضبط النفس وفصل الغدة في غضون 10 دقائق.
- افصل الغدة أحادية الجانب بعناية حتى لا تتلف الأوعية الدموية والأعصاب المحيطة تحت المجهر المجسم.
2. إعداد مجهر ثنائي الفوتون
- قم بتوصيل الحامل المخصص بجهاز الضغط السلبي ، وتحقق مما إذا كان تأثير الضغط السلبي قد تحقق بشكل صحيح مسبقا.
ملاحظة: الحامل على شكل عدسة مكبرة مصغرة مع قطعة مسطحة من الزجاج المستدير في المنتصف (القطر: 4.32 مم ، الشكل 1). تم تصميم جهاز الضغط السلبي داخليا بحيث يتم توصيل الحامل بأنبوب مطاطي مرتبط بزجاجة تصريف ، ويتم توصيل الزجاجة بجهاز التحكم في الضغط السلبي من خلال أنبوب مطاطي قصير. بهذه الطريقة ، يمكن لوحدة التحكم في الضغط السلبي ضبط الضغط لضمان امتصاص الأنسجة في الحامل.- اربط جانبا واحدا من الحامل بجهاز الضغط السلبي. لاختبار ما إذا كان جهاز الضغط السلبي سليما ومناسبا ، اقلب الحامل رأسا على عقب ، وأضف قطرة ماء ، واضبط قيمة الضغط السلبي على 20 وحدة. إذا تم امتصاص الماء بالكامل وبسرعة ، يتم تثبيت جهاز الضغط السلبي بنجاح مع الحامل.
- ضع رشاش الماوس المكشوف برفق على الحامل المخصص ، وقم بامتصاص الأنسجة عن طريق شفط الضغط السلبي بعيدا عن جسم الماوس قدر الإمكان لتقليل آثار الحركة الناتجة عن التنفس والظروف الأخرى.
- تخيل مادة الدعم المرفقة بالغدة تحت هدف غمر الماء 25x / NA 1.0 (خاص ل NIR).
ملاحظة: استخدم مجهرا عموديا ثنائي الفوتون (انظر جدول المواد) في هذه التجربة. يجب أن تكون الأوعية الدموية مرئية على الفور مع مضان واضح بعد حقن التتبع.
3. تصوير السفن وكشف النفاذية
- ابدأ التصوير بعد وقت قصير من اختيار رؤية الغدة.
ملاحظة: عادة ما يتم التقاط السلاسل الزمنية من 45 إلى 50 صورة في 20 ثانية أو أكثر بشكل عام اعتمادا على التصميم التجريبي. - الحصول على صور متسلسلة على طول المحور Z ، متباعدة 2 ميكرومتر ، من سطح الغدة حتى 70-140 ميكرومتر في الأنسجة لتوليد بناء ثلاثي الأبعاد (3D).
- الحصول على تصوير الفاصل الزمني للأوعية لقياس نفاذية الأوعية الدموية في SMG.
ملاحظة: قم بتعيين شروط قائمة البرنامج على النحو التالي بعد تشغيل برنامج المجهر (انظر جدول المواد).- في مربع الحوار Explorer ، انقر فوق إضافة مجلد جديد وقم بتغيير اسم الملف.
- ارجع إلى عمود الاستحواذ . في XY ، التنسيق هو 512 × 512 ، والسرعة 400 هرتز. قم بتشغيل X ثنائي الاتجاه .
- اضبط عامل التكبير/التصغير على 0.75 و1.5 للتكبير/التصغير.
- للحصول على تصوير بفاصل زمني، حدد xyt ضمن وضع الاكتساب. اضبط المدة على 20 ثانية أو 30 دقيقة أو أكثر وفقا للحاجة التجريبية.
- لجعل البناء 3D ، اضبط وضع الاستحواذ على xyz. يمكن ضبط حجم Z-Step وفقا للوضع الفعلي.
- بعد ضبط الشروط ، انقر فوق Live لمراقبة تصوير الأوعية الدموية لقناتين وقنوات متداخلة في إطار تشكيل الصورة واختيار مجالات الاهتمام.
- انقر فوق ابدأ لبدء التصوير.
ملاحظة: يجب عدم ترك الماوس دون مراقبة أثناء عملية التصوير أثناء التخدير.
4. تحليل البيانات
- لتقييم نفاذية الوعاء ، استخدم برنامج Image J لحساب نسبة شدة التألق ل FD4 و RD70 بين الأوعية الخارجية والداخلية والإشارة إليها على أنها كثافة خارج الأوعية الدمويةوداخلها 4.
ملاحظة: يعكس تغيير نفاذية الأوعية الدموية من خلال تتبع نقل الدكسترانس التغيير في وظيفة الحاجز البطاني. علاوة على ذلك ، راقب مورفولوجيا الأوعية الدموية وكثافتها عن طريق حساب قطر وعدد تغيرات الأوعية.- قم بتشغيل برنامج Image J (انظر جدول المواد).
- انقر فوق ملف وحدد فتح لفتح صور الأوعية الدموية الملتقطة تحت المجهر ثنائي الفوتون.
- حدد صورة واضبط النوع على 16 بت لتحويل تنسيق الصورة.
- حدد تحليل وحدد المنطقة ، المتوسط ، IntDen ضمن تعيين القياسات. انقر فوق "موافق " للتأكيد.
- ضمن تحليل، حدد أدوات، وافتح مدير عائد الاستثمار، وحدد إظهار الكل والتسميات.
- قياس قيمة شدة التألق داخل الأوعية: انقر فوق أداة lasso على الواجهة الرئيسية لرسم الخطوط العريضة للأوعية الدموية. انقر فوق إضافة في مدير عائد الاستثمار. اتبع هذه الخطوة لمتابعة تحديد سفن متعددة. حدد جميع كائنات مدير عائد الاستثمار وانقر فوق قياس.
- قم بقياس إجمالي قيمة شدة التألق: حدد الصورة بأكملها ، وانقر فوق قياس ، والنتيجة هي إجمالي قيمة كثافة التألق للصورة.
- احسب قيمة شدة التألق خارج الأوعية الدموية. انسخ البيانات إلى Excel للحساب. نسبة شدة التألق خارج الأوعية = (1 - قيمة شدة التألق داخل الأوعية / إجمالي قيمة شدة التألق) × 100٪.
5. تطبيقات المصب
- أثناء التجربة ، احسب معدل تدفق الدم عن طريق قياس المسافة التي تمر بها خلية حمراء (تظهر كنقطة سوداء تحت المجهر ثنائي الفوتون)4 في فترة زمنية.
- لتصور حركة خلايا الدم عبر الخلايا البطانية، قم بتسمية خلايا الدم بالتألق. بعد ذلك ، قم بحقن الخلايا الموسومة بالتألق ب FD4 أو RD70 عبر الوريد الخلفي للفأر. بعد الدوران لمدة 5 دقائق ، تتبع الخلايا المهتمة لفترة.
ملاحظة: تم نقل ما مجموعه 2 × 106 CFSE (كربوكسي فلوريسئين سكسينيميديل استر ، صبغة فلورية منفذة للغشاء) - الخلايا الليمفاوية المشتقة من طحال الفئران المانحة إلى المتلقين عن طريق حقن الوريد الذيل ، وتم التحقيق في تسلل الخلايا الليمفاوية إلى SMGs في نماذج حيوانات التجارب4.
6. رعاية الحيوان واستعادته
- اعتني جيدا بالحيوانات طوال التجربة.
ملاحظة: تأكد من أن الحيوان الذي خضع لعملية جراحية لا يتم إعادته إلى صحبة الحيوانات الأخرى حتى يتعافى تماما أثناء التجربة. - لا تترك الحيوان دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي.
ملاحظة: راقب حالة تنفس الفئران باستمرار واحتفظ بها دافئة عن طريق وضعها على وسادة تدفئة الحيوانات. توفير السكن وتسكين الألم بعد الجراحة ، على النحو الموصى به من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد البروتوكول ، تم إرفاق SMG من جانب واحد بحامل مصنوع خصيصا ، وتم إبقاء الغدة بعيدا عن جسم الفأر قدر الإمكان لمنع التنفس من التسبب في قطع أثرية للحركة. لوحظ التدفق السريع لخلايا الدم الحمراء (النقاط السوداء) في الأوعية الدموية تحت المجهر. بعد العثور على حقل الأنسجة تحت عدسة العين ، يجب على المرء التبديل لمعالجة برنامج المجهر. في المجموعة الضابطة ، كان كل من المتتبعين موجودين في الأوعية الدموية للفأر SMG. على وجه الخصوص ، نظرا لوزنه الجزيئي الصغير ، كان FD4 قادرا على التسرب من الأوعية الدموية إلى الجوانب القاعدية للأسيني والقنوات ، وبالتالي يصور بوضوح شكل الأسيني والقنوات (كما يشير A و D في الشكل 2A). على النقيض من ذلك ، لم يستطع dextrans ذو الأوزان الجزيئية الأعلى ، مثل 40 كيلو دالتون و 70 كيلو دالتون ، التمييز بين مورفولوجيا SMG. في الواقع ، تم توزيع RD70 بشكل سائد في الأوعية الدموية الكبيرة الحجم والأوعية الدقيقة. في مجموعة ربط القناة ، تم نقل كل من FD4 و RD70 إلى الجوانب القاعدية للأسيني ، مما يشير إلى أن ربط القناة يمكن أن يعطل وظيفة الحاجز البطاني ثم يزيد من نفاذية الجزيئات الكبيرة. كما أكدت نتائج شدة التألق شبه الكمية FD4 و RD70 الظواهر المذكورة أعلاه (الشكل 2 ب). إلى جانب ذلك ، تم زيادة قطر الأوعية الدموية ، مما يشير إلى أن ربط القناة لمدة 1 يوم الناجم عن تمدد الأوعية الدموية. علاوة على ذلك ، أظهرت الصور ثلاثية الأبعاد مضان أكثر غموضا ل FD4 و RD70 حول الأوعية الدموية في مجموعة الربط (الشكل 2C).
الشكل 1: رسم تخطيطي يوضح الحامل المخصص. الحامل على شكل عدسة مكبرة مصغرة مع قطعة مسطحة من الزجاج المستدير في الوسط (القطر: 4.32 مم). يتم توصيل جانب واحد من الحامل بجهاز الضغط السلبي لامتصاص الأنسجة تحت الزجاج ، بينما الجانب الآخر من الحامل ميت. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مقايسة نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي والصور ثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية في الغدد تحت الفك السفلي للفئران (SMGs). تم تقسيم الفئران إلى مجموعات تحكم وربط القنوات. تم الكشف عن الغدد أحادية الجانب في كلا المجموعتين ومراقبتها. (أ) تم إجراء اختبار نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي عن طريق حقن 4 كيلو دالتون من ديكستران المسمى FITC (FD4) و 70 كيلو دالتون من رودامين ب المسمى ديكستران (RD70) في الوريد الزاوي. تشير رؤوس الأسهم إلى التغييرات في توزيع المتتبعات في SMG. أ ، أسيني. د ، القناة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (B) بالنسبة للتحليل شبه الكمي للصور المذكورة أعلاه ، تم قياس شدة التألق ، بما في ذلك FD4 و RD70 داخل الأوعية الدموية (داخل الأوعية الدموية) والأوعية الدموية الخارجية (خارج الأوعية الدموية) ، بواسطة برنامج Image J. (ج) صور 3D للأوعية الدموية والأوعية الدقيقة في SMG. تشير رؤوس الأسهم إلى التغييرات في توزيع المتتبعات في SMG. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعد صيانة وظيفة الحاجز البطاني وتنظيمها ضرورية للتوازن الوعائي. تلعب الخلايا البطانية وتقاطعاتها بين الخلايا دورا مهما في الحفاظ على سلامة الأوعية الدموية والتحكم فيها12. يمكن أن تسبب قوة القص لتدفق الدم وعوامل النمو والعوامل الالتهابية تغيرات في نفاذية الأوعية الدموية ، وبالتالي تشارك في حدوث وتطور الأمراض الجهازية مثل ارتفاع ضغط الدم والسكري وأمراض المناعة الذاتية13،14،15. يعد توزيع الأوعية الدموية وتدفق الدم في الغدة اللعابية من أكثر الأنواع وفرة في جميع الأعضاء والأنسجة ، ولكن لم يتم إجراء البحوث على نظام الأوعية الدموية في الغدة اللعابية على نطاق واسع. إن الفهم الأعمق والأكثر شمولا للأوعية الدموية للغدد اللعابية، وخاصة وظيفة الحاجز البطاني، سيوفر أدلة جديدة على آلية إفراز اللعاب ويعزز أبحاث بيولوجيا الأوعية الدموية.
يمكن لتقنية الفحص المجهري بالليزر ثنائي الفوتون في الجسم الحي تحديد نفاذية الأوعية الدموية عن طريق الحقن في الوريد لصبغة الفلورسنت دون التضحية بالحيوان. يمكن ل dextrans المسمى بالتألق مع كريات مجهرية ذات أوزان أو أحجام جزيئية مختلفة تقييم مدى الإصابة البطانية بشكل أفضل. وفي الوقت نفسه ، يتم تحديد الحركية الديناميكية لنفاذية الأوعية الدموية في الوقت الفعلي باستخدام نظام التقييم الداخلي لنفاذية الأوعية الدموية. ميزة أخرى هي أنه من السهل التمييز بين أنواع الأوعية الدموية ، مثل الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية16. علاوة على ذلك ، فإن تدمير الحاجز البطاني الوعائي وهجرة الخلايا المناعية مرتبطان حتما بالالتهاب ، ولكن هناك العديد من الدراسات التي تبحث في عامل واحد ، وقد ركزت دراسات قليلة فقط على العلاقة بين كلا الجانبين17,18. أنشأ Uhl et al. مؤخرا طريقة بحث لتحليل دور العوامل المسببة للأمراض المختلفة في أمراض الغدد اللعابية عن طريق حقن dextrans المسمى بالتألق والأجسام المضادة الخاصة بالخلايا المناعية مع علامات فلورية مختلفة في وقت واحد في الجسم الحي19. هنا ، يمكن أيضا تتبع الخلايا المناعية الموسومة بالتألق من خلال حقن الوريد الذيل لاستكشاف التسبب في نموذج العمل الحالي. لذلك ، قد توفر الطريقة التجريبية الحالية نظاما فريدا لدراسة التفاعل بين تسرب الكريات البيض وسلامة الحاجز البطاني في النماذج الحيوانية لمرض SMG في الجسم الحي.
ومع ذلك ، يجب عدم تجاهل أن استجابة الفئران للتخدير مختلفة ، وكلما طالت مدة التصوير ، زاد وقت التخدير اللازم ، وزادت صعوبة تعافي الفئران. لذلك ، يتم استخدام هذه التجربة بشكل أفضل للتحقيق عندما لا تكون هناك حاجة إلى تجارب لاحقة في الجسم الحي بعد التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، هناك قيد آخر هو أن هذه التقنية ليست مناسبة للتجارب ذات الفترة الزمنية الطويلة. Dextrans قابلة للذوبان في الماء وسهلة الأيض ، مما يؤدي إلى ضعف التألق مع وقت تصوير أطول ، وبالتالي ، من الأفضل الحفاظ على وقت التصوير في غضون 30 دقيقة.
إجمالا ، تركز الدراسة على تغلغل متتبعات نفاذية الخلايا والخلايا من الأوعية الدموية والأوعية الدقيقة إلى الأنسجة الغدية ، وقد أنشأت بدقة الفحص المجهري الديناميكي ثنائي الفوتون المعزز بالتباين كطريقة متقدمة لقياس نفاذية الأوعية الدموية لتقييم وظيفة الحاجز البطاني في رشاش الفأر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنح 31972908 و 81991500 و 81991502 و 81771093 و 81974151) ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (منحة 7202082).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
References
- Carpenter, G. H. The secretion, components, and properties of saliva. Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).
- Garrett, J. R. The proper role of nerves in salivary secretion: A review. Journal of Dental Research. 66 (2), 387-397 (1987).
- Berndt, P., et al. Tight junction proteins at the blood-brain barrier: Far more than claudin-5. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (10), 1987-2002 (2019).
- Cong, X., et al. Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren's syndrome. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1864 (10), 3154-3163 (2018).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents. Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of Cell Biology. 134 (4), 1031-1049 (1996).
- Enis, D. R., et al. Induction, differentiation, and remodeling of blood vessels after transplantation of Bcl-2-transduced endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (2), 425-430 (2005).
- Wang, X., et al. Application of digital subtraction angiography in canine hindlimb arteriography. Vascular. 30 (3), 474-480 (2022).
- Trani, M., Dejana, E. New insights in the control of vascular permeability: vascular endothelial-cadherin and other players. Current Opinion in Hematology. 22 (3), 267-272 (2015).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertension Research. 31 (5), 873-879 (2008).
- Scheppke, L., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. The Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 leads to exacerbated autoimmune arthritis through increased vascular permeability. Journal of Immunology. 184 (3), 1292-1299 (2010).
- Egawa, G., Ono, S., Kabashima, K. Intravital Imaging of vascular permeability by two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 2223, 151-157 (2021).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Schulte, D., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. The EMBO Journal. 30 (20), 4157-4170 (2011).
- Uhl, B., et al. A novel experimental approach for in vivo analyses of the salivary gland microvasculature. Frontiers in Immunology. 11, 604470 (2020).
