Summary
Netvliesexplantaten verkregen uit wilde makaken werden in vitro gekweekt. Retinale degeneratie en de cGMP-PKG signaleringsroute werd geïnduceerd met behulp van de PDE6-remmer zaprinast. cGMP-accumulatie in de explantaten bij verschillende zaprinastconcentraties werd geverifieerd met behulp van immunofluorescentie.
Abstract
Erfelijke retinale degeneratie (RD) wordt gekenmerkt door progressieve fotoreceptorceldood. Overactivatie van de cyclische guanosinemonofosfaat (cGMP)-afhankelijke proteïnekinase (PKG) route in fotoreceptorcellen veroorzaakt fotoreceptorceldood, vooral in modellen met fosfodiësterase 6b (PDE6b) mutaties. Eerdere studies over RD hebben voornamelijk muizenmodellen gebruikt, zoals rd1 - of rd10-muizen . Gezien de genetische en fysiologische verschillen tussen muizen en mensen, is het belangrijk om te begrijpen in hoeverre de netvliezen van primaten en knaagdieren vergelijkbaar zijn. Makaken delen een hoge mate van genetische gelijkenis met mensen. Daarom werden wild-type makaken (leeftijd 1-3 jaar) geselecteerd voor de in vitro cultuur van retinale explantaten die het retina-retinale pigmentepitheel (RPE)-choroidecomplex bevatten. Deze explants werden behandeld met verschillende concentraties van de PDE6-remmer zaprinast om de cGMP-PKG-signaleringsroute te induceren en RD-pathogenese te simuleren. cGMP-accumulatie en celdood in retinale explantaten van primaten werden vervolgens geverifieerd met behulp van immunofluorescentie en de TUNEL-test. Het retinale model van primaten dat in deze studie is vastgesteld, kan dienen voor relevante en effectieve studies naar de mechanismen van cGMP-PKG-afhankelijk RD, evenals voor de ontwikkeling van toekomstige behandelingsbenaderingen.
Introduction
Erfelijke retinale degeneratie (RD) wordt gekenmerkt door progressieve fotoreceptorceldood en wordt veroorzaakt door mutaties in een grote verscheidenheid aan pathogene genen1. Het eindresultaat van RD is verlies van het gezichtsvermogen en in de overgrote meerderheid van de gevallen blijft de ziekte tot op de dag van vandaag onbehandelbaar. Daarom is het belangrijk om de cellulaire mechanismen te bestuderen die leiden tot fotoreceptordood met behulp van modellen die de menselijke ziektetoestand getrouw weergeven. Hier zijn op primaten gebaseerde modellen van bijzonder belang vanwege hun nabijheid tot de mens. Met name kunnen dergelijke modellen de ontwikkeling bevorderen van geschikte therapeutische interventies die fotoreceptorceldood kunnen stoppen of vertragen.
Eerder onderzoek naar de mechanismen van celdood bij RD heeft aangetoond dat de afname of het verlies van fosfodiësterase 6 (PDE6) activiteit veroorzaakt door RD-triggerende genmutaties leidt tot verminderde hydrolyse van cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP)2,3. cGMP is een specifieke agonist van de cyclische nucleotide-gated ionkanalen (CNGCs) in de staafbuitensegmenten (ROSs) en is ook een sleutelmolecuul dat verantwoordelijk is voor de omzetting van lichtsignalen in elektrische signalen in gewervelde fotoreceptorcellen4. Verminderde cGMP-hydrolyse veroorzaakt de accumulatie van cGMP in ROSs, wat leidt tot de opening van CNGCs 5. Bijgevolg worden de fototransductieroutes geactiveerd, wat resulteert in een toename van kationconcentraties in fotoreceptorcellen. Dit proces legt een metabole belasting op fotoreceptoren, die bij overactivering, bijvoorbeeld door mutaties in PDE6, celdood kunnen veroorzaken.
Veel studies hebben aangetoond dat een significante overaccumulatie van cGMP in fotoreceptoren van muismodellen met verschillende RD-genmutaties de activering van cGMP-afhankelijk eiwitkinase (PKG)3,6 kan veroorzaken. Dit leidt tot een aanzienlijke toename van afstervende, TUNEL-positieve cellen en een geleidelijke verdunning van de fotoreceptorcellaag. Eerdere studies suggereren dat PKG-overactivatie veroorzaakt door verhoogde cGMP-niveaus een noodzakelijke en voldoende voorwaarde is voor de inductie van fotoreceptorceldood 2,5. Studies op verschillende muismodellen van RD hebben ook aangetoond dat PKG-activering geïnduceerd door verhoogde cGMP-niveaus in fotoreceptoren, leidt tot overactivatie van downstream-effectoren zoals poly-ADP-ribose polymerase 1 (PARP1), histon deacetylase (HDAC) en calpaïne 2,7,8,9. Dit impliceert causale associaties tussen deze verschillende doeleiwitten en fotoreceptorceldood.
Eerder onderzoek naar de pathologie, toxicofarmacologie en therapie van RD was echter voornamelijk gebaseerd op muismodellen voor RD10,11,12. Niettemin blijven er enorme moeilijkheden bestaan bij de klinische vertaling van deze resultaten. Dit komt door de aanzienlijke genetische en fysiologische verschillen tussen muizen en mensen, vooral met betrekking tot de netvliesstructuur. Daarentegen delen niet-menselijke primaten (NHP's) ook een hoge mate van gelijkenis met mensen met betrekking tot genetische kenmerken, fysiologische patronen en regulatie van omgevingsfactoren. Zo werd optogenetische therapie onderzocht als middel om de retinale activiteit te herstellen in een NHP-model13. Lingam en collega's toonden aan dat goede productiepraktijken van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide retinale fotoreceptorvoorlopercellen kegelfotoreceptorschade in NHP14 kunnen redden. Daarom zijn NHP-modellen belangrijk voor de verkenning van RD-pathogenese en de ontwikkeling van effectieve behandelmethoden. In het bijzonder zouden NHP-modellen van RD, die pathogene mechanismen vertonen die vergelijkbaar zijn met die bij mensen, een cruciale rol kunnen spelen in studies over de ontwikkeling en in vivo toxicofarmacologische analyse van nieuwe geneesmiddelen.
Gezien de lange levenscyclus, het hoge niveau van technische problemen en de hoge kosten die gemoeid zijn met het opzetten van in vivo primatenmodellen, hebben we een in vitro niet-menselijk primaat (NHP) model opgesteld met behulp van culturen van geëxplanteerde makaken netvlies. Eerst werden wild-type makaken van 1-3 jaar oud geselecteerd voor in vitro kweek van retinale explantaten, waaronder het retina-RPE-choroïde complex. Explants werden vervolgens behandeld met verschillende concentraties van de PDE6-remmer zaprinast (100 μM, 200 μM en 400 μM) om de cGMP-PKG-signaalroute te induceren. Fotoreceptorceldood werd gekwantificeerd en geanalyseerd met behulp van de TUNEL-test en cGMP-accumulatie in explantaten werd geverifieerd via immunofluorescentie. Gezien de hoge mate van gelijkenis met betrekking tot celverdeling en morfologie, dikte van de retinale laag en andere fysiologische kenmerken van het netvlies tussen apen en mensen, kan de vaststelling van de cGMP-PKG-signaleringsroute in het in vitro retinale model toekomstig onderzoek naar de pathogenese van RD vergemakkelijken, evenals studies naar de ontwikkeling en toxicofarmacologie van nieuwe geneesmiddelen voor RD-behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierstudie werd beoordeeld en goedgekeurd door de Ethics Review Committee van het Institute of Zoology, de Chinese Academy of Sciences (IACUC-PE-2022-06-002) en de dierethische beoordeling en het dierprotocol van de Yunnan University (YNU20220149).
1. Bereiding van retinale explantaten
- Verkrijg oogbollen van primaten van wilde makaken van 1 tot 3 jaar oud, bewaar in weefselopslagoplossing en transport op ijs binnen 3 uur na enucleatie nadat de apen zijn geofferd of na natuurlijke dood.
- Los voor de bereiding van proteïnase K-oplossing 25 mg proteïnase K op in 250 μL gedestilleerd water en voeg vervolgens 225 μL van de oplossing toe aan 18,5 ml basaal medium (R16).
- Was de oogbollen gedurende 30 s in 10 ml 5% povidon-jodium (povidon-jodium: water = 1:19) en dompel ze in 5% penicilline / streptomycine (PEN / STREP):p hosfaat-gebufferde zoutoplossing = 1:19 gedurende 1 minuut om bacteriële besmetting te voorkomen. Incubeer vervolgens de oogbollen in 10 ml R16 medium gedurende 5 minuten.
- Verwarm de proteïnase K-oplossing voor in een incubator van 37 °C. Dompel vervolgens de oogbollen onder in 10 ml proteïnase K-oplossing en incubeer gedurende 2 minuten. Dompel de oogbollen onder in 10 ml R16 + foetaal runderserum (1:1) oplossing, incubeer gedurende 5 minuten en breng de oogbollen vervolgens over op 10 ml vers R16 voor een laatste wasbeurt.
- Scheid de sclera, het hoornvlies, de iris, de lens en het glasachtig lichaam en knip het netvlies van 4 kanten af met een pincet en een schaar (figuur 1A-L).
- Snijd retinale explantaten met trephinebladen in vijf secties- een 4 mm trephineblad voor de nasale / temporele / superieure / inferieure kant en een 6 mm trephineblad voor de centrale zijde (met optische schijf en macula; Figuur 1M-O). Snijd op de volgende afstand van de oogzenuwkop: 1,5 mm voor nasaal, 4 mm voor tijdelijk en 2 mm voor zowel superieure als inferieure zijde.
- Breng de netvliesexplantaten (met netvlies en vaatvlies) over met oogliddepressor en plaats ze in het midden van de insert, fotoreceptorzijde naar boven (figuur 1P). Plaats ongeveer 1 ml volledig medium (R16 aangevuld met BSA, transferrine, progesteron, insuline, T3, corticosteron, vitamine B1, vitamine B12, retinol, retinylacetaat, DL-tocoferol, tocoferylacetaat, linolzuur, L-cysteïne HCl, glutathion, glutamine, vitamine C) onder het membraan op de plaat om het netvlies volledig te bedekken.
2. Retinale explantatiecultuur van primaten
- Kweek retinale explantaten in volledig medium en plaats in een 37 °C incubator belucht met bevochtigd 5% CO2.
- Breng medicamenteuze behandeling in de juiste concentratie aan op het retinale kweekmedium (bijv. zaprinast in concentraties van 100 μM, 200 μM of 400 μM). Gebruik ten minste drie explantaten per behandelingsconditie en gebruik explantaten zonder geneesmiddel als controle. Behandel met een medicijn gedurende 4 dagen.
3. Fixatie en cryo-sectie
- Incubeer retinale explantaten met 1 ml paraformaldehyde (PFA) gedurende 45 minuten, spoel ze kort af met 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en incubeer vervolgens met 10% sucrose gedurende 10 minuten, 20% sucrose gedurende 20 minuten en 30% sucrose gedurende 30 minuten (1 ml voor elke netvliesexplant).
- Snijd retinale explantaten met behulp van trephinebladen om consistentie te garanderen in de grootte van de explantaten verkregen van verschillende locaties met de volgende kenmerken: vier kwadranten in de periferie, 6 mm in het midden. Breng vervolgens de retinale explantaten over in een blikdoos (ongeveer 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) met O.C.T. inbeddingsmedium om het weefsel te bedekken. Vries de weefselsecties onmiddellijk in vloeibare stikstof in en plaats ze in een koelkast van -20 °C voor opslag.
- Gebruik een scherp mes om de agar in een klein blok met het weefselmonster te snijden, snijd de monsterblokken in secties van 10 μm en plaats ze op adhesiemicroscoopglaasjes met een zachte borstel. Droog vervolgens gedurende 45 minuten bij 40 °C en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
4. Immunohistochemie (figuur 2)
- cGMP kleuring
- Droog de dia's en teken een hydrofobe ring rond de netvliessecties met een vloeistofblokkerpen om de monsters te bedekken.
- Dompel dia's gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder in 200 μL van 0,3% fosfaatbufferzoutoplossing en Triton X-100 per dia (PBST) en vervolgens in een blokkerende oplossing (5% normaal ezelserum, 0,3% PBST, 1% BSA, 200 μL per dia) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer de monsters 's nachts met het primaire antilichaam (1:250, schapen anti-cGMP, 200 μL per dia) bereid in de blokkerende oplossing bij 4 °C, en spoel vervolgens 3x met PBS gedurende 10 minuten (200 μL per dia).
- Incubeer de monsters met secundair antilichaam (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 200 μL per dia) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en spoel vervolgens af met PBS gedurende 10 min, 3x. Bedek de monsters met een antifade montagemedium dat 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bevat en bewaar bij 4 °C gedurende ten minste 30 minuten vóór de beeldvorming.
- TUNEL kleuring
- Droog de dia's bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en trek een waterafstotende barrièrering rond retinale weefselmonsters met de vloeistofblokkerpen en incuber ze vervolgens gedurende 15 minuten in 40 ml PBS.
- Incubeer dia's in 42 ml (per vijf dia's) TBS (0,05 M Tris-buffer) bij 37 °C. Zuig de TBS uit en incuber de monsters met 6 μL proteïnase K gedurende 5 minuten. Was vervolgens dia's 3x met TBS gedurende telkens 5 minuten.
- Stel de dia's bloot aan 40 ml ethanol-azijnzuuroplossing in de choplin, dek af met een transparante plaat en incubeer bij -20 °C gedurende 5 minuten. Was de dia's 3x met TBS telkens 5 min.
- Stel de dia's bloot aan een blokkerende oplossing (1% BSA; 200-300 μL per dia volgens de vereiste) en incubeer gedurende 1 uur in een vochtigheidskamer.
- Bereid TUNEL-kitoplossing, TMR-rood, in de volgende verhouding: 62,50 μL blokkeringsoplossing (1% BSA), 56,25 μL etiketteringsoplossing (TMR-dUTP) en 6,25 μL van het enzym (verhouding voor elke dia). Voeg ongeveer 130 μL van deze oplossing per dia toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. Was vervolgens de dia's met PBS gedurende 5 minuten (200 μL per dia), 2x.
- Plaats afdekplaten met 1-2 druppels antifade montagemedium met DAPI over de monsters en incuber de dia's vervolgens bij 4 °C gedurende ten minste 30 minuten voordat ze worden afgebeeld.
- cGMP kleuring gecombineerd met TUNEL kleuring
- cGMP-kleuring werd gevolgd door TUNEL-kleuring. Volg de stappen van TUNEL-kleuring van stap 4.2.1 tot stap 4.2.5 en ga vervolgens verder met de stappen van cGMP-kleuring van stap 4.1.2 tot stap 4.1.4.
- Voer licht- en fluorescentiemicroscopie uit met cameraparameters als volgt: belichtingstijd = 125 ms, ROI-grootte = 2752 x 2208, Kleur = B / M. Leg beelden vast met behulp van de software. Stel vier verschillende velden voor met een digitale camera met een vergroting van 20x van elke sectie en verkrijg representatieve foto's van de centrale delen van het netvlies met behulp van DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), waarbij Z-Stack-scanning een interval = 1 μm en optioneel = 1,251 μm heeft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie werd de retinale explantatiecultuur van makaken apen uitgevoerd met explantaten die het retina-RPE-choroïde complex bevatten (figuur 1, aanvullende figuur S1). In vergelijking met de in vitro kweek van retinale cellen met behulp van het netvlies zonder de aangehechte RPE en het vaatvlies, vergemakkelijkt onze explantatiecultuur een betere celoverleving en verlengt dienovereenkomstig de overleving van fotoreceptorcellen.
We gebruikten verschillende concentraties van de PDE6-remmer zaprinast (100 μM, 200 μM en 400 μM; Aanvullende figuur S2) het induceren van een accumulatie van cGMP in fotoreceptoren en daaropvolgende activering van PKG in vitro. Elke concentratiebehandeling werd respectievelijk gedurende 4 dagen gegeven. De behandeling van het in vitro retinale model met 400 μM zaprinast vertoonde het grootste aantal TUNEL-positieve cellen, een significant cGMP-signaal en een lage toxiciteit voor de RPE en neuronale cellen in het binnenste netvlies. Het hoge aandeel TUNEL-positieve cellen in figuur 2 suggereerde dat toenemende cGMP-activiteit zaprinast-geïnduceerde retinale celdegeneratie kan verbeteren en cGMP-accumulatie speelt een rol bij fotoreceptordegeneratie. Het retinale degeneratiemodel van makaken dat in deze studie is vastgesteld, zal dienen voor uitgebreid onderzoek naar de mechanismen van cGMP-PKG-afhankelijke RP.
Figuur 1: Productieproces van retinale explantatiekweek bij 1-jarige makaken. (A-L) Scheid de sclera, het hoornvlies, de iris, de lens en het glasachtig lichaam en knip het netvlies van vier kanten af met een pincet en een schaar. (M-O) Snijd de retinale explantaten met trephinebladen in vijf secties - een 4 mm trephinemes voor de nasale / temporele / superieure / inferieure kant en een 6 mm trephinemes voor de centrale kant (met optische schijf en macula). (P) Breng de retinale explantaten (die netvlies en vaatvlies bevatten) open naar het membraan en plaats het membraan op een 6-well kweekplaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Evaluatie van cGMP-activiteiten binnen de ONL van retinale explantaten van 1-jarige aap. Explantaten werden behandeld met verschillende concentraties van de PDE6-remmer zaprinast (100 μM, 200 μM en 400 μM). Het aantal TUNEL (rood) en cGMP (groen) positieve cellen in de drie verschillende concentraties was sterk verhoogd in ONL in vergelijking met controle (A-D). Vergeleken met de controlegroep hebben de TUNEL/cGMP-positieve cellen significante verschillen in de groepen van 100 μM, 200 μM en 400 μM. Kernen waren gekleurd met DAPI (blauw). Een gebied van het netvlies behandeld met 400 μM zaprinast werd vergroot om alleen cGMP (groen) en TUNEL (rood) positieve cellen te observeren, evenals een samengevoegd beeld. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (SD); * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; = p ≤ 0,001; = p ≤ 0,0001. Afkortingen: GCs = ganglioncellen, INL = binnenste nucleaire laag, ONL = buitenste nucleaire laag, RPE = retinale pigmentepitheel, cGMP = cyclisch guanosinemonofosfaat, PDE6 = fosfodiësterase 6. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Locatie van retinale ponsen die worden gebruikt voor explantculturen. Explantaten afgeleid van neusstoten bevonden zich op 1,5 mm van de oogzenuwkop, terwijl deze afstand 4 mm was voor respectievelijk temporele en 2 mm voor superieure en inferieure stoten. Retinale explantaten werden verkregen door op vijf plaatsen met trephinemessen te snijden - een 4 mm trephinemes voor de nasale / tijdelijke / superieure / inferieure zijde en een 6 mm trephineblad voor de centrale zijde (met optische schijf en macula). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: TUNEL-kleuring voor stervende cellen. Controle netvlies (A) en netvliezen behandeld met Zaprinast in concentraties van 100 μM, 200 μM, of 400 μM (B-D). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Visuele fototransductie verwijst naar het biologische proces waarbij lichtsignalen worden omgezet in elektrische signalen door fotoreceptorcellen in het netvlies van het oog. Fotoreceptorcellen zijn gepolariseerde neuronen die in staat zijn tot fototransductie en er zijn twee verschillende soorten fotoreceptoren die staven en kegeltjes worden genoemd naar de vormen van hun buitenste segmenten. Staafjes zijn verantwoordelijk voor het scotopische zicht en kegeltjes zijn verantwoordelijk voor fotopisch en hoog scherpte zicht. Erfelijke RD heeft betrekking op neurodegeneratieve ziekten die worden gekenmerkt door progressieve retinale fotoreceptorceldood15.
Het huidige onderzoek naar RD is voornamelijk gebaseerd op muismodellen van RD, waaronder in vitro retinale explantculturen afgeleid van murine RD-modellen16. Er bestaan echter aanzienlijke genetische en fysiologische verschillen, vooral in retinale structuur, tussen muizen en mensen. NHP's daarentegen delen een hoge mate van gelijkenis met mensen, waardoor NHP-modellen het meest geschikt zijn voor het onderzoek naar RD-pathogenese en therapieontwikkeling.
In deze studie hebben we een in vitro NHP-model opgesteld door retinale explantaten van makaken te kweken. Vergeleken met routinematige eencellige primaire cultuur en een in vitro cultuur van onsterfelijke cellijnen, kan een in vitro retinale explantcultuur retinale weefselconformatie en intercellulaire interacties behouden, wat een betere simulatie van in vivo omstandigheden mogelijk maakt. Bovendien vermindert het grotendeels het aantal gebruikte dieren en verkort het de experimentele duur, en biedt het een relatief controleerbare experimentele benadering voor het onderzoeken van de effecten van verschillende factoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling of degeneratie van het netvlies.
Succesvolle voorbereiding van retinale explantaten is cruciaal voor de succesvolle oprichting van in vitro retinale modellen. Op basis van onze eerdere onderzoekservaring met het voorbereiden van retinale explantaten voor muizen, vatten we hier enkele belangrijke punten samen voor de voorbereiding van retinale explantatiepreparaten van apen:
1) Explantatievoorbereiding moet zo snel mogelijk na het offeren en enucleeren van dieren worden uitgevoerd. Het gebruik van een weefselopslagoplossing voor oogbolopslag vóór gebruik in explantatiepreparaat wordt aanbevolen omdat het een beter onderhoud van de levensvatbaarheid van de cel mogelijk maakt in vergelijking met fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
2) Gezien de grote omvang van apenoogballen en de lange perioden van blootstelling aan externe omgeving, kan het wassen van de oogbollen met verdunde povidonjodofor en een dubbele antibioticumoplossing voorafgaand aan de retinale explantatievoorbereiding verontreinigingen verminderen. Het wassen mag echter niet te lang duren. De toevoeging van antibiotica tijdens explantatiekweek wordt niet aanbevolen omdat dit de levensvatbaarheid van de cel kan beïnvloeden.
3) Enucleated oogbollen werden onderworpen aan een sequentiële scheiding van de sclera, hoornvlies, iris, lens en glasachtig lichaam gevolgd door het snijden van het netvlies. In tegenstelling tot muizenoogbollen, die klein zijn en waarin de sclera en uvea stevig aan elkaar zijn bevestigd, zijn apenoogballen relatief groot en bezitten ze een taaie sclera en suprachoroïdale ruimte. Daarom is een schaar nodig voor de scheiding van de sclera. Hoewel dit geen moeilijke stap is in de behandeling van enucleated apenoogballen, moet voorzichtigheid worden betracht om te voorkomen dat het netvlies en de uvea worden beschadigd. Bovendien moet het taaie opschortende ligament van de apenlens met een schaar worden geknipt voordat de lens zorgvuldig wordt verwijderd. Scheiding van het glasachtig lichaam is een van de meest tijdrovende stappen van het explantatievoorbereidingsproces vanwege de grote glasvochtkamer van het apenoog, de hoge viscositeit van het glasachtig lichaam en de stevige hechting van het glasachtig lichaam met het netvlies bij apen van 1-3 jaar. Het glasachtig lichaam werd zoveel mogelijk verwijderd met een schaar en een pipet werd gebruikt om de daaropvolgende overdracht en kweek van de retinale explantaten te vergemakkelijken. We zijn momenteel bezig met het verkennen van snellere en effectievere methoden voor het verwijderen van glasvocht. Retinale explantaten (5 mm) werden gesneden met behulp van trephinemessen om consistentie te garanderen in de grootte van de explantaten verkregen van verschillende locaties (locatiekenmerken: vier kwadranten in de periferie, 6 mm in het midden). Tijdens de overdracht van explantaten naar kweekinzetstukken kunnen het netvlies en het vaatvlies gescheiden raken. Daarom is een voorzichtige en wendbare behandeling vereist om ervoor te zorgen dat de explantaten tijdens de eerste poging zelf worden overgebracht, omdat herhaalde pogingen schade aan het netvlies kunnen veroorzaken. Ten slotte moet mechanische schade zoveel mogelijk worden geminimaliseerd tijdens het gehele voorbereidingsproces van de retinale explantatie om beschadiging van de retinale structuur te voorkomen. De tijd die nodig is voor explantatievoorbereiding moet ook worden geminimaliseerd om onbedoelde celdood te voorkomen.
4) Retinale explantatiecultuur werd uitgevoerd met explantaten die het retina-RPE-choroïde complex bevatten. Vergeleken met de in vitro kweek van retinale cellen met behulp van het netvlies zonder de aangehechte RPE en het vaatvlies, zorgt onze explantatiecultuur voor een betere celoverleving en verlengt dienovereenkomstig de overleving van fotoreceptorcellen. Tijdens het kweekproces is het netvlies naar boven gericht en het vaatvlies naar beneden. In vergelijking met retinale explantaten van muizen zijn retinale explantaten van apen groter, wat hogere eisen stelt aan cultuurvoeding. Daarom voerden we dagelijkse veranderingen in het kweekmedium uit voor de apen retinale explantcultuur in plaats van een kweekmediumveranderingsfrequentie van eens in de 2 dagen aan te nemen, die eerder werd gebruikt voor de retinale explantcultuur van de muis.
Samen hebben we een in vitro NHP-model opgesteld door de kweek van de retinale explantaten van makaken en hun behandeling met zaprinast om de cGMP-PKG-signaleringsroute te induceren die vergelijkbaar is met die waargenomen in RD-pathogenese. Zaprinast is een PDE6-remmer en PDE6 handhaaft de balans van de intracellulaire concentratie van cGMP die PKG17,18 activeert. De cGMP-PKG-route kan oxidatieve fosforylering en mitochondriale routes negatief reguleren, waardoor retinale degeneratie wordt beïnvloed19. De inductie van de cGMP-PKG signaleringsroute in dit in vitro NHP retinale model vestigt het als een gunstig model voor toekomstig onderzoek naar de pathogenese van RD, evenals voor de ontwikkeling en toxicofarmacologische testen van nieuwe geneesmiddelen voor RD-behandeling. Niettemin heeft het gebruik van dit model enkele beperkingen, met name de relatief korte kweektijden en de relatief hoge kosten voor primaten. Tijdens ons toekomstig onderzoek zal dit in vitro model worden gebruikt voor de post-interventie functionele evaluatie van het netvlies met behulp van MEA en μERG. Informatie en cellulaire locaties van PKG-doelen zullen worden gecombineerd met de meting van activiteiten van downstream-effectoren (bijv. calpain, PARP en HDAC) en onderzoek naar de relevante neurodegeneratieve mechanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr. 81960180), de Zinke heritage foundation en de Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). We danken Prof. Longbao Lv (Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming, China) voor het delen van de apenoogballen die in deze studie zijn gebruikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
