Summary
Retinale eksplanter opnået fra vildtype makaker blev dyrket in vitro. Retinal degeneration og cGMP-PKG-signalvejen blev induceret under anvendelse af PDE6-hæmmeren zaprinast. cGMP-akkumulering i eksplantaterne ved forskellige zaprinastkoncentrationer blev verificeret ved anvendelse af immunfluorescens.
Abstract
Arvelig retinal degeneration (RD) er karakteriseret ved progressiv fotoreceptorcelledød. Overaktivering af den cykliske guanosinmonophosphat (cGMP)-afhængige proteinkinase (PKG) vej i fotoreceptorceller forårsager fotoreceptorcelledød, især i modeller, der huser phosphodiesterase 6b (PDE6b) mutationer. Tidligere undersøgelser af RD har hovedsageligt brugt murine modeller såsom rd1 eller rd10 mus. I betragtning af de genetiske og fysiologiske forskelle mellem mus og mennesker er det vigtigt at forstå, i hvilket omfang nethinden hos primater og gnavere er sammenlignelige. Makaker deler et højt niveau af genetisk lighed med mennesker. Derfor blev vildtypemakaker (i alderen 1-3 år) udvalgt til in vitro-kulturen af retinale eksplanter, der omfattede retina-retinal pigmentepitel (RPE)-choroidkomplekset. Disse eksplantater blev behandlet med forskellige koncentrationer af PDE6-hæmmeren zaprinast for at inducere cGMP-PKG-signalvejen og simulere RD-patogenese. cGMP-akkumulering og celledød i primater retinale eksplantater blev efterfølgende verificeret ved hjælp af immunofluorescens og TUNEL-assayet. Den primat-retinale model, der er etableret i denne undersøgelse, kan tjene til relevante og effektive undersøgelser af mekanismerne bag cGMP-PKG-afhængig RD samt til udvikling af fremtidige behandlingsmetoder.
Introduction
Arvelig retinal degeneration (RD) er karakteriseret ved progressiv fotoreceptorcelledød og er forårsaget af mutationer i en lang række patogene gener1. Slutresultatet af RD er synstab, og i langt de fleste tilfælde forbliver sygdommen uhelbredelig den dag i dag. Derfor er det vigtigt at studere de cellulære mekanismer, der fører til fotoreceptordød ved hjælp af modeller, der trofast repræsenterer den menneskelige sygdomstilstand. Her er primatbaserede modeller af særlig interesse på grund af deres nærhed til mennesker. Sådanne modeller kan især fremme udviklingen af passende terapeutiske indgreb, der kan standse eller forsinke fotoreceptorcelledød.
Tidligere forskning i mekanismerne for celledød i RD har vist, at faldet eller tabet af phosphodiesterase 6 (PDE6) aktivitet forårsaget af RD-udløsende genmutationer fører til reduceret hydrolyse af cyklisk guanosinmonophosphat (cGMP)2,3. cGMP er en specifik agonist af de cykliske nukleotid-gated ionkanaler (CNGC'er) i stangens ydre segmenter (ROS'er) og er også et nøglemolekyle, der er ansvarlig for omdannelsen af lyssignaler til elektriske signaler i hvirveldyrs fotoreceptorceller4. Reduceret cGMP-hydrolyse forårsager akkumulering af cGMP i ROS'er, hvilket fører til åbning af CNGC'er 5. Følgelig aktiveres fototransduktionsvejene, hvilket resulterer i en stigning i kationkoncentrationer i fotoreceptorceller. Denne proces pålægger fotoreceptorer en metabolisk byrde, som, når de overaktiveres, for eksempel af mutationer i PDE6, kan forårsage celledød.
Mange undersøgelser har vist, at en signifikant overakkumulering af cGMP i fotoreceptorer i musemodeller med forskellige RD-genmutationer kan forårsage aktivering af cGMP-afhængig proteinkinase (PKG)3,6. Dette fører til en betydelig stigning i døende, TUNEL-positive celler og en gradvis udtynding af fotoreceptorcellelaget. Tidligere undersøgelser tyder på, at PKG-overaktivering forårsaget af forhøjede cGMP-niveauer er en nødvendig og tilstrækkelig betingelse for induktion af fotoreceptorcelledød 2,5. Undersøgelser af forskellige musemodeller af RD har også vist, at PKG-aktivering induceret af forhøjede cGMP-niveauer i fotoreceptorer fører til overaktivering af downstream-effektorer såsom poly-ADP-ribosepolymerase 1 (PARP1), histon-deacetylase (HDAC) og calpain 2,7,8,9. Dette indebærer årsagssammenhænge mellem disse forskellige målproteiner og fotoreceptorcelledød.
Tidligere forskning i patologi, toksikofarmakologi og terapi af RD var imidlertid hovedsageligt baseret på musemodeller for RD10,11,12. Ikke desto mindre er der stadig enorme vanskeligheder med den kliniske oversættelse af disse resultater. Dette skyldes de betydelige genetiske og fysiologiske forskelle mellem mus og mennesker, især med hensyn til nethindestrukturen. I modsætning hertil deler ikke-menneskelige primater (NHP'er) også en høj grad af lighed med mennesker med hensyn til genetiske egenskaber, fysiologiske mønstre og miljøfaktorregulering. For eksempel blev optogenetisk terapi undersøgt som et middel til at genoprette retinal aktivitet i en NHP model13. Lingam og kolleger demonstrerede, at god fremstillingspraksis-grade human-induceret pluripotent stamcelle-afledte retinale fotoreceptor precursor celler kan redde keglefotoreceptorskader i NHP14. Derfor er NHP-modeller vigtige for udforskningen af RD-patogenese og udviklingen af effektive behandlingsmetoder. Især NHP-modeller af RD, der udviser patogene mekanismer svarende til dem hos mennesker, kunne spille en kritisk rolle i undersøgelser af udviklingen og in vivo toksikofarmakologisk analyse af nye lægemidler.
I betragtning af den lange livscyklus, det høje niveau af tekniske vanskeligheder og de høje omkostninger, der er forbundet med at etablere in vivo-primatmodeller, etablerede vi en in vitro non-human primat (NHP) model ved hjælp af kulturer af udplantet makaknethinden. For det første blev vildtype makaker i alderen 1-3 år udvalgt til in vitro-kultur af retinale eksplanter, som omfattede retina-RPE-choroid-komplekset. Explants blev derefter behandlet med forskellige koncentrationer af PDE6-hæmmeren zaprinast (100 μM, 200 μM og 400 μM) for at inducere cGMP-PKG-signalvejen. Fotoreceptorcelledød blev kvantificeret og analyseret ved hjælp af TUNEL-assayet, og cGMP-akkumulering i eksplantater blev verificeret via immunofluorescens. I betragtning af den høje grad af lighed med hensyn til cellefordeling og morfologi, retinal lagtykkelse og andre fysiologiske egenskaber ved nethinden mellem aber og mennesker kan etableringen af cGMP-PKG-signalvejen i in vitro retinalmodellen lette fremtidig forskning i patogenesen af RD samt undersøgelser af udvikling og toksikofarmakologi af nye lægemidler til RD-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøget blev gennemgået og godkendt af Ethics Review Committee of Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences (IACUC-PE-2022-06-002) og dyreetisk gennemgang og dyreprotokol fra Yunnan University (YNU20220149).
1. Fremstilling af retinale eksplanter
- Få primatøjekugler fra vildtype makaker i alderen 1 til 3 år, opbevares i vævsopbevaringsopløsning og transporteres på is inden for 3 timer efter enukleation, efter at aberne blev ofret eller efter naturlig død.
- Til fremstilling af proteinase K-opløsning opløses 25 mg proteinase K i 250 μL destilleret vand, og derefter tilsættes 225 μL af opløsningen til 18,5 ml basalmedium (R16).
- Vask øjenæblerne i 10 ml 5% povidon-jod (povidon-jod: vand = 1:19) i 30 sekunder og dypp dem i 5% penicillin/streptomycin (PEN/STREP):p hosphat-bufret saltvand = 1:19 i 1 min for at undgå bakteriel kontaminering. Derefter inkuberes øjenæblerne i 10 ml R16 medium i 5 min.
- Forvarm proteinase K-opløsningen i en 37 °C inkubator. Nedsænk derefter øjenkuglerne i 10 ml proteinase K-opløsning og inkuber i 2 min. Nedsænk øjenæblerne i 10 ml R16 + føtal bovin serum (1:1) opløsning, inkuber i 5 min, og overfør derefter øjenæblerne til 10 ml frisk R16 til en sidste vask.
- Adskil sclera, hornhinde, iris, linse og glaslegeme, og klip nethinden fra 4 sider med pincet og saks (figur 1A-L).
- Skær retinale eksplanter med trephinblade i fem sektioner - et 4 mm trephinblad til nasal/temporal/superior/inferior side og et 6 mm trephinblad til midtersiden (indeholdende optisk disk og makula; Figur 1M-O). Skær i følgende afstand fra synsnervehovedet: 1,5 mm for nasal, 4 mm for temporal og 2 mm for både overlegen og ringere side.
- Overfør retina-eksplanterne (indeholdende nethinden og choroid) med øjenlågsdepressoren, og placer dem midt i indsatsen, fotoreceptorsiden opad (figur 1P). Anbring ca. 1 ml komplet substrat (R16 suppleret med BSA, transferrin, progesteron, insulin, T3, corticosteron, vitamin B1, vitamin B12, retinol, retinylacetat, DL-tocopherol, tocopherylacetat, linolsyre, L-cystein HCI, glutathion, glutamin, C-vitamin) under membranen på pladen for at dække nethinden helt.
2. Primate retinal explant kultur
- Kultur retinale eksplanter i komplet medium og anbring i en 37 ° C inkubator luftet med befugtet 5% CO2.
- Påfør lægemiddelbehandling i passende koncentration på retinale kulturmedium (f.eks. zaprinast i koncentrationer på 100 μM, 200 μM eller 400 μM). Brug mindst tre explants pr. Behandlingstilstand og brug explants uden lægemiddel som kontrol. Behandl med medicin i 4 dage.
3. Fastgørelse og kryo-sektionering
- Inkuber retinale eksplanter med 1 ml paraformaldehyd (PFA) i 45 minutter, skyl dem kort med 1 ml fosfatbufret saltvand (PBS), og inkuber derefter med 10% saccharose i 10 minutter, 20% saccharose i 20 minutter og 30% saccharose i 30 minutter (1 ml for hver retina-eksplantat).
- Skær retinale eksplanter ved hjælp af trephinblade for at sikre konsistens i størrelsen af eksplanterne opnået fra forskellige steder med følgende egenskaber: fire kvadranter i periferien, 6 mm i midten. Overfør derefter retinale eksplanter til en tinbox (ca. 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) med O.C.T. indlejringsmedium til at dække vævet. Vævssektionerne fryses straks ned i flydende nitrogen og anbringes i køleskab med -20 °C til opbevaring.
- Brug et skarpt blad til at trimme agaren i en lille blok, der indeholder vævsprøven, skær prøveblokkene i 10 μm sektioner, og læg dem på vedhæftningsmikroskopglas ved hjælp af en blød børste. Tør derefter i 45 minutter ved 40 °C og opbevar ved -20 °C indtil brug.
4. Immunhistokemi (figur 2)
- cGMP-farvning
- Tør diasene og tegn en hydrofob ring omkring retinale sektioner med en væskeblokkerpen til at dække prøverne.
- Dyp dias i 200 μL 0,3% fosfatbuffersaltvand og Triton X-100 pr. dias (PBST) i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter i blokerende opløsning (5% normalt æsesrum, 0,3% PBST, 1% BSA, 200 μL pr. dias) i 1 time ved stuetemperatur.
- Prøverne inkuberes natten over med det primære antistof (1:250, anti-cGMP fra får, 200 μL pr. objektglas) fremstillet i den blokerende opløsning ved 4 °C, og skyl derefter med PBS i 10 minutter (200 μL pr. objektglas) 3x.
- Inkuber prøverne med sekundært antistof (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 200 μL pr. dias) i 1 time ved stuetemperatur, og skyl derefter med PBS i 10 min, 3x. Prøverne dækkes med et antifade-monteringsmedium indeholdende 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), og opbevares ved 4 °C i mindst 30 minutter før billeddannelse.
- TUNEL farvning
- Tør objektskinnerne ved stuetemperatur i 15 minutter, og tegn en vandafvisende barrierering omkring nethindevævsprøver med væskeblokkeren, og inkuber dem derefter i 40 ml PBS i 15 minutter.
- Der inkuberes dias i 42 ml (pr. fem dias) TBS (0,05 M Tris-buffer) ved 37 °C. Opsug TBS ud, og inkuber prøverne med 6 μL proteinase K i 5 min. Vask derefter dias 3x med TBS i 5 minutter hver gang.
- Udsæt objektglassene for 40 ml ethanoleddikesyreopløsning i spiselinen, dæk med et gennemsigtigt ark, og inkuber ved -20 °C i 5 minutter. Vask lysbillederne 3x med TBS i 5 min hver gang.
- Udsæt objektglassene for blokeringsopløsning (1% BSA; 200-300 μL pr. objektglas efter behov) og inkuber dem i et fugtighedskammer i 1 time.
- Forbered TUNEL kit-opløsning, TMR-rød, i følgende forhold: 62,50 μL blokerende opløsning (1% BSA), 56,25 μL mærkningsopløsning (TMR-dUTP) og 6,25 μL enzym (andel for hvert dias). Der tilsættes ca. 130 μL af denne opløsning pr. objektglas og inkuberes ved 37 °C i 1 time. Vask derefter diasene med PBS i 5 min (200 μL pr. dias), 2x.
- Placer dækglas indeholdende 1-2 dråber antifade monteringsmedium med DAPI over prøverne, og inkuber derefter diasene ved 4 ° C i mindst 30 minutter før billeddannelse.
- cGMP-farvning kombineret med TUNEL-farvning
- cGMP-farvning blev efterfulgt af TUNEL-farvning. Følg trinnene i TUNEL-farvning fra trin 4.2.1 til trin 4.2.5, og fortsæt derefter trinnene med cGMP-farvning fra trin 4.1.2 til trin 4.1.4.
- Udfør lys- og fluorescensmikroskopi med kameraparametre som følger: eksponeringstid = 125 ms, ROI-størrelse = 2752 x 2208, farve = B / M. Tag billeder ved hjælp af softwaren. Forestil dig fire forskellige felter med et digitalkamera ved 20x forstørrelse fra hvert afsnit, og få repræsentative billeder fra de centrale områder af nethinden ved hjælp af DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), hvor Z-Stack-scanning har et interval = 1 μm og valgfrit = 1.251 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse blev Macaque monkey retinal explant-kultur udført ved hjælp af explants indeholdende retina-RPE-choroid-komplekset (figur 1, supplerende figur S1). Sammenlignet med in vitro-kulturen af retinale celler ved hjælp af nethinden uden den vedhæftede RPE og choroid, letter vores eksplantatkultur bedre celleoverlevelse og forlænger følgelig fotoreceptorcellernes overlevelse.
Vi brugte forskellige koncentrationer af PDE6-hæmmeren zaprinast (100 μM, 200 μM og 400 μM; Supplerende figur S2) at inducere en akkumulering af cGMP i fotoreceptorer og efterfølgende aktivering af PKG in vitro. Hver koncentrationsbehandling blev givet i henholdsvis 4 dage. Behandlingen af in vitro retinal modellen med 400 μM zaprinast udviste det største antal TUNEL-positive celler, et signifikant cGMP-signal og lav toksicitet for RPE og neuronale celler i den indre nethinde. Den høje andel af TUNEL-positive celler i figur 2 antydede, at øget cGMP-aktivitet kan forbedre zaprinast-induceret retinal celledegeneration, og cGMP-akkumulering spiller en rolle i fotoreceptordegeneration. Den makakke retinale degenerationsmodel, der er etableret i denne undersøgelse, vil tjene til omfattende undersøgelser af mekanismerne for cGMP-PKG-afhængig RP.
Figur 1: Produktionsproces for retinal eksplantatdyrkning i 1-årige makakaber. (A-L) Adskil sclera, hornhinde, iris, linse og glaslegeme, og skær nethinden fra fire sider med pincet og saks. (M-O) Skær retinale eksplanter med trephinblade i fem sektioner - et 4 mm trephinblad til nasal/temporal/superior/inferior side og et 6 mm trephinblad til midtersiden (indeholdende optisk disk og makula). (P) Overfør retinale eksplanter (indeholdende nethinden og choroid) sommerfuglen åben til membranen og placer membranen på en 6-brønds kulturplade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Evaluering af cGMP-aktiviteter inden for ONL af retinale eksplantater af 1-årig abe. Explants blev behandlet med forskellige koncentrationer af PDE6-hæmmeren zaprinast (100 μM, 200 μM og 400 μM). Antallet af TUNEL (røde) og cGMP (grønne) positive celler i de tre forskellige koncentrationer var stærkt øget i ONL sammenlignet med kontrol (A-D). Sammenlignet med kontrolgruppen har de TUNEL/cGMP-positive celler signifikante forskelle i 100 μM-, 200 μM- og 400 μM-grupperne. Kerner blev farvet med DAPI (blå). Et område af nethinden behandlet med 400 μM zaprinast blev forstørret for at observere cGMP (grøn) og TUNEL (rød) positive celler alene samt et fusioneret billede. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse (SD); * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; = p ≤ 0,001; = p ≤ 0,0001. Forkortelser: GC'er = ganglionceller, INL = indre kernelag, ONL = ydre nukleare lag, RPE = retinal pigmentepitel, cGMP = cyklisk guanosinmonophosphat, PDE6 = phosphodiesterase 6. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Placering af retinale stanse, der anvendes til eksplantatkulturer. Explants afledt af næseslag var placeret 1, 5 mm fra synsnervehovedet, mens denne afstand var 4 mm for henholdsvis tidsmæssige og 2 mm for overlegne og ringere slag. Retinale eksplanter blev opnået ved at skære med trephinblade fem steder - et 4 mm trephinblad til nasal/temporal/superior/inferior side og et 6 mm trephinblad til den centrale side (indeholdende optisk disk og makula). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: TUNEL-farvning til døende celler. Kontroller nethinden (A) og nethinden behandlet med Zaprinast i koncentrationer på 100 μM, 200 μM eller 400 μM (B-D). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Visuel fototransduktion refererer til den biologiske proces, hvorved lyssignaler omdannes til elektriske signaler af fotoreceptorceller i øjets nethinden. Fotoreceptorceller er polariserede neuroner, der er i stand til fototransduktion, og der er to forskellige typer fotoreceptorer kaldet stænger og kegler efter formerne på deres ydre segmenter. Stænger er ansvarlige for det skotopiske syn, og kegler er ansvarlige for fotopisk og høj skarphedssyn. Arvelig RD vedrører neurodegenerative sygdomme karakteriseret ved progressiv retinal fotoreceptorcelledød15.
Aktuel forskning i RD har hovedsageligt været baseret på musemodeller af RD, herunder in vitro retinale eksplantatkulturer afledt af murine RD-modeller16. Der findes imidlertid betydelige genetiske og fysiologiske forskelle, især i retinal struktur, mellem mus og mennesker. I modsætning hertil deler NHP'er en høj grad af lighed med mennesker, hvilket gør NHP-modeller mest egnede til undersøgelse af RD-patogenese og terapiudvikling.
I denne undersøgelse etablerede vi en in vitro NHP-model ved at dyrke retinale eksplanter af makakaber. Sammenlignet med rutinemæssig primær enkeltcellekultur og en in vitro-kultur af udødeliggjorte cellelinjer kan en in vitro retinal eksplantatkultur bevare retinal vævskonformation og intercellulære interaktioner, hvilket muliggør bedre simulering af in vivo-forhold . Derudover reducerer det stort set antallet af anvendte dyr og forkorter forsøgsvarigheden og giver en relativt kontrollerbar eksperimentel tilgang til undersøgelse af virkningerne af forskellige faktorer, der er involveret i retinal udvikling eller degeneration.
Vellykket forberedelse af retinale eksplanter er afgørende for en vellykket etablering af in vitro retinale modeller. Baseret på vores tidligere forskningserfaring med at forberede retinale eksplanter til mus, opsummerer vi her flere nøglepunkter for forberedelse af abenethindeeksplantat:
1) Eksplantatpræparation skal udføres så hurtigt som muligt efter dyreofring og enukleation. Det anbefales at anvende en vævsopbevaringsopløsning til opbevaring af øjeæbler før brug i eksplantatpræparation, da det muliggør bedre vedligeholdelse af cellelevedygtighed sammenlignet med fosfatbufret saltvand.
2) I betragtning af den store størrelse af abeøjekugler og de lange perioder med ekstern miljøeksponering kan vask af øjenkuglerne med fortyndet povidoniodopor og en dobbelt antibiotikaopløsning inden retinal eksplantatpræparation reducere forureninger. Vask bør dog ikke udføres i for lang tid. Tilsætningen af antibiotika under eksplantatkultur anbefales ikke, da det kan påvirke cellelevedygtigheden.
3) Enucleated øjenkugler blev udsat for en sekventiel adskillelse af sclera, hornhinde, iris, linse og glaslegeme efterfulgt af udskæring af nethinden. I modsætning til museøjekugler, som er små, og hvor sclera og uvea er tæt knyttet til hinanden, er abe øjenkugler relativt store og har et hårdt sclera og suprachoroidalt rum. Derfor kræves saks til adskillelse af sclera. Selvom dette ikke er et vanskeligt skridt i håndteringen af enukleerede abeøjeæbler, skal man være forsigtig med at undgå at beskadige nethinden og uvea. Derudover skal abelinsens hårde opsættende ledbånd klippes med en saks, inden linsen fjernes forsigtigt. Adskillelse af glaslegemet er et af de mest tidskrævende trin i eksplanteringsforberedelsesprocessen på grund af det store glasagtige kammer i abeøjet, glaslegemets høje viskositet og den faste fastgørelse af glaslegemet med nethinden hos aber i alderen 1-3 år. Glaslegemet blev fjernet i videst muligt omfang ved hjælp af en saks, og en pipette blev brugt til at lette den efterfølgende overførsel og dyrkning af retinale eksplanter. Vi er i øjeblikket i færd med at udforske hurtigere og mere effektive metoder til fjernelse af glaslegemer. Retinale eksplanter (5 mm) blev skåret ved hjælp af trephinblade for at sikre konsistens i størrelsen af eksplanterne opnået fra forskellige steder (stedegenskaber: fire kvadranter i periferien, 6 mm i midten). Under overførslen af explants til kulturindsatser kan nethinden og choroid blive adskilt. Derfor kræves skånsom og smidig håndtering for at sikre, at eksplanterne overføres under selve første forsøg, da gentagne forsøg kan forårsage nethindeskader. Endelig bør mekaniske skader minimeres i videst muligt omfang under hele retinal eksplanteringsforberedelsesprocessen for at undgå at beskadige nethindestrukturen. Den tid, det tager for eksplantatpræparation, bør også minimeres for at undgå utilsigtet celledød.
4) Retinal explant-kultur blev udført ved hjælp af explants indeholdende retina-RPE-choroid-komplekset. Sammenlignet med in vitro-kulturen af retinale celler ved hjælp af nethinden uden den vedhæftede RPE og choroid, giver vores eksplantatkultur mulighed for bedre celleoverlevelse og forlænger følgelig fotoreceptorcellernes overlevelse. Under kulturprocessen vender nethinden opad og choroiden vender nedad. Sammenlignet med mus retinale eksplanter er abe retinale eksplanter større i størrelse, hvilket stiller større krav til kulturernæring. Derfor udførte vi daglige dyrkningsmedieændringer for monkey retinal explant-kulturen i stedet for at vedtage en kulturmediumændringsfrekvens på en gang hver 2. dag, som tidligere blev brugt til musens retinale eksplantatkultur.
Samlet set har vi etableret en in vitro NHP-model gennem kulturen af retinale eksplanter af makaker og deres behandling med zaprinast for at inducere cGMP-PKG-signalvejen svarende til den, der observeres i RD-patogenese. Zaprinast er en PDE6-hæmmer, og PDE6 opretholder balancen i den intracellulære koncentration af cGMP, der aktiverer PKG17,18. cGMP-PKG-vejen kan negativt regulere oxidativ phosphorylering og mitokondrieveje og derved påvirke retinal degeneration19. Induktionen af cGMP-PKG-signalvejen i denne in vitro NHP retinale model etablerer den som en gunstig model for fremtidig forskning i patogenesen af RD samt til udvikling og toksikofarmakologisk test af nye lægemidler til RD-behandling. Ikke desto mindre har anvendelsen af denne model visse begrænsninger, navnlig dens relativt korte dyrkningsperioder og de relativt høje omkostninger for primater. Under vores fremtidige forskning vil denne in vitro-model blive brugt til funktionel evaluering af nethinden efter intervention ved hjælp af MEA og μERG. Information og cellulære placeringer af PKG-mål vil blive kombineret med måling af aktiviteter af downstream-effektorer (f.eks. calpain, PARP og HDAC) og undersøgelser af de relevante neurodegenerative mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81960180), Zinke Heritage Foundation og Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Vi takker professor Longbao Lv (Institut for Zoologi, Chinese Academy of Sciences, Kunming, Kina) for at dele de abeøjeæbler, der blev brugt i denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
