Summary
Эксплантаты сетчатки, полученные от макак дикого типа, культивировали in vitro. Дегенерацию сетчатки и сигнальный путь цГМФ-ФКГ индуцировали с помощью ингибитора ФДЭ6 запринаста. Накопление цГМФ в эксплантах при различных концентрациях запринаста верифицировали с помощью иммунофлюоресценции.
Abstract
Наследственная дегенерация сетчатки (РД) характеризуется прогрессирующей гибелью фоторецепторных клеток. Чрезмерная активация пути циклической гуанозинмонофосфата (цГМФ)-зависимой протеинкиназы (PKG) в фоторецепторных клетках вызывает гибель фоторецепторных клеток, особенно в моделях, содержащих мутации фосфодиэстеразы 6b (PDE6b). В предыдущих исследованиях RD использовались в основном мышиные модели, такие как мыши rd1 или rd10 . Учитывая генетические и физиологические различия между мышами и людьми, важно понять, в какой степени сетчатка приматов и грызунов сопоставима. Макаки имеют высокий уровень генетического сходства с людьми. Таким образом, для культивирования эксплантатов сетчатки in vitro были отобраны макаки дикого типа (в возрасте 1-3 лет), включающие комплекс сетчато-ретинальный пигментный эпителий (RPE)-сосудистая оболочка. Эти эксплантаты обрабатывали различными концентрациями запринаста ингибитора ФДЭ6 для индукции сигнального пути цГМФ-ПКГ и моделирования патогенеза РД. Накопление цГМФ и гибель клеток в эксплантах сетчатки приматов были впоследствии проверены с помощью иммунофлюоресценции и анализа TUNEL. Модель сетчатки приматов, созданная в этом исследовании, может служить для актуальных и эффективных исследований механизмов цГМФ-PKG-зависимой РД, а также для разработки будущих подходов к лечению.
Introduction
Наследственная дегенерация сетчатки (РД) характеризуется прогрессирующей гибелью фоторецепторных клеток и обусловлена мутациями в широком спектре патогенных генов1. Конечным результатом РД является потеря зрения, и в подавляющем большинстве случаев болезнь остается неизлечимой по сей день. Поэтому важно изучать клеточные механизмы, приводящие к гибели фоторецепторов, используя модели, которые точно представляют состояние болезни человека. Здесь особый интерес представляют модели, основанные на приматах, из-за их близости к человеку. Примечательно, что такие модели могут способствовать разработке соответствующих терапевтических вмешательств, которые могут остановить или отсрочить гибель фоторецепторных клеток.
Предыдущие исследования механизмов гибели клеток при РД показали, что снижение или потеря активности фосфодиэстеразы 6 (ФДЭ6), вызванная мутациями генов, запускающих РД, приводит к снижению гидролиза циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ)2,3. цГМФ является специфическим агонистом циклических нуклеотид-управляемых ионных каналов (CNGC) во внешних сегментах стержней (АФК), а также ключевой молекулой, ответственной за преобразование световых сигналов в электрические сигналы в фоторецепторных клеткахпозвоночных 4. Восстановленный гидролиз цГМФ вызывает накопление цГМФ в АФК, что приводит к открытию КНГК 5. Следовательно, пути фототрансдукции активируются, что приводит к увеличению концентрации катионов в фоторецепторных клетках. Этот процесс налагает метаболическую нагрузку на фоторецепторы, которая при чрезмерной активации, например, мутациями в ФДЭ6, может вызвать гибель клеток.
Многие исследования показали, что значительное перенакопление цГМФ в фоторецепторах мышиных моделей с различными мутациями гена RD может вызывать активацию цГМФ-зависимой протеинкиназы (PKG)3,6. Это приводит к значительному увеличению умирающих, TUNEL-положительных клеток и постепенному истончению клеточного слоя фоторецепторов. Предыдущие исследования показывают, что гиперактивация ФКГ, вызванная повышенным уровнем цГМФ, является необходимым и достаточным условием для индукции гибели фоторецепторных клеток 2,5. Исследования на различных мышиных моделях РД также показали, что активация ПКГ, вызванная повышенными уровнями цГМФ в фоторецепторах, приводит к чрезмерной активации нижестоящих эффекторов, таких как поли-АДФ-рибоза-полимераза 1 (PARP1), гистондеацетилазы (HDAC) и кальпаин 2,7,8,9. Это подразумевает причинно-следственные связи между этими различными белками-мишенями и гибелью фоторецепторных клеток.
Однако предыдущие исследования патологии, токсикофармакологии и терапии РД были в основном основаны на мышиных моделях РД10,11,12. Тем не менее, остаются огромные трудности в клиническом переводе этих результатов. Это связано со значительными генетическими и физиологическими различиями между мышами и людьми, особенно в отношении структуры сетчатки. Напротив, нечеловекообразные приматы (NHP) также имеют высокую степень сходства с людьми в отношении генетических характеристик, физиологических моделей и регуляции факторов окружающей среды. Например, оптогенетическая терапия была исследована как средство восстановления активности сетчатки в моделиNHP 13. Лингам и его коллеги продемонстрировали, что индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки-предшественники сетчатки могут спасти повреждение колбочковых фоторецепторов в NHP14. Поэтому модели NHP важны для изучения патогенеза РД и разработки эффективных методов лечения. В частности, NHP-модели РД, демонстрирующие патогенные механизмы, сходные с таковыми у людей, могут сыграть решающую роль в исследованиях по разработке и токсикофармакологическому анализу in vivo новых лекарств.
Ввиду длительного жизненного цикла, высокого уровня технических трудностей и высоких затрат, связанных с созданием моделей приматов in vivo , мы создали модель инопланетных приматов (NHP) in vitro с использованием культур эксплантированной сетчатки макак. Во-первых, были отобраны макаки дикого типа в возрасте 1-3 лет для культивирования эксплантатов сетчатки in vitro , которые включали комплекс сетчатка-RPE-сосудистая оболочка. Затем эксплантаты обрабатывали различными концентрациями запринаста ингибитора ФДЭ6 (100 мкМ, 200 мкМ и 400 мкМ), чтобы индуцировать сигнальный путь цГМФ-ПКГ. Гибель фоторецепторных клеток была количественно определена и проанализирована с помощью анализа TUNEL, а накопление цГМФ в эксплантах было проверено с помощью иммунофлуоресценции. Учитывая высокую степень сходства в отношении распределения и морфологии клеток, толщины слоя сетчатки и других физиологических характеристик сетчатки у обезьян и человека, установление сигнального пути цГМФ-ПКГ в модели сетчатки in vitro может способствовать будущим исследованиям патогенеза РД, а также исследованиям в области разработки и токсикофармакологии новых препаратов для лечения РД.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом по этике Института зоологии Китайской академии наук (IACUC-PE-2022-06-002), а также обзором этики животных и протоколом животных Юньнаньского университета (YNU20220149).
1. Приготовление эксплантатов сетчатки
- Получают глазные яблоки приматов от макак дикого типа в возрасте от 1 до 3 лет, хранят в растворе для хранения тканей и транспортируют на льду в течение 3 часов после энуклеации после принесения обезьян в жертву или после естественной смерти.
- Для приготовления раствора протеиназы К растворяют 25 мг протеиназы К в 250 мкл дистиллированной воды, а затем добавляют 225 мкл раствора к 18,5 мл базальной среды (R16).
- Промойте глазные яблоки в 10 мл 5% повидон-йода (повидон-йод: вода = 1:19) в течение 30 с и окуните их в 5% пенициллин/стрептомицин (PEN/STREP):p хосфат-буферный физиологический раствор = 1:19 на 1 мин, чтобы избежать бактериального загрязнения. Затем инкубируйте глазные яблоки в 10 мл среды R16 в течение 5 минут.
- Предварительно нагрейте раствор протеиназы К в инкубаторе с температурой 37 °C. Затем погрузите глазные яблоки в 10 мл раствора протеиназы К и инкубируйте в течение 2 мин. Погрузите глазные яблоки в 10 мл раствора R16 + фетальной бычьей сыворотки (1:1), инкубируйте в течение 5 минут, а затем перенесите глазные яблоки в 10 мл свежего R16 для окончательного промывания.
- Отделите склеру, роговицу, радужную оболочку, хрусталик и стекловидное тело и разрежьте сетчатку с 4 сторон пинцетом и ножницами (рис. 1A-L).
- Разрежьте эксплантаты сетчатки с лезвиями трепана, разделенные на пять частей: лезвие трепанта диаметром 4 мм для носовой/височной/верхней/нижней стороны и лезвие трепана, диаметром 6 мм для центральной стороны (содержащее диск зрительного нерва и макулу; Рисунок 1М-О). Разрез на следующем расстоянии от головки зрительного нерва: 1,5 мм для носа, 4 мм для височной и 2 мм для верхней и нижней стороны.
- Перенесите эксплантаты сетчатки (содержащие сетчатку и сосудистую оболочку) с депрессором век и поместите их в середину вставки фоторецепторной стороной вверх (рис. 1P). Поместите примерно 1 мл полной среды (R16 с добавлением BSA, трансферрина, прогестерона, инсулина, Т3, кортикостерона, витамина B1, витамина B12, ретинола, ретинилацетата, DL-токоферола, токоферилацетата, линолевой кислоты, L-цистеина HCl, глутатиона, глутамина, витамина С) под мембрану на пластине, чтобы полностью покрыть сетчатку.
2. Культура эксплантата сетчатки приматов
- Культуру сетчатки эксплантируют в полной среде и помещают в инкубатор с температурой 37 °C, аэрируемый увлажненным 5%CO2.
- Применяют препарат в соответствующей концентрации к питательной среде сетчатки (например, запринаст в концентрациях 100 мкМ, 200 мкМ или 400 мкМ). Используйте не менее трех эксплантатов в каждом состоянии лечения и используйте эксплантаты без лекарства в качестве контроля. Лечат препаратом в течение 4 дней.
3. Фиксация и криосекционирование
- Инкубируют эксплантаты сетчатки с 1 мл параформальдегида (ПФА) в течение 45 мин, кратковременно промывают их 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), а затем инкубируют с 10% сахарозой в течение 10 мин, 20% сахарозой в течение 20 мин и 30% сахарозой в течение 30 мин (1 мл для каждого эксплантата сетчатки).
- Разрежьте эксплантаты сетчатки с помощью лезвий трепана, чтобы обеспечить постоянство размеров эксплантатов, полученных из разных участков со следующими характеристиками: четыре квадранта на периферии, 6 мм в центре. Затем перенесите эксплантаты сетчатки в жестяную коробку (примерно 1,5 см x 1,5 см x 1,5 см) со средой для встраивания O.C.T., чтобы покрыть ткань. Немедленно заморозьте срезы тканей в жидком азоте и поместите в холодильник с температурой -20 °C для хранения.
- Используйте острое лезвие, чтобы разрезать агар на небольшой блок, содержащий образец ткани, разрежьте блоки образца на участки размером 10 мкм и поместите их на предметные стекла адгезионного микроскопа с помощью мягкой щетки. Затем высушите в течение 45 минут при 40 ° C и храните при -20 ° C до использования.
4. Иммуногистохимия (рис. 2)
- Окрашивание cGMP
- Высушите предметные стекла и нарисуйте гидрофобное кольцо вокруг участков сетчатки с помощью жидкостной блокирующей ручки, чтобы покрыть образцы.
- Погрузите предметные стекла в 200 мкл 0,3% фосфатного буферного физиологического раствора и Triton X-100 на предметное стекло (PBST) на 10 мин при комнатной температуре, а затем в блокирующий раствор (5% обычная ослиная сыворотка, 0,3% PBST, 1% BSA, 200 мкл на предметное стекло) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубируйте образцы в течение ночи с первичным антителом (1:250, овец против цГМФ, 200 мкл на предметное стекло), приготовленным в блокирующем растворе при 4 ° C, а затем промывайте PBS в течение 10 мин (200 мкл на предметное стекло) 3 раза.
- Инкубируйте образцы с вторичными антителами (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 200 мкл на предметное стекло) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем промойте PBS в течение 10 мин, 3 раза. Накройте образцы антибактериальной монтажной средой, содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), и храните при температуре 4 °C не менее 30 минут перед визуализацией.
- Окрашивание TUNEL
- Высушите предметные стекла при комнатной температуре в течение 15 минут и нарисуйте водоотталкивающее барьерное кольцо вокруг образцов тканей сетчатки с помощью ручки-блокатора жидкости, а затем инкубируйте их в 40 мл PBS в течение 15 минут.
- Инкубируют предметные стекла в 42 мл (на пять предметных стекол) TBS (0,05 М трис-буфера) при 37 °C. Аспирируйте TBS и инкубируйте образцы с 6 мкл протеиназы K в течение 5 мин. Затем промывайте предметные стекла 3 раза с помощью TBS в течение 5 минут каждый раз.
- Подвергните предметные стекла воздействию 40 мл раствора этанол-уксусной кислоты в чоплине, накройте прозрачным листом и выдерживайте при -20 °C в течение 5 мин. Промывайте предметные стекла 3 раза с помощью TBS в течение 5 минут каждый раз.
- Подвергните предметные стекла воздействию блокирующего раствора (1% BSA; 200-300 мкл на предметное стекло в соответствии с требованиями) и инкубируйте во влажной камере в течение 1 часа.
- Приготовьте раствор набора TUNEL, красный TMR, в следующей пропорции: 62,50 мкл блокирующего раствора (1% BSA), 56,25 мкл этикетирующего раствора (TMR-dUTP) и 6,25 мкл фермента (пропорция для каждого предметного стекла). Добавляют приблизительно 130 мкл этого раствора на предметное стекло и выдерживают при 37 °C в течение 1 ч. Затем промойте предметные стекла PBS в течение 5 минут (200 мкл на предметное стекло), 2 раза.
- Наложите на образцы предметные стекла, содержащие 1-2 капли антифавальной монтажной среды, с DAPI, а затем инкубируйте предметные стекла при 4 °C в течение не менее 30 минут перед визуализацией.
- Окрашивание cGMP в сочетании с окрашиванием TUNEL
- Окрашивание cGMP сопровождалось окрашиванием TUNEL. Следуйте шагам окрашивания TUNEL от шага 4.2.1 до шага 4.2.5, а затем продолжите шаги окрашивания cGMP от шага 4.1.2 до шага 4.1.4.
- Выполняйте световую и флуоресцентную микроскопию с параметрами камеры следующим образом: время экспозиции = 125 мс, размер ROI = 2752 x 2208, цвет = B/M. Делайте снимки с помощью программного обеспечения. Сфотографируйте четыре различных поля с помощью цифровой камеры с 20-кратным увеличением каждого участка и получите репрезентативные изображения из центральных областей сетчатки с помощью DAPI (465 нм), EGFP (509 нм), TMP (578 нм), при этом сканирование Z-Stack имеет интервал = 1 мкм и опционально = 1,251 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании культуру эксплантата сетчатки макаки проводили с использованием эксплантов, содержащих комплекс сетчатка-RPE-сосудистая оболочка (рис. 1, дополнительный рисунок S1). По сравнению с культивированием клеток сетчатки in vitro с использованием сетчатки без прикрепленного RPE и сосудистой оболочки, наша культура эксплантатов способствует лучшей выживаемости клеток и, соответственно, продлевает выживание фоторецепторных клеток.
Мы использовали различные концентрации ингибитора ФДЭ6 запринаста (100 мкМ, 200 мкМ и 400 мкМ; Дополнительный рисунок S2) индуцировать накопление цГМФ в фоторецепторах и последующую активацию ФКГ in vitro. Каждая концентрационная обработка проводилась в течение 4 дней соответственно. При лечении in vitro модели сетчатки 400 мкМ запринастом было выявлено наибольшее количество TUNEL-положительных клеток, значимый сигнал цГМФ и низкая токсичность для РПЭ и нейрональных клеток внутренней сетчатки. Высокая доля TUNEL-положительных клеток на рисунке 2 позволяет предположить, что повышение активности цГМФ может усиливать индуцированную запринастом дегенерацию клеток сетчатки, а накопление цГМФ играет роль в дегенерации фоторецепторов. Модель дегенерации сетчатки макак, установленная в этом исследовании, послужит для комплексных исследований механизмов цГМФ-PKG-зависимой RP.
Рисунок 1: Процесс производства культивирования эксплантата сетчатки у 1-летних макак. (А-Л) Отделите склеру, роговицу, радужную оболочку, хрусталик и стекловидное тело и разрежьте сетчатку с четырех сторон пинцетом и ножницами. (М-О) Разрежьте эксплантаты сетчатки с лезвиями трепанта на пять частей - лезвие трепанта диаметром 4 мм для носовой/височной/верхней/нижней стороны и лезвие трепанта диаметром 6 мм для центральной стороны (содержащее диск зрительного нерва и макулу). (P) Перенесите эксплантаты сетчатки (содержащие сетчатку и сосудистую оболочку), открытые бабочками, на мембрану и поместите мембрану на 6-луночную культуральную пластину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оценка активности цГМФ в ОНЛ эксплантатов сетчатки 1-летней обезьяны. Эксплантаты обрабатывали различными концентрациями ингибитора ФДЭ6 запринаста (100 мкМ, 200 мкМ и 400 мкМ). Количество положительных клеток TUNEL (красный) и cGMP (зеленый) в трех различных концентрациях было сильно увеличено в ONL по сравнению с контролем (A-D). По сравнению с контрольной группой, TUNEL/cGMP-положительные клетки имеют значительные различия в группах 100 мкМ, 200 мкМ и 400 мкМ. Ядра окрашивали DAPI (синий). Область сетчатки, обработанную 400 мкМ запринастом, была увеличена для наблюдения только положительных клеток цГМФ (зеленый) и TUNEL (красный), а также объединенного изображения. Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение (SD); * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; = p ≤ 0,001; = p ≤ 0,0001. Сокращения: GCs = ганглиозные клетки, INL = внутренний ядерный слой, ONL = внешний ядерный слой, RPE = пигментный эпителий сетчатки, cGMP = циклический гуанозинмонофосфат, PDE6 = фосфодиэстераза 6. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Расположение пуансонов сетчатки, используемых для культур эксплантатов. Эксплантаты, полученные из носовых ударов, были расположены на расстоянии 1,5 мм от головки зрительного нерва, в то время как это расстояние составляло 4 мм для височных и 2 мм для верхних и нижних ударов соответственно. Эксплантаты сетчатки были получены путем разрезания лезвиями трепанга в пяти местах - лезвие трепанта диаметром 4 мм для носовой/височной/верхней/нижней стороны и лезвие трепана, имеющее 6 мм для центральной стороны (содержащее диск зрительного нерва и макулу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Окрашивание TUNEL для умирающих клеток. Контрольная сетчатка (А) и сетчатки, обработанные Запринастом в концентрациях 100 мкМ, 200 мкМ или 400 мкМ (В-Д). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Визуальная фототрансдукция относится к биологическому процессу, посредством которого световые сигналы преобразуются в электрические сигналы фоторецепторными клетками в сетчатке глаза. Фоторецепторные клетки представляют собой поляризованные нейроны, способные к фототрансдукции, и существует два разных типа фоторецепторов, называемых палочками и колбочками по форме их внешних сегментов. Палочки отвечают за скотопическое зрение, а колбочки — за фотопическое зрение и зрение высокой остроты. Наследственный РД относится к нейродегенеративным заболеваниям, характеризующимся прогрессирующей гибелью клеток фоторецепторов сетчатки15.
Текущие исследования РД в основном основаны на мышиных моделях РД, включая культуры эксплантатов сетчатки in vitro , полученные из мышиных моделей РД16. Однако существуют значительные генетические и физиологические различия, особенно в структуре сетчатки, между мышами и людьми. Напротив, NHP имеют высокую степень сходства с людьми, что делает модели NHP наиболее подходящими для исследования патогенеза РД и разработки терапии.
В этом исследовании мы создали модель NHP in vitro путем культивирования экплантатов сетчатки макак. По сравнению с обычной первичной культурой одноклеточных клеток и культурой иммортализированных клеточных линий in vitro, культура эксплантата сетчатки in vitro может сохранять конформацию ткани сетчатки и межклеточные взаимодействия, что позволяет лучше моделировать условия in vivo. Кроме того, это значительно сокращает количество используемых животных и сокращает продолжительность эксперимента, а также обеспечивает относительно контролируемый экспериментальный подход для изучения эффектов различных факторов, участвующих в развитии или дегенерации сетчатки.
Успешное приготовление эксплантатов сетчатки имеет решающее значение для успешного создания моделей сетчатки in vitro . Основываясь на нашем предыдущем опыте исследований по приготовлению эксплантатов сетчатки для мышей, мы суммируем здесь несколько ключевых моментов для приготовления эксплантата сетчатки обезьян:
1) Подготовка эксплантата должна быть выполнена как можно скорее после жертвоприношения животного и энуклеации. Рекомендуется использовать раствор для хранения тканей для хранения глазного яблока перед использованием в препарате эксплантата, поскольку он обеспечивает лучшее поддержание жизнеспособности клеток по сравнению с фосфатно-буферным физиологическим раствором.
2) Учитывая большой размер глазных яблок обезьян и длительные периоды воздействия внешней среды, промывание глазных яблок разбавленным йодофором повидона и раствором двойного антибиотика перед подготовкой эксплантата сетчатки может уменьшить загрязнение. Однако стирка не должна выполняться в течение чрезмерно длительного времени. Добавление антибиотиков во время культивирования эксплантата не рекомендуется, так как это может повлиять на жизнеспособность клеток.
3) Энуклеированные глазные яблоки подвергали последовательному разделению склеры, роговицы, радужной оболочки, хрусталика и стекловидного тела с последующим разрезанием сетчатки. В отличие от глазных яблок мыши, которые малы и в которых склера и языченосная оболочка плотно прикреплены друг к другу, глазные яблоки обезьяны относительно велики и обладают жесткой склерой и супрахориоидальным пространством. Поэтому для отделения склеры требуются ножницы. Хотя это не сложный шаг при обращении с энуклеированными глазными яблоками обезьян, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить сетчатку и яйцевидную оболочку. Кроме того, перед тщательным извлечением линзы необходимо разрезать ножницами жесткую подвешивающую связку линзы обезьяны. Отделение стекловидного тела является одним из самых трудоемких этапов процесса приготовления эксплантата из-за большой стекловидной камеры глаза обезьяны, высокой вязкости стекловидного тела и прочного прикрепления стекловидного тела к сетчатке у обезьян в возрасте 1-3 лет. Стекловидное тело удаляли в максимально возможной степени с помощью ножниц и использовали пипетку для облегчения последующего переноса и культивирования эксплантатов сетчатки. В настоящее время мы находимся в процессе изучения более быстрых и эффективных методов удаления стекловидного тела. Эксплантаты сетчатки (5 мм) разрезали с помощью лезвий трепана, чтобы обеспечить постоянство размеров эксплантатов, полученных из разных участков (характеристики участка: четыре квадранта на периферии, 6 мм в центре). Во время переноса эксплантов на культуральные вставки сетчатка и сосудистая оболочка могут разделяться. Поэтому требуется бережное и ловкое обращение, чтобы гарантировать, что эксплантаты будут перенесены во время первой попытки, так как повторные попытки могут привести к повреждению сетчатки. Наконец, механические повреждения должны быть сведены к минимуму в максимально возможной степени в течение всего процесса подготовки эксплантата сетчатки, чтобы избежать повреждения структуры сетчатки. Время, необходимое для приготовления эксплантата, также должно быть сведено к минимуму, чтобы избежать непреднамеренной гибели клеток.
4) Культуру эксплантатов сетчатки проводили с использованием эксплантатов, содержащих комплекс сетчатка-RPE-сосудистая оболочка. По сравнению с культивированием клеток сетчатки in vitro с использованием сетчатки без прикрепленного RPE и сосудистой оболочки, наша культура эксплантатов обеспечивает лучшую выживаемость клеток и, соответственно, продлевает выживание фоторецепторных клеток. В процессе культивирования сетчатка обращена вверх, а сосудистая оболочка - вниз. По сравнению с эксплантами сетчатки мыши, эксплантаты сетчатки обезьян больше по размеру, что предъявляет повышенные требования к питанию культуры. Таким образом, мы проводили ежедневную смену питательной среды для культуры эксплантата сетчатки обезьян вместо того, чтобы принимать частоту смены питательной среды один раз в 2 дня, которая ранее использовалась для культуры эксплантата сетчатки мыши.
В совокупности мы создали модель NHP in vitro с помощью культивирования эксплантатов сетчатки макак и их обработки запринастом для индукции сигнального пути цГМФ-ПКГ, аналогичного тому, который наблюдается при патогенезе РД. Запринаст является ингибитором ФДЭ6, а ФДЭ6 поддерживает баланс внутриклеточной концентрации цГМФ, активирующей ФКГ17,18. Путь цГМФ-ПКГ может отрицательно регулировать окислительное фосфорилирование и митохондриальные пути, тем самым влияя на дегенерацию сетчатки19. Индукция сигнального пути цГМФ-ПКГ в этой модели сетчатки NHP in vitro делает ее благоприятной моделью для будущих исследований патогенеза РД, а также для разработки и токсикофармакологического тестирования новых препаратов для лечения РД. Тем не менее, использование этой модели имеет некоторые ограничения, в частности, относительно короткие периоды культивирования и относительно высокие затраты для приматов. Во время наших будущих исследований эта модель in vitro будет использоваться для функциональной оценки сетчатки после вмешательства с использованием MEA и μERG. Информация и клеточное местоположение мишеней ФКГ будут объединены с измерением активности нижестоящих эффекторов (например, кальпаина, PARP и HDAC) и исследованиями соответствующих нейродегенеративных механизмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (No 81960180), Фонда наследия Зинкэ и Фонда Шарлотты и Тистоу Керстан, Юньнаньского клинического медицинского центра глазных болезней (ZX2019-02-01). Мы благодарим профессора Лунбао Лю (Институт зоологии Китайской академии наук, Куньмин, Китай) за то, что он поделился глазными яблоками обезьян, использованными в этом исследовании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
