Summary
Bu protokolde, submandibuler bezin (SMG) endotel bariyer fonksiyonu, iki fotonlu lazer taramalı mikroskop altında test hayvanı modellerinin açısal damarlarına in vivo olarak farklı moleküler ağırlıklı floresan izleyiciler enjekte edilerek değerlendirilmiştir.
Abstract
Tükürük ağız ve genel sağlıkta önemli bir rol oynar. Kan damarlarının sağlam endotel bariyer fonksiyonu tükürük sekresyonunu sağlarken, endotel bariyer disfonksiyonu birçok tükürük bezi salgı bozukluğu ile ilişkilidir. Bu protokol, fare submandibuler bezlerinde (SMG) endotel sıkı kavşakların (TJ'ler) işlevini değerlendirmek için bir in vivo parasellüler geçirgenlik tespit yöntemini tanımlamaktadır. İlk olarak, farelerin açısal damarlarına farklı moleküler ağırlıklara (4 kDa, 40 kDa veya 70 kDa) sahip floresan etiketli dekstrans enjekte edildi. Daha sonra, tek taraflı SMG diseke edildi ve iki fotonlu lazer tarama mikroskobu altında özelleştirilmiş tutucuya sabitlendi ve daha sonra kan damarları, acini ve kanallar için görüntüler yakalandı. Bu yöntem kullanılarak, farklı büyüklükteki izleyicilerin kan damarlarından acini'nin bazal taraflarına ve hatta asinar epitelinin üzerinden kanallara gerçek zamanlı dinamik sızıntısı, fizyolojik veya patofizyolojik koşullar altında endotel bariyer fonksiyonunun değişimini değerlendirmek için izlendi.
Introduction
Çeşitli tükürük bezleri, öncelikle enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattı görevi gören ve sindirime yardımcı olan tükürük üretir, böylece ağız ve genel sağlıkta önemli bir rol oynar1. Kan akışı, tükürük bezi sekresyonu için çok önemlidir, çünkü sürekli olarak birincil tükürüğü oluşturan su, elektrolitler ve moleküller sağlar. Sıkı bağlantı (TJ) kompleksi tarafından düzenlenen endotel bariyer fonksiyonu, suya, çözünürlere, proteinlere ve hatta dolaşımdaki kan damarlarından tükürük bezi dokularına doğru hareket eden hücrelere oldukça geçirgen olan kılcal damarların geçirgenliğini kesin ve hassas bir şekilde sınırlar 2,3. Daha önce kolinerjik bir uyarana yanıt olarak endotel TJ'lerinin açılmasının tükürük sekresyonunu kolaylaştırdığını, oysa endotel bariyer fonksiyonunun bozulmasının Sjögren sendromunda submandibuler bezlerde (SMG'ler) hiposekresyon ve lenfositik infiltrasyon ile bağlantılı olduğunu bulmuştuk4. Bu veriler, çeşitli tükürük bezi hastalıkları ile ilgili endotel bariyer fonksiyonunun katkısına yeterince dikkat edilmesi gerektiğini göstermektedir.
İki fotonlu lazer taramalı mikroskop, bozulmamış dokudaki hücrelerin dinamiklerini in vivo olarak gözlemlemek için güçlü bir araçtır. Bu tekniğin avantajlarından biri, yakın kızılötesi ışığın (NIR), numuneler NIR tarafından uyarıldığında görünür veya ultraviyole ışıktan daha derin doku penetrasyonuna sahip olması ve uygun koşullar altında dokularda belirgin ışık hasarına neden olmamasıdır 5,6. Gerçekten de, tükürük bezleri, yüzey asinar hücrelerinin bez yüzeyinden 7,8 ila 30 μm uzaklıkta olduğu çok homojen ve yüzeysel bir dokudur. İntravital konfokal mikroskopinin, canlı fare tükürük bezlerinde ekzokrin sekresyonu ve aktin sitoiskeletini hücrealtı çözünürlükte 8'de inceleyebileceği gösterilmiştir. Bununla birlikte, iki fotonlu lazer taramalı mikroskopi, sadece geleneksel konfokal mikroskopinin avantajına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda daha derin doku ve görüntüyü daha net bir şekilde tespit etmek için de kullanılabilir. Burada, sıklıkla parasellüler geçirgenlik izleyicileri olarak kullanılan ve farklı boyutlarda avantaja sahip olan floresan etiketli dekstrans, TJ gözenek9'un büyüklüğünü test etmek için kullanılabilir. Bu çalışmada, fare SMG'lerinde endotel bariyer fonksiyonunun yerinde değerlendirilmesi için intravital gerçek zamanlı iki foton lazer taramalı mikroskopi tekniği oluşturulmuştur. Fare SMG'lerinde in vivo vasküler geçirgenlik tespiti için her çalışma adımı mevcut protokolde açıklanmıştır. İşte fare SMG kanal ligasyon modelinde endotel bariyer fonksiyonunu tespit etme örneği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler Pekin Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi, Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (NIH Yayın No. 85-23, gözden geçirilmiş 1996) uyulmuştur. Bu çalışmada 8-10 haftalık yaş grubundaki erkek vahşi tip (WT) fareler kullanılmıştır. Deney hayvanları, ağrılarını ve rahatsızlıklarını en aza indirmek için dikkatlice tedavi edildi.
1. Hayvan prosedürleri
- Anestezik ve izleyicileri hazırlayın ve uygulayın.
- Çalışma boyunca steril koşulları koruyun ve otoklavlama ile aletleri sterilize edin. Fareleri iki gruba ayırın.
NOT: Kontrol grubu tedavi edilmeden bırakıldı ve 1 gün boyunca tek taraflı SMG kanal ligasyonu olan diğer grup deney grubu olarak görev yaptı. Gruplama yaparken, ağırlık ve yaşın vasküler geçirgenlik üzerindeki etkisini azaltmak için benzer vücut ağırlığına ve yaşına sahip farelerin seçilmesi gerekir. - Floresein izotiyosiyanat (FITC) etiketli dekstran (moleküler ağırlık: 4 kDa; FD4) ve rodamin B etiketli dekstran (moleküler ağırlık: 70 kDa; RD70) (bkz. Malzeme Tablosu) geçirgenlik testi için floresan sinyalleri arasındaki paraziti en aza indirmek için farklı uyarma/emisyon spektrumlarına sahiptir (sırasıyla FITC veya rodamin B filtresini kullanarak).
NOT: FD4 ve RD70'in uyarma dalga boyları sırasıyla 488 nm ve 594 nm'dir ve seçilen emisyon dalga boyları sırasıyla 511-564 nm ve 617-669 nm'dir. - İzleyicileri steril fosfat tamponlu salin (1x PBS) içinde 100 mg / mL stoklara seyreltin ve ışıktan korunan alikotları -20 ° C'de saklayın.
NOT: 4 kDa gibi moleküler ağırlığa sahip Dextran, patolojik durumlar olmadan bile fare SMG'lerinde kandan hızla sızacaktır10. - Fareleri anestezik hale getirmek için intraperitoneal olarak tribromoetanol enjekte edin (25 g'lık bir fare için doz yaklaşık 600 μL idi). Yerel hayvan etik komitesi tarafından önerilen analjezi sağlayın.
NOT: Anestezi indüksiyonundan sonra, kuruluğu önlemek için gözlerde veteriner merhem kullanın. Hayvanlara iyi bak11. Farenin mekanik stimülasyonu tolere etmesini bekleyin, örneğin motor tepkisi olmadan ayak parmağı sıkışması. - Farklı moleküler ağırlıklara (FD4 ve RD70) sahip iki parasellüler geçirgenlik izleyicisinin bir karışımını açısal damara (0.5 mg / g vücut ağırlığı) enjekte edin. Her fareye 100 μL'lik bir izleyici çözeltisi karışımı enjekte edin, her boyanın 50 μL'si 1:1 oranında karıştırılır.
- Anesteziden sonra, göz küresinin bir tarafının hafifçe çıkıntı yapmasını sağlamak için farenin başını ve boynunu yavaşça tutun. Gözün köşesi boyunca floresan izleyiciler içeren bir insülin şırıngası yerleştirin (şırıngaya herhangi bir hava sokmamaya dikkat edin) göze dik açıyla yerleştirin.
NOT: Açısal damar doğru yerleştirilirse, boya çözeltisi damar içine kolayca enjekte edilecek ve enjeksiyon sırasında direnç olmayacaktır. Ek olarak, farelerde kuyruk damarı enjeksiyonu da intravenöz izleyici molekülleri için bir aday olabilir.
- Anesteziden sonra, göz küresinin bir tarafının hafifçe çıkıntı yapmasını sağlamak için farenin başını ve boynunu yavaşça tutun. Gözün köşesi boyunca floresan izleyiciler içeren bir insülin şırıngası yerleştirin (şırıngaya herhangi bir hava sokmamaya dikkat edin) göze dik açıyla yerleştirin.
- Çalışma boyunca steril koşulları koruyun ve otoklavlama ile aletleri sterilize edin. Fareleri iki gruba ayırın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek SMG yalıtımını gerçekleştirin.
NOT: Ameliyat için doku makası ve ayırma nikelleri dahil olmak üzere steril aletler kullanın.- Stereoskopik mikroskop altında çevredeki kan damarlarına ve sinirlere zarar vermemek için tek taraflı bir bezi dikkatlice ayırın.
- Parasellüler geçirgenlik izleyicilerinin enjeksiyonundan sonra, fareleri hızlı bir şekilde kartonun üzerine koyun ve uzuvları ve kafaları bantlanmış olarak sırtüstü pozisyona yerleştirin. Farenin kıllarını çıkarmak için boyun derisine epilasyon kremi uygulayın. Ameliyattan önce cildi dezenfekte etmek için% 75 etanol kullanın.
- Daha sonra, bir stereomikroskop altında, SMG'lerin her iki tarafını da ortaya çıkarmak için boynun epidermisini genel doku makası ile kesin (bu deneyde sağ bez tedavi edildi). Daha sonra, kapsülü bez yüzeyinden nazikçe ayırmak için künt bir doku ayırma nikeli kullanın (bkz.
- Kapsülü, glandüler yapıya zarar vermeden bez yüzeyinden ayırın. Ek olarak, tüm fare kısıtlama ve bez ayırma işleminin 10 dakika içinde tamamlandığından emin olun.
- Stereoskopik mikroskop altında çevredeki kan damarlarına ve sinirlere zarar vermemek için tek taraflı bir bezi dikkatlice ayırın.
2. İki foton mikroskobu kurulumu
- Özelleştirilmiş tutucuyu negatif basınç cihazına bağlayın ve negatif basınç etkisinin önceden uygun şekilde elde edilip edilmediğini kontrol edin.
NOT: Tutucu, ortasında düz bir yuvarlak cam parçası bulunan minyatür bir büyüteç şeklindedir (çap: 4,32 mm, Şekil 1). Negatif basınç cihazı, tutucunun bir drenaj şişesine bağlı bir lastik tüpe bağlanacağı ve şişenin negatif basınç kontrolörüne kısa bir lastik tüp ile bağlanacağı şekilde şirket içinde tasarlanmıştır. Bu şekilde, negatif basınç kontrolörü, dokunun tutucuya emilmesini sağlamak için basıncı ayarlayabilir.- Tutucunun bir tarafını negatif basınç cihazına bağlayın. Negatif basınç cihazının sağlam ve uygun olup olmadığını test etmek için, tutucuyu baş aşağı çevirin, bir damla su ekleyin ve negatif basınç değerini 20 birime ayarlayın. Su tamamen ve hızlı bir şekilde emilirse, negatif basınç cihazı tutucu ile başarıyla monte edilir.
- Farenin açıkta kalan SMG'sini özelleştirilmiş tutucuya yavaşça yerleştirin ve solunum ve diğer koşulların neden olduğu hareket artefaktlarını azaltmak için negatif basınçlı emme ile dokuyu fare gövdesinden mümkün olduğunca uzağa emer.
- Beze tutturulmuş destek malzemesini 25x/NA 1.0 suya daldırma hedefi (NIR için özel) altında görüntüleyin.
NOT: Bu deneyde dik iki fotonlu mikroskop kullanın (bkz. Kan damarları, izleyici enjeksiyonundan sonra belirgin floresan ile hemen görülebilmelidir.
3. Damar görüntüleme ve geçirgenlik tespiti
- Bezin görüşü seçildikten kısa bir süre sonra görüntülemeye başlayın.
NOT: Tipik olarak, deneysel tasarıma bağlı olarak genellikle 20 s veya daha uzun 45-50 görüntüden oluşan zaman serileri yakalanır. - Üç boyutlu (3B) bir yapı oluşturmak için bezin yüzeyinden dokuya 70-140 μm'ye kadar 2 μm aralıklarla basılmış Z ekseni boyunca sıralı görüntüler elde edin.
- SMG'de vasküler geçirgenliği ölçmek için damarların hızlandırılmış görüntülemesini elde edin.
NOT: Mikroskop yazılımını çalıştırdıktan sonra program menüsünün koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın (bkz.- Explorer iletişim kutusunda, Yeni Klasör Ekle'ye tıklayın ve dosya adını değiştirin.
- Edinme sütununa geri dönün. XY'de, biçim 512 x 512 ve hız 400 Hz'dir. Çift yönlü X'i açın.
- Yakınlaştırma için Yakınlaştırma faktörünü 0,75 ve 1,5 olarak ayarlayın.
- Hızlandırılmış görüntüleme elde etmek için, Edinme Modu altında xyt'yi seçin. Deneysel ihtiyaca göre Süreyi 20 sn, 30 dakika veya daha uzun olarak ayarlayın.
- 3B yapıyı yapmak için Edinme Modu'nu xyz olarak ayarlayın. Z-Step boyutu gerçek duruma göre ayarlanabilir.
- Koşulları ayarladıktan sonra, fotoğraf oluşturan çerçevedeki iki kanalın ve üst üste binen kanalların vasküler görüntülemesini gözlemlemek ve ilgi alanlarını seçmek için Canlı üzerine tıklayın.
- Görüntülemeye başlamak için Başlat'a tıklayın.
NOT: Anestezi altındayken görüntüleme işlemi sırasında fare gözetimsiz bırakılmamalıdır.
4. Veri analizi
- Damar geçirgenliğini değerlendirmek için, FD4 ve RD70'in dış ve iç damarlar arasındaki floresan yoğunluk oranını hesaplamak ve bunları ekstra ve intravasküler yoğunluk4 olarak belirtmek için Image J yazılımını kullanın.
NOT: Dekstransın taşınımını izleyerek vasküler geçirgenliğin değişmesi, endotel bariyer fonksiyonundaki değişimi yansıtır. Ayrıca, damar değişikliklerinin çapını ve sayısını hesaplayarak vasküler morfolojiyi ve yoğunluğu gözlemleyin.- Image J yazılımını çalıştırın (bkz.
- Dosya'ya tıklayın ve iki foton mikroskobu altında yakalanan kan damarı görüntülerini açmak için Aç'ı seçin.
- Görüntü öğesini seçin ve görüntü biçimini dönüştürmek için Tür'ü 16 bit olarak ayarlayın.
- Analiz Et'i seçin ve Ölçümleri Ayarla altında Alan, Ortalama, IntDen'i seçin. Onaylamak için Tamam'a tıklayın.
- Analiz altında, Araçlar'ı seçin, YG Yöneticisi'ni açın ve Tümünü ve Etiketleri Göster'i seçin.
- İntravasküler floresan yoğunluk değerini ölçün: kan damarının ana hatlarını çizmek için ana arayüzdeki kement aracına tıklayın. Yatırım getirisi Yöneticisi'nde Ekle'ye tıklayın. Birden fazla gemi seçmeye devam etmek için bu adımı izleyin. YG Yöneticisi'nin tüm nesnelerini seçin ve Ölç'e tıklayın.
- Toplam floresan yoğunluğu değerini ölçün: Tüm görüntüyü ana hatlarıyla belirtin, Ölç'ü tıklayın ve sonuç görüntünün toplam floresan yoğunluğu değeridir.
- Ekstravasküler floresan yoğunluk değerini hesaplayın. Verileri hesaplama için Excel'e kopyalayın. Ekstravasküler floresan yoğunluk oranı = (1 − intravasküler floresan yoğunluk değeri/toplam floresan yoğunluk değeri) %100 ×.
5. Aşağı akış uygulamaları
- Deney sırasında, kırmızı bir hücrenin (iki foton mikroskobu altında siyah bir nokta olarak gösterilir)4 bir zaman diliminde maruz kaldığı mesafeyi ölçerek kan akış hızını hesaplayın.
- Kan hücrelerinin endotel hücreleri arasındaki hareketini görselleştirmek için, kan hücrelerini floresan ile etiketleyin. Ardından, floresan etiketli hücrelere fare kuyruğu damarı üzerinden FD4 veya RD70 enjekte edin. 5 dakika dolaştıktan sonra, ilgilenen hücreleri bir süre boyunca izleyin.
NOT: Donör farelerin dalağından elde edilen toplam 2 x 106 CFSE (karboksifloresein süksinimidil ester, membran geçirgen floresan boya) etiketli lenfositler kuyruk damarı enjeksiyonu ile alıcılara aktarılmış ve deneysel hayvan modellerinde lenfositlerin SMG'lere infiltrasyonu araştırılmıştır4.
6. Hayvan bakımı ve iyileşmesi
- Deney boyunca hayvanlara iyi bakın.
NOT: Ameliyat edilen hayvanın, deney sırasında tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade edilmediğinden emin olun. - Yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın.
NOT: Farelerin solunum durumunu sürekli gözlemleyin ve hayvan ısıtma yastığına koyarak sıcak tutun. Yerel hayvan etik komitesi tarafından önerildiği gibi cerrahi sonrası ağrı iyileşme konutu ve analjezi sağlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolü takiben, tek taraflı SMG ısmarlama bir tutucuya bağlandı ve bez, nefes almanın hareket artefaktlarına neden olmasını önlemek için fare gövdesinden mümkün olduğunca uzak tutuldu. Kan damarlarındaki kırmızı kan hücrelerinin (siyah noktalar) hızlı akışı mikroskop altında gözlendi. Bir oküler lens altında doku alanını bulduktan sonra, mikroskop yazılımını manipüle etmek için geçiş yapılmalıdır. Kontrol grubunda, her iki izleyici de fare SMG'sinin kan damarlarında mevcuttu. Özellikle, küçük moleküler ağırlığı nedeniyle, FD4 kan damarlarından acini ve kanalların bazal taraflarına sızabilmiş, böylece acini ve kanalların şeklini açıkça tasvir etmiştir ( A ve D'nin Şekil 2A'da işaret ettiği gibi). Buna karşılık, 40 kDa ve 70 kDa gibi daha yüksek moleküler ağırlıklara sahip dextrans, SMG morfolojisini ayırt edemedi. Gerçekten de, RD70 baskın olarak büyük boyutlu kan damarlarında ve mikrodamarlarda dağıtılmıştır. Kanal ligasyon grubunda, hem FD4 hem de RD70, aksinin bazal taraflarına ekstravaze edildi, bu da kanal ligasyonunun endotel bariyer fonksiyonunu bozabileceğini ve daha sonra büyük moleküllere geçirgenliği artırabileceğini gösterdi. Yarı kantitatif FD4 ve RD70 floresan yoğunluğu sonuçları da yukarıdaki fenomeni doğrulamıştır (Şekil 2B). Ayrıca, kan damarlarının çapı arttırıldı, bu da 1 gün boyunca kanal ligasyonunun kan damarlarının genişlemesine neden olduğunu gösterdi. Ayrıca, 3D görüntüler, ligasyon grubundaki kan damarları etrafında FD4 ve RD70'in çok daha belirsiz floresansını gösterdi (Şekil 2C).
Şekil 1: Özelleştirilmiş tutucuyu gösteren şematik bir diyagram. Tutucu, merkezinde düz bir yuvarlak cam parçası bulunan minyatür bir büyüteç şeklindedir (çap: 4.32 mm). Tutucunun bir tarafı, camın altındaki dokuları emmek için negatif basınç cihazına bağlanırken, tutucunun diğer tarafı ölmüştür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: In vivo vasküler geçirgenlik testi ve farelerde submandibuler bezlerde (SMG'ler) kan damarlarının 3D görüntüleri. Fareler kontrol ve kanal ligasyon gruplarına ayrıldı. Her iki gruptaki tek taraflı bezler açığa çıkarıldı ve gözlendi. (A) İn vivo vasküler geçirgenlik testi, açısal ven içine 4 kDa FITC etiketli dekstran (FD4) ve 70 kDa rodamin B etiketli dekstran (RD70) enjekte edilerek yapıldı. Ok uçları, SMG'deki izleyicilerin dağılımındaki değişiklikleri gösterir. A, acini. D, kanal. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Yukarıdaki görüntülerin yarı nicelleştirme analizi için, kan damarları (intravasküler) ve dış kan damarları (ekstravasküler) içindeki FD4 ve RD70 dahil olmak üzere floresan yoğunluğu, Image J yazılımı ile ölçülmüştür. (C) SMG'deki kan damarlarının ve mikrodamarların 3D görüntüleri. Ok uçları, SMG'deki izleyicilerin dağılımındaki değişiklikleri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endotel bariyer fonksiyonunun idamesi ve düzenlenmesi vasküler homeostaz için gereklidir. Endotel hücreleri ve bunların hücreler arası kavşakları, vasküler bütünlüğün korunmasında ve kontrol edilmesinde kritik bir rol oynamaktadır12. Kan akımının kayma kuvveti, büyüme faktörleri ve inflamatuar faktörler vasküler geçirgenlikte değişikliklere neden olabilir ve böylece hipertansiyon, diyabet ve otoimmün hastalıklar gibi sistemik hastalıkların ortaya çıkmasına ve gelişmesine katkıda bulunabilir13,14,15. Tükürük bezinin vasküler dağılımı ve kan akışı, tüm organ ve dokularda en bol bulunanlardan biridir, ancak tükürük bezinin vasküler sistemi üzerine araştırmalar yaygın olarak yapılmamıştır. Tükürük bezi kan damarlarının, özellikle endotel bariyer fonksiyonunun daha derin ve daha kapsamlı bir şekilde anlaşılması, tükürük sekresyonunun mekanizmasına yeni ipuçları sağlayacak ve vasküler biyoloji araştırmalarını teşvik edecektir.
İn vivo iki fotonlu lazer taramalı mikroskopi tekniği, hayvanı feda etmeden intravenöz floresan boya enjeksiyonu ile vasküler geçirgenliği ölçebilir. Farklı moleküler ağırlıklarda veya boyutlarda mikrosferlere sahip floresan etiketli dekstrans, endotel hasarının derecesini daha iyi değerlendirebilir. Bu arada, vasküler geçirgenliğin dinamik kinetiği, vasküler geçirgenliğin intravital değerlendirme sistemi kullanılarak gerçek zamanlı olarak belirlenir. Diğer bir avantaj, arterioller, venüller ve kılcal damarlar gibi kan damarlarının tiplerini ayırt etmenin kolay olmasıdır16. Ayrıca, vasküler endotel bariyerinin yıkımı ve bağışıklık hücrelerinin göçü kaçınılmaz olarak inflamasyonla bağlantılıdır, ancak tek bir faktörü araştıran birçok çalışma vardır ve sadece birkaç çalışma her iki yön arasındaki bağlantıya odaklanmıştır17,18. Uhl ve ark. yakın zamanda tükürük bezi hastalıklarında farklı patojenik faktörlerin rolünü analiz etmek için floresan etiketli dekstrans ve immün hücreye özgü antikorları aynı anda in vivo19 floresan belirteçlerle enjekte ederek bir araştırma yöntemi oluşturmuşlardır. Burada, floresan etiketli bağışıklık hücreleri, mevcut çalışma modelinde patogenezi araştırmak için kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla da izlenebilir. Bu nedenle, mevcut deneysel yöntem, SMG hastalığı hayvan modellerinde lökosit ekstravazasyonu ile endotel bariyer bütünlüğü arasındaki etkileşimi in vivo olarak incelemek için benzersiz bir sistem sağlayabilir.
Bununla birlikte, farelerin anesteziklere duyarlılığının farklı olduğu ve görüntüleme süresi ne kadar uzun sürerse, anestezi süresinin o kadar uzun olduğu ve farelerin iyileşmesinin o kadar zor olduğu göz ardı edilmemelidir. Bu nedenle, bu deney, görüntülemeden sonra sonraki in vivo deneylerin gerekli olmadığını araştırmak için daha iyi kullanılır. Ek olarak, başka bir sınırlama, bu tekniğin uzun bir zaman aralığına sahip deneyler için uygun olmamasıdır. Dekstranlar suda çözünür ve metabolize edilmesi kolaydır, bu da daha uzun bir görüntüleme süresiyle daha zayıf floresan ile sonuçlanır ve bu nedenle görüntüleme süresini 30 dakika içinde korumak daha iyidir.
Toplamda, çalışma, parasellüler geçirgenlik izleyicilerinin ve hücrelerin kan damarlarından ve mikrodamarlardan glandüler dokulara nüfuz etmesine odaklanmaktadır ve fare SMG'sinde endotel bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için vasküler geçirgenliği ölçmek için gelişmiş bir yöntem olarak kontrast artırılmış intravital dinamik iki foton lazer taramalı mikroskopiyi titizlikle kurmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibeler 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 ve 81974151) ve Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (hibe 7202082) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
References
- Carpenter, G. H. The secretion, components, and properties of saliva. Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).
- Garrett, J. R. The proper role of nerves in salivary secretion: A review. Journal of Dental Research. 66 (2), 387-397 (1987).
- Berndt, P., et al. Tight junction proteins at the blood-brain barrier: Far more than claudin-5. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (10), 1987-2002 (2019).
- Cong, X., et al. Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren's syndrome. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1864 (10), 3154-3163 (2018).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents. Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of Cell Biology. 134 (4), 1031-1049 (1996).
- Enis, D. R., et al. Induction, differentiation, and remodeling of blood vessels after transplantation of Bcl-2-transduced endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (2), 425-430 (2005).
- Wang, X., et al. Application of digital subtraction angiography in canine hindlimb arteriography. Vascular. 30 (3), 474-480 (2022).
- Trani, M., Dejana, E. New insights in the control of vascular permeability: vascular endothelial-cadherin and other players. Current Opinion in Hematology. 22 (3), 267-272 (2015).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertension Research. 31 (5), 873-879 (2008).
- Scheppke, L., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. The Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 leads to exacerbated autoimmune arthritis through increased vascular permeability. Journal of Immunology. 184 (3), 1292-1299 (2010).
- Egawa, G., Ono, S., Kabashima, K. Intravital Imaging of vascular permeability by two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 2223, 151-157 (2021).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Schulte, D., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. The EMBO Journal. 30 (20), 4157-4170 (2011).
- Uhl, B., et al. A novel experimental approach for in vivo analyses of the salivary gland microvasculature. Frontiers in Immunology. 11, 604470 (2020).
