Summary
野生型マカクから得られた網膜外植体を インビトロで培養した。網膜変性およびcGMP−PKGシグナル伝達経路は、PDE6阻害剤ザプリナストを用いて誘導した。異なるザプリナスト濃度の外植体におけるcGMP蓄積は、免疫蛍光法を用いて検証された。
Abstract
遺伝性網膜変性症(RD)は、進行性の視細胞死を特徴とする。光受容体細胞における環状グアノシン一リン酸(cGMP)依存性プロテインキナーゼ(PKG)経路の過剰活性化は、特にホスホジエステラーゼ6b(PDE6b)変異を有するモデルにおいて、光受容体細胞死を引き起こす。RDに関する以前の研究では、主に rd1 または rd10 マウスなどのマウスモデルが使用されてきました。マウスとヒトの遺伝的および生理学的な違いを考えると、霊長類とげっ歯類の網膜がどの程度同等であるかを理解することが重要です。マカクザルは人間と高いレベルの遺伝的類似性を共有しています。したがって、野生型マカク(1〜3歳)を、網膜-網膜色素上皮(RPE)-脈絡膜複合体を含む網膜外植片の in vitro 培養に選択しました。これらの外植片を異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナストで処理して、cGMP-PKGシグナル伝達経路を誘導し、RD病因をシミュレートしました。その後、霊長類網膜外植片におけるcGMP蓄積および細胞死を、免疫蛍光法およびTUNELアッセイを用いて検証した。本研究で確立された霊長類網膜モデルは、cGMP-PKG依存性RDのメカニズムに関する関連性のある効果的な研究、および将来の治療アプローチの開発に役立つ可能性があります。
Introduction
遺伝性網膜変性症(RD)は、進行性の視細胞死を特徴とし、多種多様な病原性遺伝子の変異によって引き起こされます1。RDの最終結果は視力喪失であり、ほとんどの場合、この病気は今日まで治療できないままです。したがって、光受容体死に至る細胞機構を、ヒトの病態を忠実に表現したモデルを用いて研究することが重要です。ここでは、霊長類ベースのモデルは、人間に近いため、特に興味深いものです。特に、このようなモデルは、視細胞死を停止または遅延させることができる適切な治療的介入の開発を進める可能性がある。
RDの細胞死メカニズムに関するこれまでの研究では、RDを誘発する遺伝子変異によって引き起こされるホスホジエステラーゼ6(PDE6)活性の低下または喪失が、環状グアノシン一リン酸(cGMP)の加水分解の減少につながることが示されています2,3。cGMPは、桿体外側セグメント(ROS)の環状ヌクレオチド依存性イオンチャネル(CNGC)の特異的アゴニストであり、脊椎動物の視細胞における光信号の電気信号への変換に関与する重要な分子でもあります4。cGMP加水分解の減少は、ROS中のcGMPの蓄積を引き起こし、CNGCの開放をもたらす5。その結果、光伝達経路が活性化され、その結果、光受容体細胞における陽イオン濃度が増加する。このプロセスは光受容体に代謝負荷を課し、例えばPDE6の突然変異によって過剰に活性化されると、細胞死を引き起こす可能性があります。
多くの研究により、RD遺伝子変異の異なるマウスモデルの光受容体におけるcGMPの有意な過剰蓄積が、cGMP依存性プロテインキナーゼ(PKG)の活性化を引き起こす可能性があることが示されています3,6。これは、死にかけているTUNEL陽性細胞の大幅な増加および視細胞層の漸進的な薄化をもたらす。以前の研究では、cGMPレベルの上昇によって引き起こされるPKGの過剰活性化が、視細胞死の誘導に必要かつ十分な条件であることが示唆されています2,5。RDのさまざまなマウスモデルに関する研究では、光受容体のcGMPレベルの上昇によって誘導されるPKG活性化が、ポリ-ADP-リボースポリメラーゼ1(PARP1)、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、およびカルパイン2,7,8,9などの下流エフェクターの過剰活性化につながることも示されています。これは、これらの異なる標的タンパク質と視細胞死との因果関係を示唆しています。
しかし、RDの病理学、毒物薬理学、および治療に関する以前の研究は、主にRD 10、11、12のマウスモデルに基づいていました。それにもかかわらず、これらの結果の臨床翻訳には計り知れない困難が残っています。これは、特に網膜構造に関して、マウスとヒトの間にかなりの遺伝的および生理学的違いがあるためです。対照的に、非ヒト霊長類(NHP)は、遺伝的特徴、生理学的パターン、および環境要因調節に関してもヒトと高度な類似性を共有しています。例えば、NHPモデル13における網膜活性を回復させる手段として、光遺伝学的治療が検討された。今回、Lingamたちの研究グループは、優れた製造基準級のヒト誘導多能性幹細胞由来網膜視細胞前駆細胞が、NHP14の錐体光受容体損傷を救済できることを実証した。したがって、NHPモデルは、RDの病因の探索と効果的な治療法の開発に重要です。特に、ヒトと同様の病原性メカニズムを示すRDのNHPモデルは、新薬の開発やin vivo毒性薬理学的解析の研究に重要な役割を果たす可能性があります。
in vivo 霊長類モデルの確立には、ライフサイクルの長期化、技術的困難度の高さ、コストの高さを考慮すると、外植したマカク網膜の培養を用いた in vitro 非ヒト霊長類(NHP)モデルを確立しました。まず、1〜3歳の野生型マカクを、網膜-RPE-脈絡膜複合体を含む網膜外植片の in vitro 培養用に選択した。次に、外植片を異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナスト(100 μM、200 μM、および400 μM)で処理して、cGMP-PKGシグナル伝達経路を誘導しました。TUNELアッセイを用いて視細胞死を定量・解析し、外植体におけるcGMP蓄積を免疫蛍光法 で 検証した。サルとヒトの網膜の細胞分布や形態、網膜層厚などの生理的特徴の類似性が高いことから、 in vitro 網膜モデルにおけるcGMP-PKGシグナル伝達経路の確立は、RDの病態解明やRD治療薬の開発・毒性薬理学の研究の進展につながることが期待されます。
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Protocol
動物実験は、中国科学院動物学研究所の倫理審査委員会(IACUC-PE-2022-06-002)、および雲南大学の動物倫理審査および動物プロトコル(YNU20220149)によってレビューおよび承認されました。
1.網膜外植片の調製
- 1〜3歳の野生型マカクから霊長類の眼球を入手し、組織保存液に保存し、サルを屠殺した後または自然死後、除核から3時間以内に氷上で輸送します。
- プロテイナーゼK溶液の調製には、25 mgのプロテイナーゼKを250 μLの蒸留水に溶解し、次に225 μLの溶液を18.5 mLの基礎培地(R16)に加えます。
- 眼球を10 mLの5%ポビドンヨード(ポビドンヨード:水= 1:19)で30秒間洗浄し、細菌汚染を避けるために5%ペニシリン/ストレプトマイシン(PEN/STREP):pホスフェート緩衝生理食塩水= 1:19に1分間浸します。.次に、眼球を10 mLのR16培地で5分間インキュベートします。
- プロテイナーゼK溶液を37°Cのインキュベーター内で予熱する。次に、眼球を10 mLのプロテイナーゼK溶液に浸し、2分間インキュベートします。眼球を10 mLのR16 +ウシ胎児血清(1:1)溶液に浸し、5分間インキュベートしてから、眼球を10 mLの新鮮なR16に移して最終洗浄します。
- 強膜、角膜、虹彩、水晶体、硝子体を分離し、ピンセットとハサミで網膜を4つの側面から切断します(図1A-L)。
- トレフィンブレードを備えた網膜外植片を、鼻/側頭/上/下側の4 mmトレフィンブレードと中央側(視神経乳頭と黄斑を含む)の6 mmトレフィンブレードの5つのセクションに切断します。図1M-O)。視神経乳頭から次の距離で切断します:鼻の場合は1.5 mm、側頭の場合は4 mm、上側と下側の両方で2 mm。
- 網膜外植片(網膜と脈絡膜を含む)を眼瞼圧子で移し、視細胞側を上にしてインサートの中央に置きます(図1P)。約1mLの完全培地(BSA、トランスフェリン、プロゲステロン、インスリン、T3、コルチコステロン、ビタミンB1、ビタミンB12、レチノール、酢酸レチノール、DL-トコフェロール、酢酸トコフェロール、リノール酸、L-システインHCl、グルタチオン、グルタミン、ビタミンCを添加したR16)をプレートのメンブレンの下に置いて、網膜を完全に覆います。
2.霊長類網膜外植片培養
- 網膜外植片を完全培地で培養し、加湿した5%CO2で通気した37°Cのインキュベーターに入れる。
- 網膜培養培地に適切な濃度の薬物処理を適用します(例:.、100 μM、200 μM、または400 μMの濃度のザプリナスト)。処理条件ごとに少なくとも3つの外植片を使用し、対照として薬剤を含まない外植片を使用します。4日間薬で治療します。
3. 固定とクライオセクショニング
- 網膜外植片を1 mLのパラホルムアルデヒド(PFA)で45分間インキュベートし、1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で簡単にすすぎ、次に10%スクロースで10分間、20%スクロースで20分間、30%スクロースで30分間インキュベートします(網膜外植片ごとに1 mL)。
- トレフィンブレードを使用して網膜外植片を切断し、次の特性を持つ異なる部位から得られた外植片のサイズの一貫性を確保します:周辺に4つの象限、中央に6 mm。次に、網膜外植片をブリキ箱(約1.5 cm x 1.5 cm x 1.5 cm)に移し、O.C.T.包埋培地を使用して組織を覆います。直ちに、組織切片を液体窒素で凍結し、-20°Cの冷蔵庫に入れて保管します。
- 鋭利な刃を使用して、寒天を組織サンプルを含む小さなブロックにトリミングし、サンプルブロックを10 μmの切片に切断し、柔らかいブラシを使用して接着顕微鏡スライドに置きます。その後、40°Cで45分間乾燥し、使用するまで-20°Cで保存する。
4. 免疫組織化学(図2)
- cGMP染色
- スライドを乾燥させ、液体ブロッカーペンで網膜切片の周りに疎水性リングを描き、サンプルを覆います。
- スライドを200 μLの0.3%リン酸緩衝生理食塩水とTriton X-100 per slide(PBST)に室温で10分間浸した後、ブロッキング溶液(5%正常ロバ血清、0.3%PBST、1%BSA、スライドあたり200 μL)に室温で1時間浸します。
- ブロッキング溶液中で調製した一次抗体(1:250、ヒツジ抗cGMP、スライドあたり200 μL)でサンプルを4°Cで一晩インキュベートした後、PBSで10分間(スライドあたり200 μL)3回リンスします。
- サンプルを二次抗体(1:300、ロバ抗羊Alxea Fluor 488、スライドあたり200 μL)で室温で1時間インキュベートした後、PBSで10分間、3回すすぎます。サンプルを4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む退色防止封入剤で覆い、イメージング前に4°Cで少なくとも30分間保存します。
- チューネル染色
- スライドを室温で15分間乾燥させ、液体ブロッカーペンで網膜組織標本の周りに撥水性バリアリングを描き、40 mLのPBSで15分間インキュベートします。
- 42 mL (5 枚のスライドあたり) の TBS (0.05 M トリスバッファー) 中でスライドを 37 °C でインキュベートします。 TBSを吸引し、サンプルを6 μLのプロテイナーゼKとともに5分間インキュベートします。次に、スライドをTBSで3回毎回5分間洗浄します。
- スライドをチョップリン中の40 mLのエタノール-酢酸溶液にさらし、透明なシートで覆い、-20°Cで5分間インキュベートします。スライドをTBSで3回毎回5分間洗浄します。
- スライドをブロッキング溶液(1%BSA、必要に応じてスライドあたり200〜300 μL)にさらし、湿度チャンバーで1時間インキュベートします。
- TUNELキット溶液TMR redを、62.50 μLのブロッキング溶液(1%BSA)、56.25 μLの標識溶液(TMR-dUTP)、および6.25 μLの酵素(各スライドの割合)の割合で調製します。スライドごとに約130 μLのこの溶液を加え、37°Cで1時間インキュベートします。次に、スライドをPBSで5分間(スライドあたり200μL)、2回洗浄します。
- 1〜2滴の退色防止封入剤を含むカバースライドをDAPIとともにサンプルの上に置き、イメージングの前にスライドを4°Cで少なくとも30分間インキュベートします。
- cGMP染色とTUNEL染色の併用
- cGMP染色に続いてTUNEL染色を行った。ステップ4.2.1からステップ4.2.5までのTUNEL染色のステップに従い、ステップ4.1.2からステップ4.1.4までのcGMP染色の手順を続行します。
- カメラパラメータを使用して、露光時間= 125ミリ秒、ROIサイズ= 2752 x 2208、カラー= B / Mのように光学顕微鏡および蛍光顕微鏡を実行します。 ソフトウェアを使用して画像をキャプチャします。デジタルカメラで各切片から20倍の倍率で4つの異なるフィールドを撮影し、DAPI(465 nm)、EGFP(509 nm)、TMP(578 nm)を使用して網膜の中央領域から代表的な画像を取得し、間隔= 1 μm、オプションのZ-Stackスキャン= 1.251 μmを使用します。
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Representative Results
本研究では、網膜-RPE-脈絡膜複合体を含む外植片を用いてマカクザル網膜外植片培養を行った(図1、 補足図S1)。RPEや脈絡膜を付着させない網膜を用いた網膜細胞の in vitro 培養と比較して、当社の外植片培養は細胞の生存率を高め、視細胞の寿命を延ばします。
異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナスト(100 μM、200 μM、および400 μM; 補足図S2)光受容体におけるcGMPの蓄積およびその後のイン ビトロでのPKGの活性化を誘導すること。各濃縮処理をそれぞれ4日間行った。400 μMザプリナストによる in vitro 網膜モデルの処理は、TUNEL陽性細胞の数が最も多く、有意なcGMPシグナルを示し、網膜内のRPEおよび神経細胞に対して低い毒性を示しました。 図2 のTUNEL陽性細胞の割合が高いことは、cGMP活性の増加がザプリナスト誘導網膜細胞変性を増強し、cGMP蓄積が光受容体変性に関与していることを示唆した。本研究で確立したマカクザル網膜変性モデルは、cGMP-PKG依存性RPのメカニズムに関する包括的な研究に役立ちます。
図1:1歳マカクにおける網膜外植片培養の作製過程。 (A-L)強膜、角膜、虹彩、水晶体、硝子体を分離し、ピンセットとハサミで網膜を四方から切断します。(M-O)トレフィン刃で網膜外植片を鼻/側頭/上/下側用の4mmトレフィン刃と中央側(視神経乳頭と黄斑を含む)の6mmトレフィン刃の5つのセクションに切断します。(P)バタフライで開いた網膜外植片(網膜と脈絡膜を含む)をメンブレンに移し、メンブレンを6ウェル培養プレートに置きます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:1歳サルの網膜外植片のONL内でのcGMP活性の評価。外植片を異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナスト(100μM、200μM、および400μM)で処理した。3つの異なる濃度のTUNEL(赤)およびcGMP(緑)陽性細胞の数は、対照(A-D)と比較した場合、ONLで強く増加した。対照群と比較して、TUNEL/cGMP陽性細胞は、100 μM、200 μM、および400 μM群で有意差があります。核はDAPI(青色)で染色した。400μMザプリナストで処理した網膜の領域を拡大して、cGMP(緑)およびTUNEL(赤)陽性細胞のみ、ならびにマージされた画像を観察した。エラーバーは標準偏差(SD)を表します。* = p ≤ 0.05;** = p ≤ 0.01;= p ≤ 0.001;= p ≤ 0.0001。略語:GCs=神経節細胞、INL =内顆粒層、ONL =外顆粒層、RPE =網膜色素上皮、cGMP =環状グアノシン一リン酸、PDE6 =ホスホジエステラーゼ6。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:外植片培養に使用される網膜パンチの位置。 鼻パンチ由来の外植片は視神経乳頭から1.5 mmの位置にあり,側頭パンチでは4 mm,上パンチでは2 mmであった。網膜外植片は,鼻側/側頭側/上側/下側4 mmトレフィン刃と中央側6 mmトレフィン刃(視神経乳頭と黄斑を含む)の5箇所をトレフィン刃で切断して得られた。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:死にかけている細胞に対するTUNEL染色。 100 μM、200 μM、または400 μM(B-D)の濃度でザプリナストで治療された網膜(A)および網膜を制御します。.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
視覚光伝達とは、光信号が眼の網膜内の光受容体細胞によって電気信号に変換される生物学的プロセスを指します。視細胞は光伝達が可能な偏光ニューロンであり、光受容体には、その外側のセグメントの形状にちなんで桿体と錐体と呼ばれる2つの異なるタイプがあります。桿体は暗所視に責任があり、錐体は明所視と高視力に責任があります。遺伝性RDは、進行性の網膜視細胞死を特徴とする神経変性疾患に関する15。
RDに関する現在の研究は、主にRDのマウスモデルに基づいており、マウスRDモデルに由来する in vitro 網膜外植片培養物を含む16。しかし、マウスとヒトの間には、特に網膜構造にかなりの遺伝的および生理学的違いがあります。対照的に、NHPはヒトと高い類似性を共有しているため、NHPモデルはRDの病因の調査と治療法の開発に最も適しています。
本研究では、マカクザルの網膜外植片を培養することにより、in vitro NHPモデルを確立しました。通常の単一細胞初代培養や不死化細胞株のin vitro培養と比較して、in vitro網膜外植片培養は網膜組織の構造と細胞間相互作用を維持できるため、in vivo状態のより良いシミュレーションが可能になります。さらに、使用される動物の数を大幅に減らし、実験期間を短縮し、網膜の発達または変性に関与するさまざまな要因の影響を調査するための比較的制御可能な実験アプローチを提供します。
網膜外植片の調製を成功させることは、 in vitro 網膜モデルの確立を成功させるために重要です。マウス用網膜外植片の調製に関するこれまでの研究経験に基づき、サル網膜外植片作製のポイントをまとめます。
1)外植片の準備は、動物の屠殺と除核後できるだけ早く行わなければなりません。外植片調製に使用する前に眼球保存用の組織保存溶液を使用することは、リン酸緩衝生理食塩水と比較して細胞生存率をより良好に維持できるため、推奨されます。
2)サル眼球のサイズが大きく、長期間の外部環境曝露を考慮すると、網膜外植片を調製する前に、希釈したポビドンヨードフォアと二重抗生物質溶液で眼球を洗浄すると、汚染が減少する可能性があります。ただし、洗浄は過度に長い時間実行しないでください。外植片培養中の抗生物質の添加は、細胞の生存率に影響を与える可能性があるため、推奨されません。
3)摘出眼球を強膜,角膜,虹彩,水晶体,硝子体を順次分離し,網膜をスライスした。小さく、強膜とブドウ膜が互いにしっかりと付着しているマウスの眼球とは異なり、サルの眼球は比較的大きく、強膜と脈絡膜上腔が丈夫です。したがって、強膜の分離にはハサミが必要です。これは、摘出されたサルの眼球の取り扱いにおいて難しいステップではありませんが、網膜とブドウ膜を損傷しないように注意する必要があります。さらに、サルレンズの丈夫な懸垂靭帯は、レンズを慎重に取り外す前にハサミで切断する必要があります。硝子体の分離は、サルの目の大きな硝子体室、硝子体の高粘度、および1〜3歳のサルにおける硝子体と網膜との強固な付着のために、外植片調製プロセスの最も時間のかかるステップの1つである。ガラス体がハサミを用いて可能な限り除去され、ピペットがその後の網膜外植片の移入および培養を容易にするために使用された。私たちは現在、硝子体除去のためのより速く、より効果的な方法を模索しているところです。網膜外植片(5 mm)をトレフィンブレードを用いて切断し、異なる部位から得られた外植片のサイズの一貫性を確保した(部位特性:周辺に4つの象限、中央に6 mm)。外植片を培養インサートに移す際に、網膜と脈絡膜が分離することがあります。したがって、繰り返しの試行は網膜の損傷を引き起こす可能性があるため、最初の試行自体の間に外植片が確実に移動されるように、穏やかで機敏な取り扱いが必要です。最後に、網膜構造の損傷を避けるために、網膜外植片の準備プロセス全体を通して機械的損傷を可能な限り最小限に抑える必要があります。不注意による細胞死を避けるために、外植片の調製にかかる時間も最小限に抑える必要があります。
4)網膜外植片培養は、網膜-RPE-脈絡膜複合体を含む外植片を用いて行った。RPEや脈絡膜を付着させない網膜を用いた網膜細胞の in vitro 培養と比較して、当社の外植片培養は細胞の生存率が向上し、視細胞の寿命を延ばすことができます。培養プロセス中、網膜は上向きで脈絡膜は下向きです。サル網膜外植片は、マウス網膜外植片と比較してサイズが大きく、培養栄養に対する要求が大きくなります。そこで、サル網膜外植片培養では、従来マウス網膜外植片培養に用いた2日に1回の培地交換頻度を採用するのではなく、毎日培地交換を行った。
まとめると、マカクザルの網膜外植片の培養とザプリナストによる治療を通じて、RD病因で観察されるのと同様のcGMP-PKGシグナル伝達経路を誘導するためのin vitro NHPモデルを確立しました。ザプリナストはPDE6阻害剤であり、PDE6はPKG17,18を活性化するcGMPの細胞内濃度のバランスを維持する。cGMP-PKG経路は、酸化的リン酸化およびミトコンドリア経路を負に調節し、それによって網膜変性に影響を与える可能性があります19。このin vitro NHP網膜モデルにおけるcGMP-PKGシグナル伝達経路の誘導は、RDの病因に関する将来の研究、ならびにRD治療のための新薬の開発および毒物薬理学試験のための好ましいモデルとして確立される。それにもかかわらず、このモデルの使用にはいくつかの制限があり、特に、培養期間が比較的短く、霊長類のコストが比較的高くなります。私たちの将来の研究では、このin vitroモデルは、MEAとμERGを使用した網膜の介入後の機能評価に使用されます。PKGターゲットの情報と細胞の位置は、下流のエフェクター(カルパイン、PARP、HDACなど)の活性の測定と組み合わされます 関連する神経変性メカニズムの調査。
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Disclosures
すべての著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(第81960180号)、ジンケ遺産財団、および雲南眼疾患臨床医療センターのシャーロットアンドティストウケルスタン財団からの助成金によって支援されました(ZX2019-02-01)。Longbao Lv教授(中国科学院動物学研究所、昆明、中国)には、この研究で使用したサルの眼球を共有していただき、感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
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