Summary
تم استزراع نباتات الشبكية التي تم الحصول عليها من المكاك البرية في المختبر. تم تحفيز تنكس الشبكية ومسار إشارات cGMP-PKG باستخدام مثبط PDE6 zaprinast. تم التحقق من تراكم cGMP في النباتات بتركيزات مختلفة من zaprinast باستخدام التألق المناعي.
Abstract
يتميز تنكس الشبكية الوراثي (RD) بموت الخلايا المستقبلة للضوء التدريجي. يؤدي الإفراط في تنشيط مسار بروتين كيناز (PKG) المعتمد على الغوانوزين الدوري (cGMP) في الخلايا المستقبلة للضوء إلى موت الخلايا المستقبلة للضوء ، خاصة في النماذج التي تؤوي طفرات فوسفوديستراز 6b (PDE6b). استخدمت الدراسات السابقة على RD بشكل أساسي نماذج الفئران مثل الفئران rd1 أو rd10 . بالنظر إلى الاختلافات الجينية والفسيولوجية بين الفئران والبشر ، من المهم أن نفهم إلى أي مدى يمكن مقارنة شبكية العين من الرئيسيات والقوارض. تشترك المكاك في مستوى عال من التشابه الجيني مع البشر. لذلك ، تم اختيار المكاك من النوع البري (الذين تتراوح أعمارهم بين 1-3 سنوات) للاستزراع في المختبر لنباتات الشبكية التي تضمنت مركب ظهارة الشبكية والشبكية (RPE) - المشيمية. تمت معالجة هذه النباتات بتركيزات مختلفة من مثبط PDE6 zaprinast للحث على مسار إشارات cGMP-PKG ومحاكاة التسبب في RD. تم التحقق لاحقا من تراكم cGMP وموت الخلايا في نباتات شبكية الرئيسيات باستخدام التألق المناعي ومقايسة TUNEL. قد يعمل نموذج شبكية العين الرئيسيات الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة على الدراسات ذات الصلة والفعالة في آليات RD المعتمدة على cGMP-PKG ، وكذلك لتطوير مناهج العلاج المستقبلية.
Introduction
يتميز تنكس الشبكية الوراثي (RD) بموت الخلايا المستقبلة للضوء التدريجي وينتج عن طفرات في مجموعة واسعة من الجينات المسببة للأمراض1. النتيجة النهائية ل RD هي فقدان البصر وفي الغالبية العظمى من الحالات لا يزال المرض غير قابل للعلاج حتى يومنا هذا. لذلك ، من المهم دراسة الآليات الخلوية التي تؤدي إلى موت المستقبلات الضوئية باستخدام نماذج تمثل بأمانة حالة المرض البشري. هنا ، تعتبر النماذج القائمة على الرئيسيات ذات أهمية خاصة بسبب قربها من البشر. والجدير بالذكر أن مثل هذه النماذج قد تعزز تطوير التدخلات العلاجية المناسبة التي يمكن أن توقف أو تؤخر موت الخلايا المستقبلة للضوء.
أظهرت الأبحاث السابقة حول آليات موت الخلايا في RD أن انخفاض أو فقدان نشاط فسفوديستراز 6 (PDE6) الناجم عن طفرات الجينات المسببة ل RD يؤدي إلى انخفاض التحلل المائي لأحادي فوسفات الغوانوزين الدوري (cGMP) 2,3. cGMP هو ناهض محدد للقنوات الأيونية ذات البوابات النوكليوتيدات الدورية (CNGCs) في الأجزاء الخارجية للقضيب (ROSs) وهو أيضا جزيء رئيسي مسؤول عن تحويل الإشارات الضوئية إلى إشارات كهربائية في خلايا مستقبلات الضوءالفقارية 4. يؤدي التحلل المائي المنخفض cGMP إلى تراكم cGMP في ROSs ، مما يؤدي إلى فتح CNGCs 5. وبالتالي ، يتم تنشيط مسارات النقل الضوئي ، مما يؤدي إلى زيادة تركيزات الكاتيون في الخلايا المستقبلة للضوء. تفرض هذه العملية عبئا أيضيا على المستقبلات الضوئية ، والتي عند الإفراط في تنشيطها ، على سبيل المثال ، بسبب الطفرات في PDE6 ، قد تسبب موت الخلايا.
أظهرت العديد من الدراسات أن التراكم المفرط الكبير ل cGMP في المستقبلات الضوئية لنماذج الفئران ذات الطفرات الجينية RD المختلفة قد يتسبب في تنشيط بروتين كيناز المعتمد على cGMP (PKG) 3,6. هذا يؤدي إلى زيادة كبيرة في الخلايا الميتة الإيجابية TUNEL وترقق تدريجي لطبقة الخلايا المستقبلة للضوء. تشير الدراسات السابقة إلى أن فرط نشاط PKG الناجم عن ارتفاع مستويات cGMP هو شرط ضروري وكاف لتحريض موت الخلايا المستقبلة للضوء 2,5. أظهرت الدراسات التي أجريت على نماذج مختلفة من الفئران من RD أيضا أن تنشيط PKG الناجم عن ارتفاع مستويات cGMP في المستقبلات الضوئية ، يؤدي إلى الإفراط في تنشيط المستجيبات النهائية مثل بوليميراز بوليميراز بولي ADP - ريبوز 1 (PARP1) ، هيستون ديسيتيلاز (HDAC) ، وكالبين2،7،8،9. وهذا يعني وجود ارتباطات سببية بين هذه البروتينات المستهدفة المختلفة وموت الخلايا المستقبلة للضوء.
ومع ذلك ، استندت الأبحاث السابقة حول علم الأمراض وعلم السموم والعلاج من RD بشكل أساسي على نماذج الفئران ل RD10،11،12. ومع ذلك ، لا تزال هناك صعوبات هائلة في الترجمة السريرية لهذه النتائج. ويرجع ذلك إلى الاختلافات الجينية والفسيولوجية الكبيرة بين الفئران والبشر ، خاصة فيما يتعلق ببنية الشبكية. في المقابل ، تشترك الرئيسيات غير البشرية (NHPs) أيضا في درجة عالية من التشابه مع البشر فيما يتعلق بالخصائص الوراثية والأنماط الفسيولوجية وتنظيم العوامل البيئية. على سبيل المثال ، تم التحقيق في العلاج البصري الوراثي كوسيلة لاستعادة نشاط الشبكية في نموذج NHP13. أظهر لينغام وزملاؤه أن خلايا سلائف مستقبلات الشبكية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات على مستوى ممارسات التصنيع الجيدة قد تنقذ تلف مستقبلات الضوء المخروطية في NHP14. لذلك ، تعد نماذج NHP مهمة لاستكشاف التسبب في RD وتطوير طرق علاج فعالة. على وجه الخصوص ، يمكن أن تلعب نماذج NHP من RD ، التي تظهر آليات مسببة للأمراض مماثلة لتلك الموجودة في البشر ، دورا حاسما في الدراسات المتعلقة بتطوير وتحليل علم الأدوية السمية في الجسم الحي للعقاقير الجديدة.
نظرا لدورة الحياة الطويلة ، والمستوى العالي من الصعوبات التقنية ، والتكلفة العالية التي ينطوي عليها إنشاء نماذج الرئيسيات في الجسم الحي ، أنشأنا نموذجا للرئيسيات غير البشرية في المختبر (NHP) باستخدام مزارع شبكية المكاك المزروعة. أولا ، تم اختيار المكاك من النوع البري الذين تتراوح أعمارهم بين 1-3 سنوات للاستزراع في المختبر لنباتات الشبكية ، والتي تضمنت مجمع شبكية العين RPE-choroid. ثم تمت معالجة النباتات الخارجية بتركيزات مختلفة من مثبط PDE6 zaprinast (100 ميكرومتر ، 200 ميكرومتر ، و 400 ميكرومتر) للحث على مسار إشارات cGMP-PKG. تم تحديد موت الخلايا المستقبلة للضوء وتحليلها باستخدام مقايسة TUNEL ، وتم التحقق من تراكم cGMP في النباتات الخارجية عن طريق التألق المناعي. نظرا لدرجة التشابه العالية فيما يتعلق بتوزيع الخلايا ومورفولوجيتها ، وسمك طبقة الشبكية ، والخصائص الفسيولوجية الأخرى لشبكية العين بين القرود والبشر ، فإن إنشاء مسار إشارات cGMP-PKG في نموذج الشبكية في المختبر قد يسهل البحث المستقبلي حول التسبب في RD وكذلك الدراسات في تطوير وعلم الأدوية السمية للعقاقير الجديدة لعلاج RD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت مراجعة الدراسة على الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات التابعة لمعهد علم الحيوان ، والأكاديمية الصينية للعلوم (IACUC-PE-2022-06-002) ، ومراجعة أخلاقيات الحيوان وبروتوكول الحيوان بجامعة يونان (YNU20220149).
1. تحضير نباتات الشبكية
- احصل على مقل عيون الرئيسيات من المكاك البرية ، التي تتراوح أعمارها بين 1 و 3 سنوات ، وتخزينها في محلول تخزين الأنسجة ، ونقلها على الجليد في غضون 3 ساعات من الاستئصال بعد التضحية بالقرود أو بعد الموت الطبيعي.
- لإعداد محلول البروتيناز K ، قم بإذابة 25 ملغ من البروتيناز K في 250 ميكرولتر من الماء المقطر ، ثم أضف 225 ميكرولتر من المحلول إلى 18.5 مل من الوسط القاعدي (R16).
- اغسل مقل العيون في 10 مل من 5٪ بوفيدون اليود (بوفيدون اليود: الماء = 1:19) لمدة 30 ثانية واغمسها في 5٪ بنسلين / ستربتومايسين (PEN/STREP):p محلول ملحي مخزن في المستشفيات = 1:19 لمدة دقيقة واحدة لتجنب التلوث البكتيري. ثم احتضان مقل العيون في 10 مل من R16 المتوسطة لمدة 5 دقائق.
- سخني محلول البروتيناز K مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية. ثم ، اغمر مقل العيون في 10 مل من محلول البروتيناز K واحتضانها لمدة 2 دقيقة. اغمر مقل العيون في 10 مل من محلول R16 + مصل بقري جنيني (1: 1) ، واحتضنها لمدة 5 دقائق ، ثم انقل مقل العيون إلى 10 مل من R16 الطازج للغسيل النهائي.
- افصل الصلبة والقرنية والقزحية والعدسة والجسم الزجاجي ، واقطع شبكية العين من 4 جوانب بملاقط ومقص (الشكل 1A-L).
- قطع نباتات الشبكية بشفرات التريفين إلى خمسة أقسام - شفرة تريفين 4 مم للجانب الأنفي / الصدغي / العلوي / السفلي وشفرة تريفين 6 مم للجانب المركزي (تحتوي على قرص بصري وبقعة. الشكل 1M-O). قطع على المسافة التالية من رأس العصب البصري: 1.5 مم للأنف ، 4 مم للوقت ، و 2 مم لكل من الجانب العلوي والسفلي.
- انقل نباتات الشبكية (التي تحتوي على شبكية العين والمشيمية) باستخدام خافض الجفن وضعها في منتصف الإدخال ، وجانب مستقبلات الضوء لأعلى (الشكل 1P). ضع ما يقرب من 1 مل من الوسط الكامل (R16 المكمل ب BSA ، الترانسفيرين ، البروجسترون ، الأنسولين ، T3 ، الكورتيكوستيرون ، فيتامين ب 1 ، فيتامين ب 12 ، الريتينول ، أسيتات الريتينيل ، DL-tocopherol ، أسيتات التوكوفيرل ، حمض اللينوليك ، L- سيستين حمض الهيدروكلوريك ، الجلوتاثيون ، الجلوتامين ، فيتامين C) تحت الغشاء الموجود على اللوحة لتغطية شبكية العين بالكامل.
2. ثقافة زرع الشبكية الرئيسيات
- تزرع الشبكية المزروعة في وسط كامل وتوضع في حاضنة 37 درجة مئوية مهواة ب 5٪ CO2 مرطب.
- تطبيق العلاج الدوائي بتركيز مناسب على وسط زراعة الشبكية (على سبيل المثال ، zaprinast بتركيزات 100 ميكرومتر أو 200 ميكرومتر أو 400 ميكرومتر). استخدم ما لا يقل عن ثلاثة نباتات لكل حالة علاجية واستخدم النباتات بدون دواء كسيطرة. علاج مع المخدرات لمدة 4 أيام.
3. التثبيت والتقسيم بالتبريد
- احتضان نباتات الشبكية مع 1 مل من بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 45 دقيقة ، واشطفها لفترة وجيزة ب 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم احتضانها مع 10٪ سكروز لمدة 10 دقائق ، وسكروز 20٪ لمدة 20 دقيقة ، و 30٪ سكروز لمدة 30 دقيقة (1 مل لكل عملية زرع شبكية).
- قطع نباتات الشبكية باستخدام شفرات التريفين لضمان الاتساق في حجم النباتات التي تم الحصول عليها من مواقع مختلفة بالخصائص التالية: أربعة أرباع في المحيط ، 6 مم في المركز. بعد ذلك ، انقل نباتات الشبكية إلى صندوق من الصفيح (حوالي 1.5 سم × 1.5 سم × 1.5 سم) باستخدام وسيط تضمين O.C.T. لتغطية الأنسجة. على الفور ، قم بتجميد أقسام الأنسجة في النيتروجين السائل وضعها في ثلاجة -20 درجة مئوية للتخزين.
- استخدم شفرة حادة لتقليم الآجار إلى كتلة صغيرة تحتوي على عينة الأنسجة ، وقم بتقطيع كتل العينة إلى أقسام 10 ميكرومتر ، وضعها على شرائح مجهر الالتصاق باستخدام فرشاة ناعمة. ثم جففيها لمدة 45 دقيقة على حرارة 40 درجة مئوية واحفظيها في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. الكيمياء الهيستولوجية المناعية (الشكل 2)
- تلطيخ cGMP
- جفف الشرائح وارسم حلقة كارهة للماء حول أقسام الشبكية باستخدام قلم مانع للسوائل لتغطية العينات.
- اغمر الشرائح في 200 ميكرولتر من محلول ملحي عازل للفوسفات 0.3٪ و Triton X-100 لكل شريحة (PBST) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم في محلول مانع (5٪ مصل حمار عادي ، 0.3٪ PBST ، 1٪ BSA ، 200 ميكرولتر لكل شريحة) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان العينات طوال الليل بالجسم المضاد الأساسي (1: 250 ، الأغنام المضادة ل cGMP ، 200 ميكرولتر لكل شريحة) المحضرة في محلول الحجب عند 4 درجات مئوية ، ثم اشطفها باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق (200 ميكرولتر لكل شريحة) 3x.
- احتضان العينات بجسم مضاد ثانوي (1: 300 ، حمار مضاد للأغنام Alxea Fluor 488 ، 200 ميكرولتر لكل شريحة) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اشطفها باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق ، 3x. قم بتغطية العينات بوسط تركيب مضاد للتلاشي يحتوي على 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التصوير.
- تلطيخ TUNEL
- جفف الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وارسم حلقة حاجز طاردة للماء حول عينات أنسجة الشبكية باستخدام قلم مانع السائل ، ثم احتضانها في 40 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
- احتضان الشرائح في 42 مل (لكل خمس شرائح) من TBS (0.05 م Tris-buffer) عند 37 درجة مئوية. نضح TBS ، واحتضان العينات مع 6 ميكرولتر من البروتيناز K لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، اغسل الشرائح 3x باستخدام TBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- قم بتعريض الشرائح إلى 40 مل من محلول حمض الخليك والإيثانول في الشوبلين ، وقم بتغطيتها بورقة شفافة ، واحتضانها عند -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. اغسل الشرائح 3 مرات باستخدام TBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- قم بتعريض الشرائح لمحلول الحجب (1٪ BSA ؛ 200-300 ميكرولتر لكل شريحة حسب المتطلبات) واحتضانها في غرفة الرطوبة لمدة 1 ساعة.
- تحضير محلول مجموعة TUNEL ، TMR الأحمر ، بالنسب التالية: 62.50 ميكرولتر من محلول الحجب (1٪ BSA) ، 56.25 ميكرولتر من محلول الوسم (TMR-dUTP) ، و 6.25 ميكرولتر من الإنزيم (نسبة لكل شريحة). أضف حوالي 130 ميكرولتر من هذا المحلول لكل شريحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح باستخدام PBS لمدة 5 دقائق (200 ميكرولتر لكل شريحة) ، 2x.
- ضع شرائح الغطاء التي تحتوي على 1-2 قطرات من وسط التثبيت المضاد للتلاشي مع DAPI فوق العينات ، ثم احتضان الشرائح عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التصوير.
- cGMP تلطيخ جنبا إلى جنب مع تلطيخ TUNEL
- تبع تلطيخ cGMP تلطيخ TUNEL. اتبع خطوات تلطيخ TUNEL من الخطوة 4.2.1 إلى الخطوة 4.2.5 ، ثم تابع خطوات تلطيخ cGMP من الخطوة 4.1.2 إلى الخطوة 4.1.4.
- قم بإجراء الفحص المجهري للضوء والتألق باستخدام معلمات الكاميرا على النحو التالي: وقت التعرض = 125 مللي ثانية ، حجم عائد الاستثمار = 2752 × 2208 ، اللون = B / M. التقط الصور باستخدام البرنامج. تخيل أربعة حقول مختلفة بكاميرا رقمية بتكبير 20x من كل قسم واحصل على صور تمثيلية من المناطق المركزية لشبكية العين باستخدام DAPI (465 نانومتر) و EGFP (509 نانومتر) و TMP (578 نانومتر) ، مع مسح Z-Stack بفاصل زمني = 1 ميكرومتر واختياري = 1.251 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة ، تم إجراء زراعة شبكية المكاك باستخدام نباتات تحتوي على مركب شبكية العين RPE-choroid (الشكل 1 ، الشكل التكميلي S1). بالمقارنة مع الثقافة المختبرية لخلايا الشبكية التي تستخدم شبكية العين بدون RPE المرفقة والمشيمية ، فإن ثقافتنا المزروعة تسهل بقاء الخلايا بشكل أفضل وبالتالي تطيل بقاء الخلايا المستقبلة للضوء.
استخدمنا تركيزات مختلفة من مثبط PDE6 zaprinast (100 μM ، 200 μM ، و 400 μM; الشكل التكميلي S2) للحث على تراكم cGMP في المستقبلات الضوئية والتنشيط اللاحق ل PKG في المختبر. تم إعطاء كل علاج تركيز لمدة 4 أيام ، على التوالي. أظهر علاج نموذج الشبكية في المختبر باستخدام zaprinast 400 μM أكبر عدد من الخلايا الإيجابية TUNEL ، وإشارة cGMP كبيرة ، وسمية منخفضة ل RPE والخلايا العصبية في شبكية العين الداخلية. تشير النسبة العالية من الخلايا الإيجابية ل TUNEL في الشكل 2 إلى أن زيادة نشاط cGMP قد يعزز تنكس خلايا الشبكية الناجم عن zaprinast ويلعب تراكم cGMP دورا في تنكس المستقبلات الضوئية. سيعمل نموذج تنكس شبكية المكاك الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة على إجراء تحقيقات شاملة حول آليات RP المعتمد على cGMP-PKG.
الشكل 1: عملية إنتاج زراعة الشبكية في المكاك البالغة من العمر عاما واحدا. (أ-ل) افصل الصلبة والقرنية والقزحية والعدسة والجسم الزجاجي ، واقطع الشبكية من أربعة جوانب بالملاقط والمقص. (م-س) قطع نباتات الشبكية بشفرات التريفين إلى خمسة أقسام - شفرة تريفين 4 مم للجانب الأنفي / الصدغي / العلوي / السفلي ، وشفرة تريفين 6 مم للجانب المركزي (تحتوي على قرص بصري وبقعة). (P) نقل نباتات الشبكية (التي تحتوي على شبكية العين والمشيمية) مفتوحة إلى الغشاء ووضع الغشاء على لوحة استزراع 6 آبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تقييم أنشطة cGMP داخل ONL لنباتات الشبكية لقرد يبلغ من العمر 1 سنة. تمت معالجة النباتات بتركيزات مختلفة من مثبط PDE6 zaprinast (100 ميكرومتر ، 200 ميكرومتر ، و 400 ميكرومتر). زاد عدد الخلايا الإيجابية TUNEL (الحمراء) و cGMP (الخضراء) في التركيزات الثلاثة المختلفة بقوة في ONL عند مقارنتها بالسيطرة (A-D). بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، فإن الخلايا الإيجابية TUNEL / cGMP لها اختلافات كبيرة في مجموعات 100 ميكرومتر و 200 ميكرومتر و 400 ميكرومتر. كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). تم تكبير منطقة من شبكية العين المعالجة ب 400 ميكرومتر زابريناست لمراقبة الخلايا الإيجابية cGMP (الخضراء) و TUNEL (الحمراء) وحدها ، بالإضافة إلى صورة مدمجة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (SD) ؛ * = ع ≤ 0.05 ؛ ** = ع ≤ 0.01 ؛ = ع ≤ 0.001 ؛ = ع ≤ 0.0001. الاختصارات: GCs = خلايا العقدة ، INL = الطبقة النووية الداخلية ، ONL = الطبقة النووية الخارجية ، RPE = ظهارة صبغة الشبكية ، cGMP = أحادي فوسفات الغوانوزين الدوري ، PDE6 = فسفوديستراز 6. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي S1: موقع اللكمات الشبكية المستخدمة في مزارع الزرع. تقع النباتات المشتقة من اللكمات الأنفية على بعد 1.5 مم من رأس العصب البصري ، بينما كانت هذه المسافة 4 مم للوقت و 2 مم لللكمات العلوية والسفلية ، على التوالي. تم الحصول على نباتات الشبكية عن طريق القطع باستخدام شفرات التريفين في خمسة مواقع - شفرة تريفين 4 مم للجانب الأنفي / الصدغي / العلوي / السفلي وشفرة تريفين 6 مم للجانب المركزي (تحتوي على قرص بصري وبقعة). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: تلطيخ TUNEL للخلايا الميتة. السيطرة على شبكية العين (A) والشبكية المعالجة ب Zaprinast بتركيزات 100 ميكرومتر أو 200 ميكرومتر أو 400 ميكرومتر (B-D). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يشير النقل الضوئي البصري إلى العملية البيولوجية التي يتم من خلالها تحويل الإشارات الضوئية إلى إشارات كهربائية بواسطة خلايا مستقبلات ضوئية داخل شبكية العين. الخلايا المستقبلة للضوء هي خلايا عصبية مستقطبة قادرة على الانتقال الضوئي، وهناك نوعان مختلفان من المستقبلات الضوئية تسمى القضبان والأقماع بعد أشكال أجزائها الخارجية. القضبان مسؤولة عن الرؤية السكوبية والأقماع مسؤولة عن الرؤية الضوئية والحدة العالية. يتعلق RD الوراثي بالأمراض التنكسية العصبية التي تتميز بموت الخلايا المستقبلة للضوء الشبكيةالتدريجي 15.
استندت الأبحاث الحالية حول RD بشكل أساسي إلى نماذج الفئران من RD ، بما في ذلك مزارع زرع الشبكية في المختبر المشتقة من نماذج الفئرانRD 16. ومع ذلك ، هناك اختلافات وراثية وفسيولوجية كبيرة ، وخاصة في بنية الشبكية ، بين الفئران والبشر. في المقابل ، تشترك NHPs في درجة عالية من التشابه مع البشر ، مما يجعل نماذج NHP أكثر ملاءمة للتحقيق في التسبب في RD وتطوير العلاج.
في هذه الدراسة ، أنشأنا نموذج NHP في المختبر عن طريق زراعة نباتات شبكية المكاك. بالمقارنة مع الثقافة الأولية الروتينية أحادية الخلية والثقافة في المختبر لخطوط الخلايا الخالدة ، يمكن لثقافة زراعة الشبكية في المختبر أن تحافظ على تكوين أنسجة الشبكية والتفاعلات بين الخلايا ، مما يتيح محاكاة أفضل للظروف في الجسم الحي . بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقلل إلى حد كبير من عدد الحيوانات المستخدمة ويقصر المدة التجريبية ، ويوفر نهجا تجريبيا يمكن التحكم فيه نسبيا للتحقيق في آثار العوامل المختلفة المشاركة في نمو الشبكية أو تنكسها.
يعد التحضير الناجح لنباتات الشبكية أمرا بالغ الأهمية لنجاح إنشاء نماذج الشبكية في المختبر . بناء على خبرتنا البحثية السابقة في تحضير نباتات الشبكية للفئران ، نلخص هنا عدة نقاط رئيسية لإعداد نبات الشبكية للقرود:
1) يجب إجراء التحضير للزرع في أسرع وقت ممكن بعد التضحية بالحيوانات والاستئصال. يوصى باستخدام محلول تخزين الأنسجة لتخزين مقلة العين قبل استخدامه في تحضير الزرع لأنه يتيح صيانة أفضل لصلاحية الخلية مقارنة بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات.
2) بالنظر إلى الحجم الكبير لمقل عيون القرد والفترات الطويلة من التعرض للبيئة الخارجية ، فإن غسل مقل العيون ببودوفور البوفيدون المخفف ومحلول مضاد حيوي مزدوج قبل تحضير زراعة الشبكية قد يقلل من التلوث. ومع ذلك ، لا ينبغي إجراء الغسيل لفترة طويلة للغاية. لا ينصح بإضافة المضادات الحيوية أثناء زراعة النباتات لأنها قد تؤثر على صلاحية الخلية.
3) تعرضت مقل العيون المنزوعة النواة لفصل متسلسل للصلبة والقرنية والقزحية والعدسة والجسم الزجاجي متبوعا بتقطيع الشبكية. على عكس مقل عيون الفأر ، وهي صغيرة والتي ترتبط فيها الصلبة والعنبية بإحكام ببعضها البعض ، فإن مقل عيون القرد كبيرة نسبيا وتمتلك صلبة صلبة صلبة ومساحة فوق المشيمية. لذلك ، هناك حاجة إلى مقص لفصل الصلبة. على الرغم من أن هذه ليست خطوة صعبة في التعامل مع مقل عيون القرد المنزوعة النواة ، إلا أنه يجب توخي الحذر لتجنب إتلاف شبكية العين والعنبية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب قطع الرباط المعلق القاسي لعدسة القرد بالمقص قبل الإزالة الدقيقة للعدسة. يعد فصل الجسم الزجاجي أحد أكثر الخطوات استهلاكا للوقت في عملية تحضير الزرع بسبب الغرفة الزجاجية الكبيرة لعين القرد ، واللزوجة العالية للجسم الزجاجي ، والتعلق القوي للجسم الزجاجي بشبكية العين في القرود التي تتراوح أعمارها بين 1-3 سنوات. تمت إزالة الجسم الزجاجي إلى أقصى حد ممكن باستخدام المقص وتم استخدام ماصة لتسهيل النقل اللاحق وزراعة نباتات الشبكية. نحن حاليا بصدد استكشاف طرق أسرع وأكثر فعالية لإزالة الجسم الزجاجي. تم قطع نباتات الشبكية (5 مم) باستخدام شفرات التريفين لضمان الاتساق في حجم النباتات التي تم الحصول عليها من مواقع مختلفة (خصائص الموقع: أربعة أرباع في المحيط ، 6 مم في المركز). أثناء نقل النباتات إلى إدراج الثقافة ، قد يتم فصل شبكية العين والمشيمية. لذلك ، يلزم التعامل اللطيف والذكي لضمان نقل النباتات أثناء المحاولة الأولى نفسها ، حيث قد تتسبب المحاولات المتكررة في تلف الشبكية. أخيرا ، يجب تقليل الضرر الميكانيكي إلى أقصى حد ممكن أثناء عملية تحضير زراعة الشبكية بأكملها لتجنب إتلاف بنية الشبكية. يجب أيضا تقليل الوقت المستغرق لإعداد الزرع لتجنب موت الخلايا غير المقصود.
4) تم إجراء زراعة الشبكية باستخدام النباتات التي تحتوي على مركب شبكية العين-RPE-choroid. بالمقارنة مع الثقافة المختبرية لخلايا الشبكية التي تستخدم شبكية العين بدون RPE المرفقة والمشيمية ، فإن ثقافتنا المزروعة تسمح ببقاء أفضل للخلايا وبالتالي تطيل بقاء الخلايا المستقبلة للضوء. أثناء عملية الاستزراع ، تواجه شبكية العين لأعلى وتواجه المشيمية لأسفل. بالمقارنة مع نباتات شبكية الفأر ، فإن نباتات شبكية القرد أكبر حجما ، مما يضع متطلبات أكبر على تغذية الثقافة. لذلك ، قمنا بإجراء تغييرات متوسطة للاستزراع اليومي لثقافة زرع شبكية القرد بدلا من اعتماد تكرار تغيير وسط الثقافة مرة واحدة كل 2 أيام ، والذي تم استخدامه سابقا لثقافة زرع شبكية الفأر.
مجتمعة ، أنشأنا نموذج NHP في المختبر من خلال زراعة نباتات شبكية المكاك ومعالجتها باستخدام zaprinast للحث على مسار إشارات cGMP-PKG المماثل لتلك التي لوحظت في التسبب في RD. Zaprinast هو مثبط PDE6 ، ويحافظ PDE6 على توازن التركيز داخل الخلايا ل cGMP الذي ينشط PKG17,18. قد ينظم مسار cGMP-PKG بشكل سلبي الفسفرة التأكسدية ومسارات الميتوكوندريا ، مما يؤثر على تنكس الشبكية19. إن تحريض مسار إشارات cGMP-PKG في نموذج شبكية NHP في المختبر يؤسسه كنموذج مناسب للبحوث المستقبلية حول التسبب في RD ، وكذلك لتطوير واختبار علم السموم للأدوية الجديدة لعلاج RD. ومع ذلك ، فإن استخدام هذا النموذج له بعض القيود ، لا سيما فترات الاستزراع القصيرة نسبيا ، والتكاليف المرتفعة نسبيا للرئيسيات. خلال بحثنا المستقبلي ، سيتم استخدام هذا النموذج في المختبر للتقييم الوظيفي بعد التدخل لشبكية العين باستخدام MEA و μERG. سيتم دمج المعلومات والمواقع الخلوية لأهداف PKG مع قياس أنشطة المستجيبات النهائية (مثل calpain و PARP و HDAC) والتحقيقات في آليات التنكس العصبي ذات الصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81960180) ، ومؤسسة تراث زينكي ، ومؤسسة شارلوت وتيستو كيرستان ، ومركز يونان الطبي السريري لأمراض العيون (ZX2019-02-01). نشكر البروفيسور Longbao Lv (معهد علم الحيوان ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، كونمينغ ، الصين) لمشاركة مقل عيون القرد المستخدمة في هذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
