Summary
Des explants rétiniens obtenus à partir de macaques de type sauvage ont été cultivés in vitro. La dégénérescence rétinienne et la voie de signalisation cGMP-PKG ont été induites à l’aide de l’inhibiteur de la PDE6 zaprinast. L’accumulation de GMPc dans les explants à différentes concentrations de zaprinast a été vérifiée par immunofluorescence.
Abstract
La dégénérescence rétinienne héréditaire (DR) est caractérisée par la mort progressive des cellules photoréceptrices. La suractivation de la voie cyclique de la protéine kinase dépendante de la guanosine monophosphate (GMPc) dans les cellules photoréceptrices provoque la mort des cellules photoréceptrices, en particulier chez les modèles porteurs de mutations de la phosphodiestérase 6b (PDE6b). Des études antérieures sur la DR ont utilisé principalement des modèles murins tels que les souris rd1 ou rd10. Compte tenu des différences génétiques et physiologiques entre les souris et les humains, il est important de comprendre dans quelle mesure les rétines des primates et des rongeurs sont comparables. Les macaques partagent un haut niveau de similitude génétique avec les humains. Par conséquent, des macaques de type sauvage (âgés de 1 à 3 ans) ont été sélectionnés pour la culture in vitro d’explants rétiniens comprenant le complexe épithélium pigmentaire rétinien-rétinien-choroïde. Ces explants ont été traités avec différentes concentrations de zaprinaste, inhibiteur de la PDE6, pour induire la voie de signalisation cGMP-PKG et simuler la pathogenèse de la RD. L’accumulation de GMPc et la mort cellulaire dans les explants rétiniens de primates ont ensuite été vérifiées à l’aide de l’immunofluorescence et du test TUNEL. Le modèle rétinien des primates établi dans cette étude peut servir à des études pertinentes et efficaces sur les mécanismes de la DR dépendante des GMPc-PKG, ainsi qu’au développement d’approches thérapeutiques futures.
Introduction
La dégénérescence rétinienne héréditaire (DR) est caractérisée par la mort progressive des cellules photoréceptrices et est causée par des mutations dans une grande variété de gènes pathogènes1. Le résultat final de la RD est la perte de vision et dans la grande majorité des cas, la maladie reste incurable à ce jour. Par conséquent, il est important d’étudier les mécanismes cellulaires conduisant à la mort des photorécepteurs en utilisant des modèles qui représentent fidèlement l’état pathologique humain. Ici, les modèles à base de primates sont particulièrement intéressants en raison de leur proximité avec les humains. Notamment, de tels modèles peuvent faire progresser le développement d’interventions thérapeutiques appropriées qui peuvent arrêter ou retarder la mort des cellules photoréceptrices.
Des recherches antérieures sur les mécanismes de la mort cellulaire dans la RD ont démontré que la diminution ou la perte de l’activité de la phosphodiestérase 6 (PDE6) causée par des mutations génétiques déclenchant la RD entraîne une hydrolyse réduite de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc)2,3. cGMP est un agoniste spécifique des canaux ioniques cycliques dépendants des nucléotides (CNGC) dans les segments externes des bâtonnets (ROS) et est également une molécule clé responsable de la conversion des signaux lumineux en signaux électriques dans les cellules photoréceptrices des vertébrés4. L’hydrolyse réduite des GMPc provoque l’accumulation de GMPc dans les ROM, conduisant à l’ouverture des CGNCc 5. Par conséquent, les voies de phototransduction sont activées, ce qui entraîne une augmentation des concentrations de cations dans les cellules photoréceptrices. Ce processus impose une charge métabolique aux photorécepteurs qui, lorsqu’ils sont suractivés, par exemple par des mutations de la PDE6, peuvent provoquer la mort cellulaire.
De nombreuses études ont montré qu’une suraccumulation significative de GMPc dans les photorécepteurs de modèles murins présentant différentes mutations du gène RD peut provoquer l’activation de la protéine kinase dépendante du GMPc (PKG)3,6. Cela conduit à une augmentation substantielle des cellules TUNEL-positives mourantes et à un amincissement progressif de la couche de cellules photoréceptrices. Des études antérieures suggèrent que la suractivation de la PKG causée par des taux élevés de BPFc est une condition nécessaire et suffisante pour l’induction de la mort cellulaire photoréceptrice 2,5. Des études sur différents modèles murins de DR ont également montré que l’activation de la PKG induite par des niveaux élevés de GMPc dans les photorécepteurs entraîne une suractivation des effecteurs en aval tels que la poly-ADP-ribose polymérase 1 (PARP1), l’histone désacétylase (HDAC) et lacalpaïne 2,7,8,9. Cela implique des associations causales entre ces différentes protéines cibles et la mort cellulaire photoréceptrice.
Cependant, les recherches antérieures sur la pathologie, la toxicopharmacologie et la thérapie de la DR étaient principalement basées sur des modèles murins pour DR10,11,12. Néanmoins, d’immenses difficultés subsistent dans la traduction clinique de ces résultats. Cela est dû aux différences génétiques et physiologiques considérables entre les souris et les humains, en particulier en ce qui concerne la structure rétinienne. En revanche, les primates non humains (PNH) partagent également un degré élevé de similitude avec les humains en ce qui concerne les caractéristiques génétiques, les schémas physiologiques et la régulation des facteurs environnementaux. Par exemple, la thérapie optogénétique a été étudiée comme moyen de restaurer l’activité rétinienne dans un modèle de PSN13. Lingam et ses collègues ont démontré que les cellules précurseurs photorétiniennes dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et de qualité professionnelle peuvent sauver les dommages causés par les photorécepteurs coniques dans le NHP14. Par conséquent, les modèles de PSN sont importants pour l’exploration de la pathogenèse DR et la mise au point de méthodes de traitement efficaces. En particulier, les modèles de DR des PSN, présentant des mécanismes pathogènes semblables à ceux des humains, pourraient jouer un rôle essentiel dans les études sur le développement et l’analyse toxicopharmacologique in vivo de nouveaux médicaments.
Compte tenu du long cycle de vie, du niveau élevé de difficultés techniques et du coût élevé de l’établissement de modèles de primates in vivo, nous avons établi un modèle in vitro de primates non humains (PNH) en utilisant des cultures de rétine de macaque explanté. Tout d’abord, des macaques de type sauvage âgés de 1 à 3 ans ont été sélectionnés pour la culture in vitro d’explants rétiniens, qui comprenaient le complexe rétine-RPE-choroïde. Les explants ont ensuite été traités avec différentes concentrations de zaprinaste, inhibiteur de la PDE6 (100 μM, 200 μM et 400 μM) pour induire la voie de signalisation cGMP-PKG. La mort cellulaire des photorécepteurs a été quantifiée et analysée à l’aide du test TUNEL, et l’accumulation de BPF dans les explants a été vérifiée par immunofluorescence. Compte tenu du degré élevé de similitude en ce qui concerne la distribution cellulaire et la morphologie, l’épaisseur de la couche rétinienne et d’autres caractéristiques physiologiques de la rétine entre les singes et les humains, l’établissement de la voie de signalisation cGMP-PKG dans le modèle rétinien in vitro pourrait faciliter les recherches futures sur la pathogenèse de la DR ainsi que les études sur le développement et la toxicopharmacologie de nouveaux médicaments pour le traitement de la DR.
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Protocol
L’étude sur les animaux a été examinée et approuvée par le Comité d’examen éthique de l’Institut de zoologie de l’Académie chinoise des sciences (IACUC-PE-2022-06-002), ainsi que par l’examen de l’éthique animale et le protocole animal de l’Université du Yunnan (YNU20220149).
1. Préparation des explants rétiniens
- Obtenir des globes oculaires de primates de macaques de type sauvage, âgés de 1 à 3 ans, stocker dans une solution de stockage de tissus et les transporter sur la glace dans les 3 heures suivant l’énucléation après le sacrifice des singes ou après leur mort naturelle.
- Pour la préparation de la solution de protéinase K, dissoudre 25 mg de protéinase K dans 250 μL d’eau distillée, puis ajouter 225 μL de la solution à 18,5 mL de milieu basal (R16).
- Lavez les globes oculaires dans 10 mL de povidone iodée à 5 % (povidone-iode : eau = 1:19) pendant 30 s et trempez-les dans une solution saline tamponnée à 5 % de pénicilline/streptomycine (PEN/STREP):p hosphate-buffered = 1:19 pendant 1 min pour éviter la contamination bactérienne. Ensuite, incuber les globes oculaires dans 10 ml de milieu R16 pendant 5 min.
- Préchauffer la solution de protéinase K dans un incubateur à 37 °C. Ensuite, plongez les globes oculaires dans 10 ml de solution de protéinase K et incuber pendant 2 min. Plongez les globes oculaires dans 10 ml de solution de sérum fœtal bovin R16 + fœtal (1:1), incuber pendant 5 minutes, puis transférer les globes oculaires sur 10 ml de R16 frais pour un lavage final.
- Séparez la sclérotique, la cornée, l’iris, le cristallin et le corps vitreux, et coupez la rétine de 4 côtés avec une pince à épiler et des ciseaux (Figure 1A-L).
- Couper les explants rétiniens avec lames de tréphine en cinq sections - une lame de tréphine de 4 mm pour la face nasale / temporale / supérieure / inférieure et une lame de tréphine de 6 mm pour la face centrale (contenant un disque optique et de la macula; Figure 1M-O). Couper à la distance suivante de la tête du nerf optique: 1,5 mm pour le nasal, 4 mm pour le temporal et 2 mm pour le côté supérieur et inférieur.
- Transférer les explants de rétine (contenant la rétine et la choroïde) avec un abaisse-paupière et les placer au milieu de l’insert, côté photorécepteur vers le haut (Figure 1P). Placer environ 1 mL de milieu complet (R16 supplémenté en BSA, transferrine, progestérone, insuline, T3, corticostérone, vitamine B1, vitamine B12, rétinol, acétate de rétinyle, DL-tocophérol, acétate de tocophéryle, acide linoléique, L-cystéine HCl, glutathion, glutamine, vitamine C) sous la membrane de la plaque pour couvrir complètement la rétine.
2. Culture d’explant rétinien de primates
- Culture d’explants rétiniens en milieu complet et placer dans un incubateur à 37 °C aéré avec 5% de CO2 humidifié.
- Appliquer un traitement médicamenteux à la concentration appropriée sur le milieu de culture rétinienne (p. ex. zaprinast à des concentrations de 100 μM, 200 μM ou 400 μM). Utiliser au moins trois explants par condition de traitement et utiliser des explants sans médicament comme témoin. Traiter avec un médicament pendant 4 jours.
3. Fixation et cryo-sectionnement
- Incuber les explants rétiniens avec 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) pendant 45 min, les rincer brièvement avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis incuber avec 10 % de saccharose pendant 10 min, 20 % de saccharose pendant 20 min et 30 % de saccharose pendant 30 min (1 mL pour chaque explant de rétine).
- Couper les explants rétiniens à l’aide de lames de tréphine pour assurer la cohérence de la taille des explants obtenus à partir de différents sites présentant les caractéristiques suivantes: quatre quadrants en périphérie, 6 mm au centre. Ensuite, transférer les explants rétiniens dans une boîte en fer blanc (environ 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) avec un milieu d’enrobage O.C.T. pour couvrir le tissu. Immédiatement, congeler les sections de tissu dans de l’azote liquide et les placer dans un réfrigérateur à -20 °C pour les conserver.
- Utilisez une lame tranchante pour couper la gélose en un petit bloc contenant l’échantillon de tissu, coupez les blocs d’échantillon en sections de 10 μm et placez-les sur des lames de microscope à adhésion à l’aide d’une brosse douce. Ensuite, sécher pendant 45 min à 40 °C et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
4. Immunohistochimie (figure 2)
- Coloration cGMP
- Sécher les lames et dessiner un anneau hydrophobe autour des sections rétiniennes avec un stylo bloqueur de liquide pour couvrir les échantillons.
- Plonger les lames dans 200 μL de solution saline tampon phosphate à 0,3 % et Triton X-100 par lame (PBST) pendant 10 min à température ambiante, puis dans une solution de blocage (5 % de sérum normal d’âne, 0,3 % de PBST, 1 % de BSA, 200 μL par lame) pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber les échantillons pendant une nuit avec l’anticorps primaire (1:250, anti-GMPc de mouton, 200 μL par lame) préparé dans la solution de blocage à 4 °C, puis rincer avec du PBS pendant 10 min (200 μL par lame) 3x.
- Incuber les échantillons avec l’anticorps secondaire (1:300, âne anti mouton Alxea Fluor 488, 200 μL par lame) pendant 1 h à température ambiante, puis rincer avec du PBS pendant 10 min, 3x. Couvrir les échantillons d’un support de montage antidécoloration contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et conserver à 4 °C pendant au moins 30 minutes avant l’imagerie.
- Coloration TUNEL
- Sécher les lames à température ambiante pendant 15 minutes et dessiner un anneau barrière hydrofuge autour des échantillons de tissu rétinien avec le stylo bloqueur de liquide, puis les incuber dans 40 ml de PBS pendant 15 minutes.
- Incuber les lames dans 42 mL (par cinq lames) de TBS (0,05 M Tris-buffer) à 37 °C. Aspirer le TBS et incuber les échantillons avec 6 μL de protéinase K pendant 5 min. Ensuite, lavez les lames 3x avec TBS pendant 5 minutes à chaque fois.
- Exposer les lames à 40 mL de solution d’éthanol-acide acétique dans la chopline, couvrir d’une feuille transparente et incuber à -20 °C pendant 5 min. Lavez les lames 3x avec TBS pendant 5 min à chaque fois.
- Exposer les lames à une solution de blocage (1% BSA; 200-300 μL par lame selon les besoins) et incuber dans une chambre d’humidité pendant 1 h.
- Préparer la solution de la trousse TUNEL, TMR rouge, dans la proportion suivante : 62,50 μL de solution de blocage (1 % BSA), 56,25 μL de solution de marquage (TMR-dUTP) et 6,25 μL de l’enzyme (proportion pour chaque lame). Ajouter environ 130 μL de cette solution par lame et incuber à 37 °C pendant 1 h. Ensuite, lavez les lames avec du PBS pendant 5 min (200 μL par lame), 2x.
- Placer des lames de couvercle contenant 1 à 2 gouttes de support de montage antidécoloration avec DAPI sur les échantillons, puis incuber les lames à 4 °C pendant au moins 30 minutes avant l’imagerie.
- coloration cGMP combinée à la coloration TUNEL
- La coloration cGMP a été suivie d’une coloration TUNEL. Suivez les étapes de coloration TUNEL de l’étape 4.2.1 à l’étape 4.2.5, puis continuez les étapes de coloration cGMP de l’étape 4.1.2 à l’étape 4.1.4.
- Effectuez la microscopie de lumière et de fluorescence avec les paramètres de la caméra comme suit: temps d’exposition = 125 ms, taille du retour sur investissement = 2752 x 2208, couleur = noir et blanc. Capturez des images à l’aide du logiciel. Imaginez quatre champs différents avec un appareil photo numérique à un grossissement de 20x de chaque section et obtenez des images représentatives des zones centrales de la rétine en utilisant DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), avec balayage Z-Stack ayant un intervalle = 1 μm et facultatif = 1,251 μm.
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Representative Results
Dans cette étude, une culture d’explant rétinienne de singe macaque a été réalisée à l’aide d’explants contenant le complexe rétine-EPR-choroïde (Figure 1, Figure supplémentaire S1). Par rapport à la culture in vitro de cellules rétiniennes utilisant la rétine sans l’EPR et la choroïde attachés, notre culture d’explantation facilite une meilleure survie cellulaire et, par conséquent, prolonge la survie des cellules photoréceptrices.
Nous avons utilisé différentes concentrations de zaprinaste, un inhibiteur de la PDE6 (100 μM, 200 μM et 400 μM ; Figure supplémentaire S2) pour induire une accumulation de GMPc dans les photorécepteurs et une activation ultérieure de PKG in vitro. Chaque traitement de concentration a été administré pendant 4 jours, respectivement. Le traitement du modèle rétinien in vitro avec du zaprinast 400 μM a montré le plus grand nombre de cellules TUNEL-positives, un signal GMPc significatif et une faible toxicité pour l’EPR et les cellules neuronales de la rétine interne. La forte proportion de cellules TUNEL-positives dans la figure 2 suggère que l’augmentation de l’activité cGMP peut améliorer la dégénérescence des cellules rétiniennes induite par le zaprinaste et que l’accumulation de GMPc joue un rôle dans la dégénérescence des photorécepteurs. Le modèle de dégénérescence rétinienne des macaques établi dans cette étude servira à des recherches approfondies sur les mécanismes de la RP dépendante des GMPc-PKG.
Figure 1 : Processus de production de la culture d’explants rétiniens chez des macaques âgés de 1 an. (A-L) Séparez la sclérotique, la cornée, l’iris, le cristallin et le corps vitreux, et coupez la rétine des quatre côtés avec une pince à épiler et des ciseaux. (M-O) Couper les explants rétiniens avec des lames de tréphine en cinq sections - une lame de tréphine de 4 mm pour le côté nasal / temporel / supérieur / inférieur et une lame de tréphine de 6 mm pour le côté central (contenant un disque optique et une macula). (P) Transférer les explants rétiniens (contenant la rétine et la choroïde) papillon ouvert à la membrane et placer la membrane sur une plaque de culture à 6 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Évaluation des activités BPFc au sein de l’ONL des explants rétiniens de singe âgé de 1 an. Les explants ont été traités avec différentes concentrations de zaprinaste, inhibiteur de la PDE6 (100 μM, 200 μM et 400 μM). Le nombre de cellules positives TUNEL (rouge) et cGMP (vert) dans les trois concentrations différentes a été fortement augmenté dans ONL par rapport au contrôle (A-D). Par rapport au groupe témoin, les cellules TUNEL/cGMP-positives présentent des différences significatives dans les groupes 100 μM, 200 μM et 400 μM. Les noyaux ont été colorés avec DAPI (bleu). Une zone de la rétine traitée avec 400 μM de zaprinaste a été agrandie pour observer des cellules positives cGMP (vert) et TUNEL (rouge) seules, ainsi qu’une image fusionnée. Les barres d’erreur représentent l’écart-type (ET); * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; = p ≤ 0,001; = p ≤ 0,0001. Abréviations : GCs = cellules ganglionnaires, INL = couche nucléaire interne, ONL = couche nucléaire externe, RPE = épithélium pigmentaire rétinien, GMPc = guanosine monophosphate cyclique, PDE6 = phosphodiestérase 6. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Localisation des poinçons rétiniens utilisés pour les cultures d’explantation. Les explants dérivés des coups nasaux étaient situés à 1,5 mm de la tête du nerf optique, alors que cette distance était de 4 mm pour les poinçons temporels et de 2 mm pour les poinçons supérieurs et inférieurs, respectivement. Les explants rétiniens ont été obtenus par coupe avec des lames de tréphine à cinq endroits - une lame de tréphine de 4 mm pour la face nasale / temporale / supérieure / inférieure et une lame de tréphine de 6 mm pour la face centrale (contenant un disque optique et de la macula). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : coloration TUNEL pour les cellules mourantes. Rétine de contrôle (A) et rétines traitées par Zaprinast à des concentrations de 100 μM, 200 μM ou 400 μM (B-D). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La phototransduction visuelle fait référence au processus biologique par lequel les signaux lumineux sont convertis en signaux électriques par les cellules photoréceptrices dans la rétine de l’œil. Les cellules photoréceptrices sont des neurones polarisés capables de phototransduction, et il existe deux types différents de photorécepteurs appelés bâtonnets et cônes d’après les formes de leurs segments externes. Les bâtonnets sont responsables de la vision scotopique et les cônes sont responsables de la vision photopique et de haute acuité. La RD héréditaire concerne les maladies neurodégénératives caractérisées par la mort progressive des cellules photorétiniennes15.
Les recherches actuelles sur la DR sont principalement basées sur des modèles murins de DR, y compris des cultures d’explants rétiniens in vitro dérivées de modèles murinsde DR 16. Cependant, il existe des différences génétiques et physiologiques considérables, en particulier dans la structure rétinienne, entre les souris et les humains. En revanche, les PSN partagent un degré élevé de similitude avec les humains, ce qui rend les modèles de PSN plus appropriés pour l’étude de la pathogenèse de la DR et le développement de thérapies.
Dans cette étude, nous avons établi un modèle de PSN in vitro en cultivant des explants rétiniens de macaques. Par rapport à une culture primaire unicellulaire de routine et à une culture in vitro de lignées cellulaires immortalisées, une culture d’explant rétinienne in vitro peut préserver la conformation des tissus rétiniens et les interactions intercellulaires, ce qui permet une meilleure simulation des conditions in vivo . En outre, il réduit considérablement le nombre d’animaux utilisés et raccourcit la durée expérimentale, et fournit une approche expérimentale relativement contrôlable pour étudier les effets de divers facteurs impliqués dans le développement ou la dégénérescence de la rétine.
La préparation réussie des explants rétiniens est cruciale pour la réussite de l’établissement de modèles rétiniens in vitro . Sur la base de notre expérience de recherche antérieure dans la préparation d’explants rétiniens pour les souris, nous résumons ici plusieurs points clés pour la préparation d’explants rétiniens de singe:
1) La préparation explant doit être effectuée dès que possible après le sacrifice d’animaux et l’énucléation. L’utilisation d’une solution de stockage des tissus pour le stockage du globe oculaire avant utilisation dans la préparation d’explant est recommandée car elle permet un meilleur maintien de la viabilité cellulaire par rapport à la solution saline tamponnée au phosphate.
2) Compte tenu de la grande taille des globes oculaires de singe et des longues périodes d’exposition à l’environnement externe, le lavage des globes oculaires avec de la povidone iodophor diluée et une solution antibiotique double avant la préparation d’explant rétinien peut réduire les contaminations. Cependant, le lavage ne doit pas être effectué pendant une durée excessivement longue. L’ajout d’antibiotiques pendant la culture explant n’est pas recommandé car il peut affecter la viabilité cellulaire.
3) Les globes oculaires énucléés ont été soumis à une séparation séquentielle de la sclérotique, de la cornée, de l’iris, du cristallin et du corps vitré, suivie d’un tranchage de la rétine. Contrairement aux globes oculaires de souris, qui sont petits et dans lesquels la sclérotique et l’uvée sont étroitement attachées l’une à l’autre, les globes oculaires de singe sont relativement grands et possèdent une sclérotique dure et un espace suprachoroïdien. Par conséquent, des ciseaux sont nécessaires pour la séparation de la sclérotique. Bien que ce ne soit pas une étape difficile dans la manipulation des globes oculaires de singe énucléés, des précautions doivent être prises pour éviter d’endommager la rétine et les uvées. De plus, le ligament suspenseur dur de la lentille du singe doit être coupé avec des ciseaux avant le retrait soigneux de la lentille. La séparation du corps vitré est l’une des étapes les plus longues du processus de préparation de l’explant en raison de la grande chambre vitrée de l’œil de singe, de la viscosité élevée du corps vitré et de la ferme fixation du corps vitré avec la rétine chez les singes âgés de 1 à 3 ans. Le corps vitré a été enlevé dans toute la mesure du possible à l’aide de ciseaux et une pipette a été utilisée pour faciliter le transfert ultérieur et la culture des explants rétiniens. Nous sommes actuellement en train d’explorer des méthodes plus rapides et plus efficaces pour l’élimination du corps vitré. Les explants rétiniens (5 mm) ont été découpés à l’aide de lames de tréphine pour assurer la cohérence de la taille des explants obtenus à partir de différents sites (caractéristiques du site : quatre quadrants en périphérie, 6 mm au centre). Lors du transfert des explants vers des inserts de culture, la rétine et la choroïde peuvent se séparer. Par conséquent, une manipulation douce et agile est nécessaire pour s’assurer que les explants sont transférés lors de la première tentative elle-même, car des tentatives répétées peuvent causer des dommages à la rétine. Enfin, les dommages mécaniques doivent être minimisés dans toute la mesure du possible pendant tout le processus de préparation de l’explant rétinien afin d’éviter d’endommager la structure rétinienne. Le temps nécessaire à la préparation des explants doit également être réduit au minimum pour éviter la mort cellulaire accidentelle.
4) La culture d’explants rétiniens a été réalisée en utilisant des explants contenant le complexe rétine-RPE-choroïde. Par rapport à la culture in vitro de cellules rétiniennes utilisant la rétine sans l’EPR et la choroïde attachés, notre culture explant permet une meilleure survie cellulaire et prolonge par conséquent la survie des cellules photoréceptrices. Pendant le processus de culture, la rétine est orientée vers le haut et la choroïde vers le bas. Par rapport aux explants rétiniens de souris, les explants rétiniens de singe sont de plus grande taille, ce qui impose de plus grandes exigences en matière de nutrition de culture. Par conséquent, nous avons effectué des changements quotidiens du milieu de culture pour la culture d’explantation rétinienne de singe au lieu d’adopter une fréquence de changement de milieu de culture d’une fois tous les 2 jours, qui était utilisée précédemment pour la culture d’explantation rétinienne de souris.
Ensemble, nous avons établi un modèle de PSN in vitro grâce à la culture des explants rétiniens de macaques et à leur traitement au zaprinast pour induire la voie de signalisation cGMP-PKG similaire à celle observée dans la pathogenèse RD. Zaprinast est un inhibiteur de la PDE6, et la PDE6 maintient l’équilibre de la concentration intracellulaire de GMPc qui active PKG17,18. La voie cGMP-PKG peut réguler négativement la phosphorylation oxydative et les voies mitochondriales, affectant ainsi la dégénérescence rétinienne19. L’induction de la voie de signalisation cGMP-PKG dans ce modèle rétinien NHP in vitro en fait un modèle favorable pour les recherches futures sur la pathogenèse de la DR, ainsi que pour le développement et les tests toxicopharmacologiques de nouveaux médicaments pour le traitement de la DR. Néanmoins, l’utilisation de ce modèle présente certaines limites, notamment ses périodes de culture relativement courtes et les coûts relativement élevés pour les primates. Au cours de nos recherches futures, ce modèle in vitro sera utilisé pour l’évaluation fonctionnelle post-intervention de la rétine à l’aide de MEA et μERG. L’information et les emplacements cellulaires des cibles PKG seront combinés à la mesure des activités des effecteurs en aval (p. ex. calpaïne, PRAP et HDAC) et à des recherches sur les mécanismes neurodégénératifs pertinents.
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Disclosures
Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81960180), de la Fondation du patrimoine Zinke et de la Fondation Charlotte et Tistou Kerstan, Centre médical clinique de la maladie oculaire du Yunnan (ZX2019-02-01). Nous remercions le professeur Longbao Lv (Institut de zoologie, Académie chinoise des sciences, Kunming, Chine) d’avoir partagé les globes oculaires de singe utilisés dans cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
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| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
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