Summary
צמחי רשתית שהתקבלו מקופי מקוק מסוג בר תורבתו במבחנה. ניוון הרשתית ומסלול האיתות cGMP-PKG הושרו באמצעות מעכב PDE6 zaprinast. הצטברות cGMP בצמחים בריכוזי זפרינזט שונים אומתה באמצעות אימונופלואורסנציה.
Abstract
ניוון רשתית תורשתי (RD) מאופיין במוות מתקדם של תאי קולטני אור. הפעלת יתר של מסלול החלבון המחזורי גואנוזין מונופוספט (cGMP) התלוי בקינאז (PKG) בתאי פוטורצפטור גורמת למוות של תאים קולטי אור, במיוחד במודלים המכילים מוטציות פוספודיאסטראז 6b (PDE6b). מחקרים קודמים על RD השתמשו בעיקר במודלים מורינים כגון עכברי rd1 או rd10 . בהתחשב בהבדלים הגנטיים והפיזיולוגיים בין עכברים לבני אדם, חשוב להבין באיזו מידה ניתן להשוות את הרשתיות של פרימטים ומכרסמים. קופי מקוק חולקים רמה גבוהה של דמיון גנטי עם בני אדם. לכן, קופי מקוק מסוג בר (בגילאי 1-3 שנים) נבחרו לתרבית במבחנה של צמחי רשתית שכללה את קומפלקס אפיתל פיגמנט רשתית (RPE)-כורואידים. צמחים אלה טופלו בריכוזים שונים של מעכב PDE6 zaprinast כדי לגרום למסלול האיתות cGMP-PKG ולדמות פתוגנזה של RD. הצטברות cGMP ומוות תאים בצמחי רשתית של פרימטים אומתו לאחר מכן באמצעות immunofluorescence ובדיקת TUNEL. מודל רשתית הפרימטים שנקבע במחקר זה עשוי לשמש למחקרים רלוונטיים ויעילים על המנגנונים של RD תלוי cGMP-PKG, כמו גם לפיתוח גישות טיפול עתידיות.
Introduction
ניוון רשתית תורשתי (RD) מאופיין במוות מתקדם של תאי קולטני אור ונגרם על ידי מוטציות במגוון רחב של גנים פתוגניים1. התוצאה הסופית של RD היא אובדן ראייה וברוב המכריע של המקרים המחלה נותרה בלתי ניתנת לטיפול עד עצם היום הזה. לכן, חשוב לחקור את המנגנונים התאיים המובילים למוות של קולטני אור באמצעות מודלים המייצגים נאמנה את מצב המחלה האנושי. כאן, מודלים מבוססי פרימטים מעניינים במיוחד בשל קרבתם לבני אדם. יש לציין כי מודלים כאלה עשויים לקדם את הפיתוח של התערבויות טיפוליות מתאימות שיכולות לעצור או לעכב מוות של תאים קולטי אור.
מחקרים קודמים על מנגנוני מוות תאי ב- RD הוכיחו כי ירידה או אובדן של פעילות פוספודיאסטראז 6 (PDE6) הנגרמת על ידי מוטציות בגן מפעיל RD מובילה להידרוליזה מופחתת של מונופוספט גואנוזין מחזורי (cGMP)2,3. cGMP הוא אגוניסט ספציפי של תעלות היונים המגודרות בנוקלאוטידים מחזוריים (CNGCs) במקטעים החיצוניים של המוט (ROSs) והוא גם מולקולת מפתח האחראית להמרת אותות אור לאותות חשמליים בתאי קולטני אור בעלי חוליות4. הידרוליזה מופחתת של cGMP גורמת להצטברות של cGMP ב-ROSs, מה שמוביל לפתיחת CNGCs 5. כתוצאה מכך, מסלולי פוטוטרנסדוקציה מופעלים, וכתוצאה מכך עלייה בריכוזי קטיון בתאים קולטי אור. תהליך זה מטיל עומס מטבולי על פוטורצפפטורים, אשר כאשר מופעלים יתר על המידה, למשל, על ידי מוטציות ב- PDE6, עלולים לגרום למוות תאי.
מחקרים רבים הראו כי הצטברות יתר משמעותית של cGMP בפוטורצפטורים של מודלים עכבריים עם מוטציות שונות בגן RD עלולה לגרום להפעלה של חלבון קינאז תלוי cGMP (PKG)3,6. זה מוביל לעלייה משמעותית בתאים גוססים, חיוביים TUNEL ודילול הדרגתי של שכבת התא photoreceptor. מחקרים קודמים מצביעים על כך שהפעלת יתר של PKG הנגרמת על ידי רמות cGMP גבוהות היא תנאי הכרחי ומספיק להשראת מוות תאי קולטני אור 2,5. מחקרים על מודלים שונים של RD בעכברים הראו גם כי הפעלת PKG הנגרמת על ידי רמות cGMP גבוהות בפוטורצפטורים, מובילה להפעלת יתר של גורמים משפיעים במורד הזרם, כגון פולי-ADP-ריבוז פולימראז 1 (PARP1), היסטון דאצטילאז (HDAC) וקלפין 2,7,8,9. זה מרמז על קשרים סיבתיים בין חלבוני מטרה שונים אלה לבין מוות של תאים קולטי אור.
עם זאת, מחקרים קודמים על פתולוגיה, טוקסיקופרקולוגיה וטיפול ב- RD התבססו בעיקר על מודלים של עכברים עבור RD10,11,12. עם זאת, נותרו קשיים עצומים בתרגום הקליני של תוצאות אלה. זאת בשל ההבדלים הגנטיים והפיזיולוגיים הניכרים בין עכברים לבני אדם, במיוחד בכל הנוגע למבנה הרשתית. לעומת זאת, פרימטים לא אנושיים (NHPs) חולקים גם רמה גבוהה של דמיון עם בני אדם ביחס למאפיינים גנטיים, דפוסים פיזיולוגיים וויסות גורמים סביבתיים. לדוגמה, טיפול אופטוגנטי נחקר כאמצעי לשחזור פעילות הרשתית במודלNHP 13. לינגאם ועמיתיו הדגימו כי ייצור טוב של תאים מקדימים של קולטני אור ברשתית שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם עשוי להציל נזק לקולטני אור חרוט ב- NHP14. לכן, מודלים NHP חשובים לחקר פתוגנזה RD ופיתוח שיטות טיפול יעילות. בפרט, מודלים NHP של RD, המציגים מנגנונים פתוגניים דומים לאלה בבני אדם, יכולים לשחק תפקיד קריטי במחקרים על פיתוח וניתוח טוקסיקו-פרמקולוגיה in vivo של תרופות חדשות.
לאור מחזור החיים הארוך, הקשיים הטכניים הגבוהים והעלות הגבוהה הכרוכה בביסוס מודלים של פרימטים in vivo , הקמנו מודל של פרימטים לא אנושיים במבחנה (NHP) תוך שימוש בתרביות של רשתית מקוק מושתלת. ראשית, קופי מקוק מסוג בר בגילאי 1-3 שנים נבחרו לתרבית חוץ גופית של צמחי רשתית, שכללה את קומפלקס הרשתית-RPE-כורואידים. לאחר מכן טופלו צמחים בריכוזים שונים של מעכב PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM ו-400 μM) כדי לגרום למסלול האיתות cGMP-PKG. מוות תאי קולטני אור כומת ונותח באמצעות בדיקת TUNEL, והצטברות cGMP בצמחים אומתה באמצעות immunofluorescence. בהתחשב ברמת הדמיון הגבוהה ביחס לפיזור התאים ולמורפולוגיה, עובי שכבת הרשתית ומאפיינים פיזיולוגיים אחרים של הרשתית בין קופים לבני אדם, הקמת מסלול איתות cGMP-PKG במודל הרשתית במבחנה עשויה להקל על מחקר עתידי על הפתוגנזה של RD, כמו גם מחקרים על פיתוח וטוקסיקו-פרמקולוגיה של תרופות חדשות לטיפול ב- RD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר בבעלי חיים נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים (IACUC-PE-2022-06-002), וסקירת אתיקה של בעלי חיים ופרוטוקול בעלי חיים של אוניברסיטת יונאן (YNU20220149).
1. הכנת חצילים ברשתית
- השיגו גלגלי עיניים של פרימטים מקופי מקוק פראיים, בני שנה עד 3 שנים, אחסנו בתמיסת אחסון רקמות, והעבירו אותם על קרח תוך 3 שעות מרגע ההקרבה של הקופים או לאחר מוות טבעי.
- להכנת תמיסת פרוטאינאז K, ממיסים 25 מ"ג של פרוטאינאז K ב 250 מיקרוליטר של מים מזוקקים, ולאחר מכן מוסיפים 225 מיקרוליטר של התמיסה ל 18.5 מ"ל של מדיום בסיסי (R16).
- שטפו את גלגלי העיניים ב-10 מ"ל של 5% פובידון-יוד (פובידון-יוד: מים = 1:19) במשך 30 שניות וטבלו אותם במי מלח 5% פניצילין/סטרפטומיצין (PEN/STREP):p hosphate-buffered מלוחים = 1:19 למשך דקה אחת כדי למנוע זיהום חיידקי. לאחר מכן, לדגור את גלגלי העיניים ב 10 מ"ל של R16 בינוני במשך 5 דקות.
- מחממים מראש את תמיסת פרוטאינאז K באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לטבול את גלגלי העיניים ב 10 מ"ל של תמיסת proteinase K ולדגור במשך 2 דקות. לטבול את גלגלי העיניים בתמיסת 10 מ"ל של R16 + סרום בקר עוברי (1:1), לדגור במשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר את גלגלי העיניים ל 10 מ"ל של R16 טרי לשטיפה סופית.
- הפרידו את הסקלרה, הקרנית, הקשתית, העדשה וגוף הזגוגית, וחתכו את הרשתית מ-4 צדדים בעזרת פינצטה ומספריים (איור 1A-L).
- חותכים חצילי רשתית עם להבי טרפין לחמישה חלקים - להב טרפין 4 מ"מ לצד האף/טמפורלי/עליון/נחות ולהב טרפין 6 מ"מ לצד המרכזי (המכיל דיסק אופטי ומקולה; איור 1M-O). חתכו במרחק הבא מראש עצב הראייה: 1.5 מ"מ עבור האף, 4 מ"מ עבור הרקתי, ו -2 מ"מ עבור הצד העליון והתחתון.
- העבירו את צמחי הרשתית (המכילים רשתית וכורואיד) עם מדכא עפעפיים והניחו אותם במרכז החדרה, בצד הפוטורצפטור כלפי מעלה (איור 1P). יש להניח כ-1 מ"ל של מדיום מלא (R16 בתוספת BSA, טרנספרין, פרוגסטרון, אינסולין, T3, קורטיקוסטרון, ויטמין B1, ויטמין B12, רטינול, רטיניל אצטט, DL-טוקופרול, טוקופריל אצטט, חומצה לינולאית, L-ציסטאין הידרוכלוריד, גלוטתיון, גלוטמין, ויטמין C) מתחת לקרום על הצלחת כדי לכסות את הרשתית במלואה.
2. תרבית חציל רשתית פרימטים
- חציל רשתית תרבית בתווך מלא ומניחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס מאוורר עם לחות 5% CO2.
- יש למרוח טיפול תרופתי בריכוז מתאים על מדיום תרבית הרשתית (למשל, זפרינזט בריכוזים של 100 מיקרומטר, 200 מיקרומטר או 400 מיקרומטר). השתמש לפחות שלושה explants לכל תנאי טיפול ולהשתמש explants ללא תרופה כמו בקרה. לטפל עם התרופה במשך 4 ימים.
3. תיקון וחתך הקפאה
- לדגור על חצילים ברשתית עם 1 מ"ל של פאראפורמלדהיד (PFA) במשך 45 דקות, לשטוף אותם לזמן קצר עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), ולאחר מכן לדגור עם 10% סוכרוז במשך 10 דקות, 20% סוכרוז במשך 20 דקות, ו 30% סוכרוז במשך 30 דקות (1 מ"ל עבור כל חציל רשתית).
- חתכו צמחי רשתית באמצעות להבי טרפין כדי להבטיח עקביות בגודל הצמחים המתקבלים מאתרים שונים בעלי המאפיינים הבאים: ארבעה רבעים בפריפריה, 6 מ"מ במרכז. לאחר מכן, מעבירים את החצילים ברשתית לתוך קופסת פח (בערך 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ) עם מדיום הטבעה של O.C.T כדי לכסות את הרקמה. מיד, להקפיא את קטעי הרקמה בחנקן נוזלי ומניחים במקרר -20 מעלות צלזיוס לאחסון.
- השתמשו בלהב חד כדי לחתוך את האגר לגוש קטן המכיל את דגימת הרקמה, חתכו את גושי הדגימה למקטעים של 10 מיקרומטר, והניחו אותם על שקופיות מיקרוסקופ הידבקות באמצעות מברשת רכה. לאחר מכן, יבש במשך 45 דקות ב 40 ° C ואחסן ב -20 ° C עד לשימוש.
4. אימונוהיסטוכימיה (איור 2)
- צביעת cGMP (תנאי ייצור נאותים)
- יבשו את המגלשות וציירו טבעת הידרופובית סביב חלקי הרשתית בעזרת עט חוסם נוזלים לכיסוי הדגימות.
- יש לטבול שקופיות ב-200 מיקרוליטר של מי מלח במאגר פוספט 0.3% ו-Triton X-100 לכל מגלשה (PBST) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בתמיסת חסימה (5% סרום חמור רגיל, 0.3% PBST, 1% BSA, 200 μL לכל מגלשה) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- יש לדגור על הדגימות למשך הלילה עם הנוגדן הראשוני (1:250, כבשים נגד cGMP, 200 μL למגלשה) שהוכן בתמיסת החסימה בטמפרטורה של 4°C, ולאחר מכן לשטוף עם PBS במשך 10 דקות (200 μL לכל שקופית) 3x.
- יש לדגור על הדגימות עם נוגדן משני (1:300, חמור נגד כבשים Alxea Fluor 488, 200 μL לכל מגלשה) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף עם PBS במשך 10 דקות, 3x. כסו את הדגימות באמצעי הרכבה נגד דעיכה המכיל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה.
- צביעת טונל
- יבשו את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות וציירו טבעת מחסום דוחה מים סביב דגימות רקמת הרשתית בעזרת עט חוסם הנוזלים, ולאחר מכן דגרו עליהן ב-40 מ"ל PBS למשך 15 דקות.
- דגירה על שקופיות ב- 42 מ"ל (לכל חמש שקופיות) של TBS (0.05 M Tris-buffer) ב- 37 ° C. שאפו החוצה את ה-TBS, ודגרו על הדגימות עם 6 מיקרוליטר של פרוטאינאז K למשך 5 דקות. לאחר מכן, שטפו שקופיות 3x עם TBS במשך 5 דקות בכל פעם.
- חושפים את המגלשות ל-40 מ"ל של תמיסת אתנול-חומצה אצטית בשופלין, מכסים בסדין שקוף ודגרים בטמפרטורה של -20°C למשך 5 דקות. שטפו את המגלשות 3 פעמים עם TBS במשך 5 דקות בכל פעם.
- חשוף את המגלשות לתמיסת חסימה (1% BSA; 200-300 μL לשקופית לפי דרישה) ודגר בתא לחות למשך שעה אחת.
- הכינו את תמיסת ערכת TUNEL, TMR אדום, ביחס הבא: 62.50 μL של תמיסת חסימה (1% BSA), 56.25 μL של תמיסת תיוג (TMR-dUTP) ו-6.25 μL של האנזים (פרופורציה לכל שקופית). הוסף כ 130 μL של תמיסה זו לכל שקופית ודגור ב 37 ° C במשך 1 שעות. לאחר מכן, שטפו את המגלשות עם PBS למשך 5 דקות (200 מיקרוליטר לכל שקופית), 2x.
- הניחו שקופיות כיסוי המכילות 1-2 טיפות של אמצעי הרכבה נגד דעיכה עם DAPI מעל הדגימות, ולאחר מכן דגרו על השקופיות בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה.
- צביעת cGMP (תנאי ייצור נאותים) בשילוב צביעת טונל
- צביעת cGMP לוותה בצביעת טונל. בצע את השלבים של צביעת TUNEL משלב 4.2.1 לשלב 4.2.5, ולאחר מכן המשך את השלבים של צביעת cGMP משלב 4.1.2 לשלב 4.1.4.
- בצע מיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי עם פרמטרים של המצלמה באופן הבא: זמן חשיפה = 125 אלפיות השנייה, גודל החזר השקעה = 2752 x 2208, צבע = שחור-לבן. צלם תמונות באמצעות התוכנה. צייר ארבעה שדות שונים עם מצלמה דיגיטלית בהגדלה של 20x מכל קטע וקבל תמונות מייצגות מהאזורים המרכזיים של הרשתית באמצעות DAPI (465 ננומטר), EGFP (509 ננומטר), TMP (578 ננומטר), כאשר סריקת Z-Stack כוללת מרווח = 1 מיקרומטר ואופציונלי = 1.251 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה, תרבית חציל רשתית של קופי מקוק בוצעה באמצעות צמחים המכילים את קומפלקס הרשתית-RPE-כורואיד (איור 1, איור משלים S1). בהשוואה לתרבית במבחנה של תאי רשתית המשתמשים ברשתית ללא RPE וכורואיד מחוברים, תרבית הצמחים שלנו מאפשרת הישרדות תאים טובה יותר ובהתאם לכך, מאריכה את הישרדותם של תאים קולטי אור.
השתמשנו בריכוזים שונים של מעכב PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM ו-400 μM; איור משלים S2) כדי לגרום להצטברות של cGMP בפוטורצפטורים ולאחר מכן הפעלה של PKG במבחנה. כל טיפול ריכוז ניתן במשך 4 ימים, בהתאמה. הטיפול במודל הרשתית במבחנה עם 400 μM zaprinast הציג את המספר הגדול ביותר של תאים חיוביים TUNEL, אות cGMP משמעותי, ורעילות נמוכה עבור RPE ותאים עצביים ברשתית הפנימית. השיעור הגבוה של תאים חיוביים ל-TUNEL באיור 2 מצביע על כך שהגברת פעילות cGMP עשויה לשפר את ניוון תאי הרשתית הנגרמים על-ידי זפרינסט, והצטברות cGMP ממלאת תפקיד בניוון קולטני האור. מודל ניוון הרשתית של מקוק שנקבע במחקר זה ישמש למחקרים מקיפים על המנגנונים של RP תלוי cGMP-PKG.
איור 1: תהליך הייצור של תרבית חציל רשתית בקופי מקוק בני שנה. (A-L) הפרידו את הסקלרה, הקרנית, הקשתית, העדשה וגוף הזגוגית, וחתכו את הרשתית מארבעה צדדים בעזרת פינצטה ומספריים. (מ-ו) חותכים את החצילים ברשתית עם להבי טרפין לחמישה חלקים - להב טרפין 4 מ"מ לצד האף/טמפורלי/עליון/נחות, ולהב טרפין 6 מ"מ לצד המרכזי (מכיל דיסק אופטי ומקולה). (P) מעבירים את החצילים ברשתית (המכילים רשתית וכורואיד) פרפרים פתוחים אל הממברנה ומניחים את הממברנה על צלחת תרבית בת 6 בארות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הערכה של פעילויות cGMP (תנאי ייצור נאותים) בתוך ONL של חצילי רשתית של קוף בן שנה. צמחים טופלו בריכוזים שונים של מעכב PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM ו-400 μM). מספר התאים החיוביים TUNEL (אדום) ו-cGMP (ירוק) בשלושת הריכוזים השונים גדל מאוד ב-ONL בהשוואה לקבוצת הביקורת (A-D). בהשוואה לקבוצת הביקורת, לתאים החיוביים TUNEL/cGMP יש הבדלים משמעותיים בקבוצות 100 μM, 200 μM ו-400 μM. גרעינים הוכתמו ב-DAPI (כחול). אזור ברשתית שטופל בזפרינסט של 400 מיקרומטר הוגדל כדי לצפות בתאים חיוביים cGMP (ירוק) וטונל (אדום) בלבד, כמו גם תמונה ממוזגת. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (SD); * = p ≤ 0.05; ** = p ≤ 0.01; = p ≤ 0.001; = p ≤ 0.0001. קיצורים: GCs = תאי גנגליון, INL = שכבה גרעינית פנימית, ONL = שכבה גרעינית חיצונית, RPE = אפיתל פיגמנט רשתית, cGMP = מונופוספט גואנוזין מחזורי, PDE6 = פוספודיאסטראז 6. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: מיקום אגרופי הרשתית המשמשים לתרביות חצילים. חצילים שמקורם באגרופים באף היו ממוקמים במרחק של 1.5 מ"מ מראש עצב הראייה, בעוד שמרחק זה היה 4 מ"מ עבור הרקתית ו-2 מ"מ עבור אגרופים עליונים ונחותים, בהתאמה. צמחי רשתית התקבלו על ידי חיתוך עם להבי טרפין בחמישה מקומות - להב טרפין 4 מ"מ לצד האף/טמפורלי/עליון/נחות ולהב טרפין 6 מ"מ לצד המרכזי (המכיל דיסק אופטי ומקולה). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2: צביעת טונל לתאים גוססים. רשתית הבקרה (A) והרשתית המטופלות בזפרינסט בריכוזים של 100 מיקרומטר, 200 מיקרומטר או 400 מיקרומטר (B-D). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פוטוטרנסדוקציה חזותית מתייחסת לתהליך הביולוגי שבו אותות אור מומרים לאותות חשמליים על ידי תאים קולטי אור בתוך רשתית העין. תאים קולטי אור הם תאי עצב מקוטבים המסוגלים לבצע פוטוטרנסדוקציה, וישנם שני סוגים שונים של פוטורצפטורים המכונים מוטות ומדוכים על שם צורות המקטעים החיצוניים שלהם. מוטות אחראים על הראייה הסקוטופית ומדוכים אחראים על ראייה פוטופיקית וחדות גבוהה. RD תורשתי מתייחס למחלות נוירודגנרטיביות המאופיינות במוות מתקדם של תאי קולטני רשתית15.
המחקר הנוכחי על RD התבסס בעיקר על מודלים עכבריים של RD, כולל תרביות חציל רשתית במבחנה שמקורן במודלים של מורין RD16. עם זאת, קיימים הבדלים גנטיים ופיזיולוגיים ניכרים, במיוחד במבנה הרשתית, בין עכברים לבני אדם. לעומת זאת, NHPs חולקים רמה גבוהה של דמיון עם בני אדם, מה שהופך מודלים NHP המתאים ביותר לחקר פתוגנזה RD ופיתוח טיפול.
במחקר זה, ביססנו מודל NHP במבחנה על ידי גידול צמחילים ברשתית של קופי מקוק. בהשוואה לתרבית ראשונית שגרתית של תא בודד ולתרבית חוץ גופית של קווי תאים אימורטליים, תרבית חציל רשתית במבחנה יכולה לשמר קונפורמציה של רקמת הרשתית ואינטראקציות בין-תאיות, מה שמאפשר הדמיה טובה יותר של תנאי in vivo . בנוסף, הוא מפחית במידה רבה את מספר בעלי החיים המשמשים ומקצר את משך הניסוי, ומספק גישה ניסיונית נשלטת יחסית לחקירת ההשפעות של גורמים שונים המעורבים בהתפתחות רשתית או בניוון.
הכנה מוצלחת של חצילי רשתית חיונית להקמה מוצלחת של מודלים של רשתית חוץ גופית . בהתבסס על הניסיון המחקרי הקודם שלנו בהכנת חצילים ברשתית לעכברים, אנו מסכמים כאן מספר נקודות מפתח להכנת חצילים ברשתית הקופים:
1) הכנת הצמחים חייבת להתבצע בהקדם האפשרי לאחר הקרבת בעלי חיים וחינוכם. מומלץ להשתמש בתמיסת אחסון רקמות לאחסון גלגל העין לפני השימוש בהכנת אקספלנט מכיוון שהיא מאפשרת שמירה טובה יותר על כדאיות התא בהשוואה למלח חוצץ פוספט.
2) בהתחשב בגודל הגדול של גלגלי העיניים של הקופים ובתקופות הארוכות של חשיפה לסביבה חיצונית, שטיפת גלגלי העיניים עם יודופור פובידון מדולל ותמיסה אנטיביוטית כפולה לפני הכנת השתלת הרשתית עשויה להפחית את הזיהום. עם זאת, כביסה לא צריך להתבצע במשך זמן רב מדי. תוספת אנטיביוטיקה במהלך תרבית explant אינה מומלצת מכיוון שהיא עלולה להשפיע על כדאיות התא.
3) גלגלי עיניים משובצים היו נתונים להפרדה רציפה של הסקלרה, הקרנית, הקשתית, העדשה וגוף הזגוגית ולאחר מכן חיתוך הרשתית. בניגוד לגלגלי עיניים של עכברים, שהם קטנים ובהם לובן העין והאוביאה מחוברים זה לזה בחוזקה, גלגלי העיניים של הקופים גדולים יחסית ובעלי לובן עין קשיח ומרחב סופרכרואידי. לכן, מספריים נדרשים להפרדת הסקלרה. למרות שלא מדובר בצעד קשה בטיפול בגלגלי עיניים של קופים, יש להקפיד להימנע מפגיעה ברשתית ובאובה. בנוסף, יש לחתוך את הרצועה המתיחה הקשוחה של עדשת הקוף במספריים לפני הסרה זהירה של העדשה. היפרדות גוף הזגוגית היא אחד השלבים הגוזלים זמן רב ביותר בתהליך הכנת הזגוגית בשל תא הזגוגית הגדול של עין הקוף, הצמיגות הגבוהה של גוף הזגוגית, והחיבור האיתן של גוף הזגוגית עם הרשתית בקופים בגילאי 1-3 שנים. גוף הזגוגית הוסר ככל האפשר באמצעות מספריים ופיפטה שימשה כדי להקל על ההעברה והתרבות הבאים של החצילים ברשתית. אנו נמצאים כעת בתהליך של בחינת שיטות מהירות ויעילות יותר להסרת גוף הזגוגית. צמחי רשתית (5 מ"מ) נחתכו באמצעות להבי טרפין כדי להבטיח עקביות בגודל הצמחים המתקבלים מאתרים שונים (מאפייני האתר: ארבעה רבעים בפריפריה, 6 מ"מ במרכז). במהלך העברת הצמחים לתוספות תרבית, הרשתית והכורואיד עלולים להיות מופרדים. לכן, נדרש טיפול עדין וזריז כדי להבטיח שהחצילים יועברו במהלך הניסיון הראשון עצמו, שכן ניסיונות חוזרים ונשנים עלולים לגרום לנזק ברשתית. לבסוף, יש למזער את הנזק המכני ככל האפשר במהלך כל תהליך הכנת השתלול הרשתית כדי למנוע פגיעה במבנה הרשתית. יש למזער גם את הזמן הנדרש להכנת צמחים כדי למנוע מוות תאי בשוגג.
4) תרבית צמחיל רשתית בוצעה באמצעות explants המכילים את קומפלקס הרשתית-RPE-כורואידים. בהשוואה לתרבית במבחנה של תאי רשתית המשתמשים ברשתית ללא RPE וכורואיד מחוברים, תרבית הצמחים שלנו מאפשרת הישרדות תאים טובה יותר ובהתאם מאריכה את הישרדותם של תאים קולטי אור. במהלך תהליך התרבית, הרשתית פונה כלפי מעלה והכורואיד פונה כלפי מטה. בהשוואה לחצילים ברשתית עכברים, חצילי רשתית הקופים גדולים יותר בגודלם, מה שמציב דרישות גדולות יותר לתזונת תרבית. לכן, ביצענו שינויים יומיומיים במדיום התרבית עבור תרבית החצילה ברשתית הקוף במקום לאמץ תדירות שינוי מדיום תרבית של אחת ליומיים, אשר שימשה בעבר לתרבית חציל רשתית העכבר.
יחד, ביססנו מודל NHP במבחנה באמצעות תרבית של צמחי הרשתית של קופי מקוק והטיפול שלהם בזפרינסט כדי לגרום למסלול איתות cGMP-PKG הדומה לזה שנצפה בפתוגנזה של RD. Zaprinast הוא מעכב PDE6, ו-PDE6 שומר על איזון הריכוז התוך-תאי של cGMP המפעיל PKG17,18. מסלול cGMP-PKG עלול לווסת באופן שלילי זרחן חמצוני ומסלולים מיטוכונדריאליים, ובכך להשפיע על ניוון הרשתית19. השראת מסלול האיתות cGMP-PKG במודל רשתית NHP זה במבחנה מבססת אותו כמודל חיובי למחקר עתידי על הפתוגנזה של RD, כמו גם לפיתוח ובדיקות טוקסיקו-פרמקולוגיה של תרופות חדשות לטיפול ב- RD. עם זאת, לשימוש במודל זה יש כמה מגבלות, בעיקר תקופות הגידול הקצרות יחסית שלו, והעלויות הגבוהות יחסית לפרימטים. במהלך המחקר העתידי שלנו, מודל זה במבחנה ישמש להערכה תפקודית לאחר התערבות של הרשתית באמצעות MEA ו- μERG. מידע ומיקומים תאיים של מטרות PKG ישולבו עם מדידת פעילויות של גורמים משפיעים במורד הזרם (למשל, calpain, PARP ו- HDAC) וחקירות של מנגנונים נוירודגנרטיביים רלוונטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81960180), קרן מורשת זינקה וקרן שרלוט וטיסטו קרסטן, המרכז הרפואי הקליני למחלות עיניים יונאן (ZX2019-02-01). אנו מודים לפרופ' לונגבאו לב (המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, קונמינג, סין) על שיתוף גלגלי העיניים של הקופים ששימשו במחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
