Summary
जंगली प्रकार के मकाक से प्राप्त रेटिना खोजों को विट्रो में सुसंस्कृत किया गया था। रेटिना अपघटन और सीजीएमपी-पीकेजी सिग्नलिंग मार्ग को पीडीई 6 अवरोधक जैपरिनस्ट का उपयोग करके प्रेरित किया गया था। इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके विभिन्न ज़ापरिनस्ट सांद्रता में खोजों में सीजीएमपी संचय को सत्यापित किया गया था।
Abstract
वंशानुगत रेटिना अपघटन (आरडी) प्रगतिशील फोटोरिसेप्टर सेल मृत्यु की विशेषता है। फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में चक्रीय गुआनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीजीएमपी) -निर्भर प्रोटीन काइनेज (पीकेजी) मार्ग का अतिसक्रियण फोटोरिसेप्टर सेल मृत्यु का कारण बनता है, विशेष रूप से फॉस्फोडिएस्टरेज़ 6 बी (पीडीई 6 बी) उत्परिवर्तन वाले मॉडल में। आरडी पर पिछले अध्ययनों ने मुख्य रूप से मुराइन मॉडल जैसे आरडी 1 या आरडी 10 चूहों का उपयोग किया है। चूहों और मनुष्यों के बीच आनुवंशिक और शारीरिक अंतर को देखते हुए, यह समझना महत्वपूर्ण है कि प्राइमेट्स और कृन्तकों के रेटिना किस हद तक तुलनीय हैं। मकाक मनुष्यों के साथ आनुवंशिक समानता का एक उच्च स्तर साझा करते हैं। इसलिए, जंगली-प्रकार के मकाक (1-3 वर्ष की आयु) को रेटिना खोजों की इन विट्रो संस्कृति के लिए चुना गया था जिसमें रेटिना-रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) -कोरॉयड कॉम्प्लेक्स शामिल था। सीजीएमपी-पीकेजी सिग्नलिंग मार्ग को प्रेरित करने और आरडी रोगजनन का अनुकरण करने के लिए इन खोजों को पीडीई 6 अवरोधक जैपरिनस्ट की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। प्राइमेट रेटिना खोजों में सीजीएमपी संचय और कोशिका मृत्यु को बाद में इम्यूनोफ्लोरेसेंस और ट्यूनल परख का उपयोग करके सत्यापित किया गया था। इस अध्ययन में स्थापित प्राइमेट रेटिना मॉडल सीजीएमपी-पीकेजी-निर्भर आरडी के तंत्र में प्रासंगिक और प्रभावी अध्ययन के साथ-साथ भविष्य के उपचार दृष्टिकोण के विकास के लिए काम कर सकता है।
Introduction
वंशानुगत रेटिना अपघटन (आरडी) प्रगतिशील फोटोरिसेप्टर सेल मृत्यु की विशेषता है और रोगजनक जीन1 की एक विस्तृत विविधता में उत्परिवर्तन के कारण होता है। आरडी का अंतिम परिणाम दृष्टि हानि है और अधिकांश मामलों में बीमारी आज तक इलाज योग्य नहीं है। इसलिए, मानव रोग की स्थिति का ईमानदारी से प्रतिनिधित्व करने वाले मॉडल का उपयोग करके फोटोरिसेप्टर मृत्यु के लिए अग्रणी सेलुलर तंत्र का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। यहां, प्राइमेट-आधारित मॉडल मनुष्यों के साथ उनकी निकटता के कारण विशेष रुचि रखते हैं। विशेष रूप से, ऐसे मॉडल उचित चिकित्सीय हस्तक्षेप के विकास को आगे बढ़ा सकते हैं जो फोटोरिसेप्टर सेल मृत्यु को रोक या देरी कर सकते हैं।
आरडी में कोशिका मृत्यु के तंत्र पर पिछले शोध से पता चला है कि आरडी-ट्रिगरिंग जीन उत्परिवर्तन के कारण फॉस्फोडिएस्टरेज़ 6 (पीडीई 6) गतिविधि की कमी या हानि चक्रीय गुआनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीजीएमपी) 2,3 के हाइड्रोलिसिस को कम करती है। सीजीएमपी रॉड बाहरी खंडों (आरओएस) में चक्रीय न्यूक्लियोटाइड-गेटेड आयन चैनलों (सीएनजीसी) का एक विशिष्ट एगोनिस्ट है और कशेरुक फोटोरिसेप्टरकोशिकाओं में विद्युत संकेतों में प्रकाश संकेतों के रूपांतरण के लिए जिम्मेदार एक प्रमुख अणु भी है। कम सीजीएमपी हाइड्रोलिसिस आरओएस में सीजीएमपी के संचय का कारण बनता है, जिससे सीएनजीसी 5 का उद्घाटन होता है। नतीजतन, फोटोट्रांसडक्शन मार्ग सक्रिय होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में केशन सांद्रता में वृद्धि होती है। यह प्रक्रिया फोटोरिसेप्टर पर एक चयापचय बोझ लगाती है, जो जब अतिसक्रिय हो जाती है, उदाहरण के लिए, पीडीई 6 में उत्परिवर्तन द्वारा, कोशिका मृत्यु का कारण बन सकती है।
कई अध्ययनों से पता चला है कि विभिन्न आरडी जीन उत्परिवर्तन के साथ माउस मॉडल के फोटोरिसेप्टर में सीजीएमपी का एक महत्वपूर्ण अतिसंचय सीजीएमपी-निर्भर प्रोटीन किनेज (पीकेजी) 3,6 के सक्रियण का कारण बन सकता है। इससे मरने वाले, ट्यूनल-पॉजिटिव कोशिकाओं में पर्याप्त वृद्धि होती है और फोटोरिसेप्टर सेल परत का धीरे-धीरे पतलापन होता है। पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि ऊंचा सीजीएमपी स्तर के कारण पीकेजी अतिसक्रियण फोटोरिसेप्टर सेल मृत्यु 2,5 के प्रेरण के लिए एक आवश्यक और पर्याप्त स्थिति है। आरडी के विभिन्न माउस मॉडलों पर अध्ययन से यह भी पता चला है कि फोटोरिसेप्टर में ऊंचा सीजीएमपी स्तर से प्रेरित पीकेजी सक्रियण, पॉली-एडीपी-राइबोज पोलीमरेज़ 1 (पीएआरपी 1), हिस्टोन डेसेटाइलेज़ (एचडीएसी), और 2,7,8,9 जैसे डाउनस्ट्रीम प्रभावकों के अतिसक्रियण की ओर जाता है। इसका तात्पर्य इन विभिन्न लक्ष्य प्रोटीनों और फोटोरिसेप्टर कोशिका मृत्यु के बीच कारण संबंध है।
हालांकि, आरडी की पैथोलॉजी, टॉक्सिकोफार्माकोलॉजी और थेरेपी पर पिछला शोध मुख्य रूप से आरडी10,11,12 के लिए माउस मॉडल पर आधारित था। फिर भी, इन परिणामों के नैदानिक अनुवाद में भारी कठिनाइयां बनी हुई हैं। यह चूहों और मनुष्यों के बीच काफी आनुवंशिक और शारीरिक अंतर के कारण है, खासकर रेटिना संरचना के संबंध में। इसके विपरीत, गैर-मानव प्राइमेट्स (एनएचपी) आनुवंशिक विशेषताओं, शारीरिक पैटर्न और पर्यावरणीय कारक विनियमन के संबंध में मनुष्यों के साथ समानता की एक उच्च डिग्री भी साझा करते हैं। उदाहरण के लिए, एनएचपी मॉडल13 में रेटिना गतिविधि को बहाल करने के साधन के रूप में ऑप्टोजेनेटिक थेरेपी की जांच की गई थी। लिंगम और सहयोगियों ने प्रदर्शित किया कि अच्छा विनिर्माण अभ्यास-ग्रेड मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न रेटिना फोटोरिसेप्टर अग्रदूत कोशिकाएं एनएचपी14 में शंकु फोटोरिसेप्टर क्षति को बचा सकती हैं। इसलिए, एनएचपी मॉडल आरडी रोगजनन की खोज और प्रभावी उपचार विधियों के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं। विशेष रूप से, आरडी के एनएचपी मॉडल, मनुष्यों के समान रोगजनक तंत्र का प्रदर्शन करते हुए, विकास पर अध्ययन और नई दवाओं के विवो टॉक्सिकोफार्माकोलॉजी विश्लेषण में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं।
लंबे जीवन-चक्र, उच्च स्तर की तकनीकी कठिनाइयों और विवो प्राइमेट मॉडल में स्थापित करने में शामिल उच्च लागत को देखते हुए, हमने खोज किए गए मकाक रेटिना की संस्कृतियों का उपयोग करके एक इन विट्रो नॉन-ह्यूमन प्राइमेट (एनएचपी) मॉडल की स्थापना की। सबसे पहले, 1-3 वर्ष की आयु के जंगली-प्रकार के मकाक को रेटिना खोजों के इन विट्रो कल्चर के लिए चुना गया था, जिसमें रेटिना-आरपीई-कोरॉयड कॉम्प्लेक्स शामिल था। सीजीएमपी-पीकेजी सिग्नलिंग मार्ग को प्रेरित करने के लिए खोजों को पीडीई 6 अवरोधक ज़ापरिनस्ट (100 μM, 200 μM, और 400 μM) की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। ट्यूनल परख का उपयोग करके फोटोरिसेप्टर सेल मृत्यु की मात्रा निर्धारित और विश्लेषण किया गया था, और खोजों में सीजीएमपी संचय को इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से सत्यापित किया गया था। कोशिका वितरण और आकृति विज्ञान, रेटिना परत की मोटाई, और बंदरों और मनुष्यों के बीच रेटिना की अन्य शारीरिक विशेषताओं के संबंध में समानता की उच्च डिग्री को देखते हुए, इन विट्रो रेटिना मॉडल में सीजीएमपी-पीकेजी सिग्नलिंग मार्ग की स्थापना आरडी के रोगजनन पर भविष्य के शोध के साथ-साथ आरडी उपचार के लिए नई दवाओं के विकास और विष विज्ञान में अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
पशु अध्ययन की समीक्षा की गई और इंस्टीट्यूट ऑफ जूलॉजी, चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज (आईएसीयूसी-पीई-2022-06-002) की आचार समीक्षा समिति और युन्नान विश्वविद्यालय के पशु नैतिकता समीक्षा और पशु प्रोटोकॉल (वाईएनयू 20220149) द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. रेटिना खोज की तैयारी
- 1 से 3 वर्ष की आयु के जंगली-प्रकार के मकाक से प्राइमेट नेत्रगोलक प्राप्त करें, ऊतक भंडारण समाधान में स्टोर करें, और बंदरों की बलि के बाद या प्राकृतिक मृत्यु के बाद न्यूक्लियेशन के 3 घंटे के भीतर बर्फ पर परिवहन करें।
- प्रोटीन के समाधान की तैयारी के लिए, 250 μL आसुत जल में 25 मिलीग्राम प्रोटीनके के घोलें, और फिर 18.5 मिलीलीटर बेसल माध्यम (R16) में 225 μL घोल जोड़ें।
- आंखों की पुतलियों को 30 सेकंड के लिए 5% पोविडोन-आयोडीन (पोविडोन-आयोडीन: पानी = 1:19) के 10 मिलीलीटर में धोएं और बैक्टीरिया संदूषण से बचने के लिए उन्हें 5% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / स्ट्रेप) :p होस्फेट-बफर्ड सेलाइन = 1: 19 में डुबोएं। फिर, 5 मिनट के लिए आर 16 माध्यम के 10 एमएल में नेत्रगोलक को इनक्यूबेट करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्रोटीन के घोल को प्री-हीट करें। फिर, नेत्रगोलक को 10 मिलीलीटर प्रोटीन के घोल में डुबोएं और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। आंखों की पुतलियों को आर 16 + भ्रूण गोजातीय सीरम (1: 1) समाधान के 10 मिलीलीटर में डुबोएं, 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर आंखों की पुतलियों को अंतिम रूप से धोने के लिए 10 मिलीलीटर ताजा आर 16 में स्थानांतरित करें।
- श्वेतपटल, कॉर्निया, आईरिस, लेंस और विट्रस शरीर को अलग करें, और चिमटी और कैंची के साथ रेटिना को 4 तरफ से काट लें (चित्रा 1 ए-एल)।
- ट्रेफिन ब्लेड के साथ रेटिना एक्सप्लेंट को पांच खंडों में काटें- नाक / अस्थायी / बेहतर / अवर पक्ष के लिए एक 4 मिमी ट्रेफिन ब्लेड और केंद्रीय पक्ष के लिए 6 मिमी ट्रेफिन ब्लेड (ऑप्टिक डिस्क और मैक्युला युक्त; चित्र 1 एम-ओ)। ऑप्टिक तंत्रिका सिर से निम्नलिखित दूरी पर काटें: नाक के लिए 1.5 मिमी, अस्थायी के लिए 4 मिमी, और बेहतर और हीन पक्ष दोनों के लिए 2 मिमी।
- पलक डिप्रेसर के साथ रेटिना एक्सप्लेंट (रेटिना और कोरॉइड युक्त) को स्थानांतरित करें और उन्हें सम्मिलित, फोटोरिसेप्टर साइड के बीच में रखें (चित्रा 1 पी)। रेटिना को पूरी तरह से कवर करने के लिए प्लेट पर झिल्ली के नीचे लगभग 1 एमएल पूर्ण माध्यम (आर 16 बीएसए, ट्रांसफरिन, प्रोजेस्टेरोन, इंसुलिन, टी 3, कॉर्टिकोस्टेरोन, विटामिन बी 1, विटामिन बी 12, रेटिनॉल, रेटिनिल एसीटेट, डीएल-टोकोफेरोल, टोकोफेरिल एसीटेट, लिनोलिक एसिड, एल-सिस्टीन एचसीएल, ग्लूटाथियोन, ग्लूटामाइन, विटामिन सी के साथ पूरक) रखें।
2. प्राइमेट रेटिना खोज संस्कृति।
- 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पूर्ण माध्यम और स्थान में कल्चर रेटिना एक्सप्लेंट को ह्यूमिडिफायर 5% सीओ2 के साथ वातित किया जाता है।
- रेटिना कल्चर माध्यम के लिए उचित एकाग्रता पर दवा उपचार लागू करें (उदाहरण के लिए, 100 μM, 200 μM, या 400 μM की सांद्रता पर ज़ापरिनस्ट)। प्रति उपचार स्थिति में कम से कम तीन खोजों का उपयोग करें और नियंत्रण के रूप में दवा के बिना खोजों का उपयोग करें। 4 दिनों के लिए दवा के साथ इलाज करें।
3. फिक्सिंग और क्रायो-सेक्शनिंग
- 45 मिनट के लिए 1 एमएल पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ रेटिना एक्सप्लेंट को इनक्यूबेट करें, उन्हें 1 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ संक्षिप्त रूप से कुल्ला करें, और फिर 10 मिनट के लिए 10% सुक्रोज, 20 मिनट के लिए 20% सुक्रोज, और 30 मिनट के लिए 30% सुक्रोज (प्रत्येक रेटिना खोज के लिए 1 एमएल) के साथ इनक्यूबेट करें।
- निम्नलिखित विशेषताओं के साथ विभिन्न साइटों से प्राप्त खोजों के आकार में स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए ट्रेफिन ब्लेड का उपयोग करके रेटिना एक्सप्लेंट को काटें: परिधि में चार क्वाड्रंट, केंद्र में 6 मिमी। फिर, ऊतक को कवर करने के लिए ओसीटी एम्बेडिंग माध्यम के साथ रेटिना एक्सप्लेंट को एक टिनबॉक्स (लगभग 1.5 सेमी x 1.5 सेमी x 1.5 सेमी) में स्थानांतरित करें। तुरंत, तरल नाइट्रोजन में ऊतक वर्गों को फ्रीज करें और भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रखें।
- ऊतक के नमूने वाले एक छोटे ब्लॉक में आगर को ट्रिम करने के लिए एक तेज ब्लेड का उपयोग करें, नमूना ब्लॉकों को 10 μm वर्गों में काटें, और उन्हें नरम ब्रश का उपयोग करके आसंजन माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें। फिर, 40 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सुखाएं और उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
4. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (चित्रा 2)।
- सीजीएमपी धुंधला हो रहा है।
- स्लाइड्स को सुखाएं और नमूनों को कवर करने के लिए तरल अवरोधक पेन के साथ रेटिना वर्गों के चारों ओर एक हाइड्रोफोबिक रिंग खींचें।
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.3% फॉस्फेट बफर खारा और ट्राइटन एक्स -100 प्रति स्लाइड (पीबीएसटी) के 200 μL में स्लाइड डुबोएं, और फिर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ब्लॉकिंग समाधान (5% सामान्य गधा सीरम, 0.3% पीबीएसटी, 1% बीएसए, 200 μL प्रति स्लाइड) में।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉकिंग समाधान में तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी (1:250, भेड़ एंटी-सीजीएमपी, 200 μL प्रति स्लाइड) के साथ रात भर नमूने को इनक्यूबेट करें, और फिर 10 मिनट (200 μL प्रति स्लाइड) 3x के लिए पीबीएस के साथ कुल्ला करें।
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी (1:300, गधा विरोधी भेड़ अल्क्सिया फ्लुर 488, 200 μL प्रति स्लाइड) के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें, और फिर 10 मिनट, 3x के लिए पीबीएस के साथ कुल्ला करें। 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (DAPI) युक्त एंटीफैड माउंटिंग माध्यम के साथ नमूने को कवर करें, और इमेजिंग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- ट्यूनल धुंधला हो गया
- स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सुखाएं और तरल अवरोधक पेन के साथ रेटिना ऊतक नमूनों के चारों ओर एक जल-विकर्षक अवरोधक अंगूठी खींचें, और फिर उन्हें 15 मिनट के लिए पीबीएस के 40 मिलीलीटर में इनक्यूबेट करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर टीबीएस (0.05 एम ट्रिस-बफर) के 42 एमएल (प्रति पांच स्लाइड) में स्लाइड को इनक्यूबेट करें। टीबीएस को बाहर निकालें, और 5 मिनट के लिए 6 μL प्रोटीन के साथ नमूने को इनक्यूबेट करें। फिर, हर बार 5 मिनट के लिए टीबीएस के साथ स्लाइड 3x धोएं।
- स्लाइड को चॉप्लिन में 40 एमएल इथेनॉल-एसिटिक एसिड समाधान में उजागर करें, एक पारदर्शी शीट के साथ कवर करें, और 5 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। हर बार 5 मिनट के लिए टीबीएस के साथ स्लाइड 3x धोएं।
- स्लाइड्स को ब्लॉकिंग समाधान (1% बीएसए; आवश्यकता के अनुसार 200-300 μL प्रति स्लाइड) में उजागर करें और 1 घंटे के लिए आर्द्रता कक्ष में इनक्यूबेट करें।
- ट्यूनल किट समाधान, टीएमआर लाल, निम्नलिखित अनुपात में तैयार करें: ब्लॉकिंग समाधान के 62.50 μL (1% BSA), लेबलिंग समाधान के 56.25 μL (TMR-dUTP), और एंजाइम के 6.25 μL (प्रत्येक स्लाइड के लिए अनुपात)। प्रति स्लाइड इस घोल के लगभग 130 μL जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, 5 मिनट (200 μL प्रति स्लाइड), 2x के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड धो लें।
- नमूने के ऊपर DAPI के साथ एंटीफैड माउंटिंग माध्यम की 1-2 बूंदों वाली कवर स्लाइड रखें, और फिर इमेजिंग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- सीजीएमपी धुंधला होना ट्यूनल धुंधला होने के साथ संयुक्त है।
- सीजीएमपी धुंधला होने के बाद ट्यूनल धुंधला हो गया। चरण 4.2.1 से चरण 4.2.5 तक ट्यूनल स्टेनिंग के चरणों का पालन करें, और उसके बाद चरण 4.1.2 से चरण 4.1.4 तक सीजीएमपी धुंधला करने के चरणों को जारी रखें।
- कैमरा मापदंडों के साथ प्रकाश और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी निम्नानुसार करें: एक्सपोज़र समय = 125 एमएस, आरओआई आकार = 2752 x 2208, रंग = बी / प्रत्येक अनुभाग से 20x आवर्धन पर एक डिजिटल कैमरे के साथ चार अलग-अलग क्षेत्रों को चित्रित करें और DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm) का उपयोग करके रेटिना के केंद्रीय क्षेत्रों से प्रतिनिधि चित्र प्राप्त करें, जिसमें Z-स्टैक स्कैनिंग का अंतराल = 1 μm और वैकल्पिक = 1.251 μm है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस अध्ययन में, रेटिना-आरपीई-कोरॉयड कॉम्प्लेक्स (चित्रा 1, पूरक चित्रा एस 1) युक्त खोजों का उपयोग करके मकाक बंदर रेटिना खोज संस्कृति का प्रदर्शन किया गया था। संलग्न आरपीई और कोरॉइड के बिना रेटिना का उपयोग करने वाली रेटिना कोशिकाओं की इन विट्रो संस्कृति की तुलना में, हमारी खोज संस्कृति बेहतर सेल अस्तित्व की सुविधा प्रदान करती है और तदनुसार, फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के अस्तित्व को बढ़ाती है।
हमने पीडीई 6 अवरोधक ज़ाप्रिनस्ट (100 μM, 200 μM, और 400 μM) की विभिन्न सांद्रता का उपयोग किया; पूरक चित्र एस 2)। फोटोरिसेप्टर में सीजीएमपी के संचय को प्रेरित करने और बाद में विट्रो में पीकेजी के सक्रियण को प्रेरित करने के लिए। प्रत्येक एकाग्रता उपचार क्रमशः 4 दिनों के लिए दिया गया था। 400 μM zaprinast के साथ इन विट्रो रेटिना मॉडल के उपचार ने ट्यूनल-पॉजिटिव कोशिकाओं की सबसे बड़ी संख्या, एक महत्वपूर्ण सीजीएमपी संकेत और आंतरिक रेटिना में आरपीई और न्यूरोनल कोशिकाओं के लिए कम विषाक्तता का प्रदर्शन किया। चित्रा 2 में ट्यूनल-पॉजिटिव कोशिकाओं के उच्च अनुपात ने सुझाव दिया कि सीजीएमपी गतिविधि बढ़ने से ज़ाप्रिनस्ट-प्रेरित रेटिना सेल अपघटन बढ़ सकता है और सीजीएमपी संचय फोटोरिसेप्टर अपघटन में भूमिका निभाता है। इस अध्ययन में स्थापित मकाक रेटिना अपघटन मॉडल सीजीएमपी-पीकेजी-निर्भर आरपी के तंत्र पर व्यापक जांच के लिए काम करेगा।
चित्र 1: 1 वर्षीय मकाक में रेटिना खोज संवर्धन की उत्पादन प्रक्रिया। (ए-एल) श्वेतपटल, कॉर्निया, आईरिस, लेंस और विट्रस शरीर को अलग करें, और चिमटी और कैंची के साथ रेटिना को चार तरफ से काट लें। (M-O) ट्रेफिन ब्लेड के साथ रेटिना एक्सप्लेंट को पांच खंडों में काटें - नाक / अस्थायी / बेहतर / अवर पक्ष के लिए एक 4 मिमी ट्रेफिन ब्लेड, और केंद्रीय पक्ष के लिए 6 मिमी ट्रेफिन ब्लेड (ऑप्टिक डिस्क और मैक्युला युक्त)। (पी) रेटिना एक्सप्लेंट (रेटिना और कोरॉइड युक्त) तितलियों को झिल्ली में स्थानांतरित करें और झिल्ली को 6-वेल कल्चर प्लेट पर रखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: 1 साल के बंदर के रेटिना खोजों के ओएनएल के भीतर सीजीएमपी गतिविधियों का मूल्यांकन। खोजों को पीडीई 6 अवरोधक ज़ापरिनस्ट (100 μM, 200 μM, और 400 μM) की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। नियंत्रण (ए-डी) की तुलना में ओएनएल में तीन अलग-अलग सांद्रता में ट्यूनल (लाल) और सीजीएमपी (हरे) सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या में दृढ़ता से वृद्धि हुई थी। नियंत्रण समूह की तुलना में, TUNEL / cGMP-पॉजिटिव कोशिकाओं में 100 μM, 200 μM और 400 μM समूहों में महत्वपूर्ण अंतर हैं। नाभिक DAPI (नीले) से सना हुआ था। 400 μM zaprinast के साथ इलाज किए गए रेटिना के एक क्षेत्र को अकेले सीजीएमपी (हरा) और ट्यूनल (लाल) सकारात्मक कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए बढ़ाया गया था, साथ ही एक विलय की गई छवि भी। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व करती हैं; * = पी ≤ 0.05; ** = पी ≤ 0.01; = पी ≤ 0.001; = पी ≤ 0.0001 संक्षेप: जीसी = गैंग्लियन कोशिकाएं, आईएनएल = आंतरिक परमाणु परत, ओएनएल = बाहरी परमाणु परत, आरपीई = रेटिना वर्णक उपकला, सीजीएमपी = चक्रीय गुआनोसिन मोनोफॉस्फेट, पीडीई 6 = फॉस्फोडिएस्टरेज़ 6। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा एस 1: खोज संस्कृतियों के लिए उपयोग किए जाने वाले रेटिना पंच का स्थान। नाक के पंच से प्राप्त खोज ऑप्टिक तंत्रिका सिर से 1.5 मिमी की दूरी पर स्थित थे, जबकि यह दूरी क्रमशः अस्थायी के लिए 4 मिमी और बेहतर और हीन पंच के लिए 2 मिमी थी। रेटिना खोज को पांच स्थानों पर ट्रेफिन ब्लेड से काटकर प्राप्त किया गया था - नाक / अस्थायी / सुपीरियर / अवर पक्ष के लिए एक 4 मिमी ट्रेफिन ब्लेड और केंद्रीय पक्ष के लिए 6 मिमी ट्रेफिन ब्लेड (ऑप्टिक डिस्क और मैक्युला युक्त)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा एस 2: मरने वाली कोशिकाओं के लिए ट्यूनल धुंधला। 100 μM, 200 μM, या 400 μM (B-D) की सांद्रता पर Zaprinast के साथ इलाज किए गए रेटिना (A) और रेटिना को नियंत्रित करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
दृश्य फोटोट्रांसडक्शन जैविक प्रक्रिया को संदर्भित करता है जिसके द्वारा प्रकाश संकेतों को आंख के रेटिना के भीतर फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं द्वारा विद्युत संकेतों में परिवर्तित किया जाता है। फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं ध्रुवीकृत न्यूरॉन्स हैं जो फोटोट्रांसडक्शन में सक्षम हैं, और उनके बाहरी खंडों के आकार के बाद रॉड और शंकु नामक दो अलग-अलग प्रकार के फोटोरिसेप्टर हैं। छड़ स्कोटोपिक दृष्टि के लिए जिम्मेदार हैं और शंकु फोटोपिक और उच्च तीक्ष्णता दृष्टि के लिए जिम्मेदार हैं। वंशानुगत आरडी न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से संबंधित है जो प्रगतिशील रेटिना फोटोरिसेप्टर सेल मृत्यु15 की विशेषता है।
आरडी पर वर्तमान शोध मुख्य रूप से आरडी के माउस मॉडल पर आधारित है, जिसमें मुराइन आरडी मॉडल16 से प्राप्त इन विट्रो रेटिना खोज संस्कृतियां शामिल हैं। हालांकि, चूहों और मनुष्यों के बीच विशेष रूप से रेटिना संरचना में काफी आनुवंशिक और शारीरिक अंतर मौजूद हैं। इसके विपरीत, एनएचपी मनुष्यों के साथ समानता की एक उच्च डिग्री साझा करते हैं, जिससे एनएचपी मॉडल आरडी रोगजनन और चिकित्सा विकास की जांच के लिए सबसे उपयुक्त हैं।
इस अध्ययन में, हमने मकाक के रेटिना खोजों की खेती करके एक इन विट्रो एनएचपी मॉडल स्थापित किया। नियमित एकल-कोशिका प्राथमिक संस्कृति और अमर सेल लाइनों की एक इन विट्रो संस्कृति की तुलना में, एक इन विट्रो रेटिना खोज संस्कृति रेटिना ऊतक रचना और अंतरकोशिकीय इंटरैक्शन को संरक्षित कर सकती है, जो विवो स्थितियों में बेहतर सिमुलेशन को सक्षम बनाती है। इसके अलावा, यह काफी हद तक उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करता है और प्रयोगात्मक अवधि को छोटा करता है, और रेटिना विकास या अध: पतन में शामिल विभिन्न कारकों के प्रभावों की जांच के लिए अपेक्षाकृत नियंत्रणीय प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है।
इन विट्रो रेटिना मॉडल की सफल स्थापना के लिए रेटिना खोजों की सफल तैयारी महत्वपूर्ण है। चूहों के लिए रेटिना खोज तैयार करने के हमारे पिछले शोध अनुभव के आधार पर, हम यहां बंदर रेटिना खोज तैयारी के लिए कई प्रमुख बिंदुओं को संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं:
1) पशु बलि और न्यूक्लियेशन के बाद खोज की तैयारी जल्द से जल्द की जानी चाहिए। खोज तैयारी में उपयोग से पहले नेत्रगोलक भंडारण के लिए एक ऊतक भंडारण समाधान के उपयोग की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह फॉस्फेट-बफर्ड खारा की तुलना में सेल व्यवहार्यता के बेहतर रखरखाव को सक्षम बनाता है।
2) बंदर की आंखों के बड़े आकार और बाहरी वातावरण के संपर्क की लंबी अवधि को ध्यान में रखते हुए, रेटिना खोज तैयारी से पहले पतला पोविडोन आयोडोफोर और दोहरे एंटीबायोटिक समाधान के साथ आंखों की पुतलियों को धोने से संदूषण कम हो सकता है। हालांकि, धोने को अत्यधिक लंबी अवधि के लिए नहीं किया जाना चाहिए। खोज संस्कृति के दौरान एंटीबायोटिक दवाओं के अतिरिक्त की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है।
3) एन्यूक्लियेटेड नेत्रगोलक को श्वेतपटल, कॉर्निया, आईरिस, लेंस और विट्रस शरीर के अनुक्रमिक पृथक्करण के अधीन किया गया था, जिसके बाद रेटिना का टुकड़ा किया गया था। माउस नेत्रगोलक के विपरीत, जो छोटे होते हैं और जिनमें श्वेतपटल और यूविया एक-दूसरे से कसकर जुड़े होते हैं, बंदर की नेत्रगोलक अपेक्षाकृत बड़ी होती हैं और उनके पास एक कठिन श्वेतपटल और सुप्राकोरॉइडल स्थान होता है। इसलिए, श्वेतपटल के पृथक्करण के लिए कैंची की आवश्यकता होती है। यद्यपि यह एन्यूक्लियेटेड बंदर की आंखों की पुतलियों को संभालने में एक मुश्किल कदम नहीं है, रेटिना और यूवा को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इसके अलावा, लेंस को सावधानीपूर्वक हटाने से पहले बंदर लेंस के कठिन सस्टेनरी लिगामेंट को कैंची से काटना पड़ता है। बंदर की आंख के बड़े विट्रस चैंबर, विट्रस शरीर की उच्च चिपचिपाहट और 1-3 वर्ष की आयु के बंदरों में रेटिना के साथ विट्रस शरीर के दृढ़ लगाव के कारण विट्रस शरीर का पृथक्करण खोज तैयारी प्रक्रिया के सबसे अधिक समय लेने वाले चरणों में से एक है। कैंची का उपयोग करके विट्रस शरीर को अधिकतम संभव सीमा तक हटा दिया गया था और रेटिना खोजों के बाद के हस्तांतरण और संस्कृति को सुविधाजनक बनाने के लिए एक पिपेट का उपयोग किया गया था। हम वर्तमान में विट्रस बॉडी रिमूवल के लिए तेजी से और अधिक प्रभावी तरीकों की खोज करने की प्रक्रिया में हैं। विभिन्न साइटों से प्राप्त खोजों के आकार में स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए ट्रेफिन ब्लेड का उपयोग करके रेटिना एक्सप्लेंट (5 मिमी) को काटा गया था (साइट विशेषताएं: परिधि में चार क्वाड्रंट, केंद्र में 6 मिमी)। कल्चर इंसर्ट में खोजों के स्थानांतरण के दौरान, रेटिना और कोरॉयड अलग हो सकते हैं। इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कोमल और फुर्तीले हैंडलिंग की आवश्यकता होती है कि खोजों को पहले प्रयास के दौरान ही स्थानांतरित किया जाता है, क्योंकि बार-बार प्रयास करने से रेटिना क्षति हो सकती है। अंत में, रेटिना संरचना को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए पूरी रेटिना खोज तैयारी प्रक्रिया के दौरान यांत्रिक क्षति को यथासंभव कम से कम किया जाना चाहिए। अनजाने में कोशिका मृत्यु से बचने के लिए खोज की तैयारी में लगने वाले समय को भी कम किया जाना चाहिए।
4) रेटिना एक्सप्लेंट कल्चर रेटिना-आरपीई-कोरॉयड कॉम्प्लेक्स युक्त खोजों का उपयोग करके किया गया था। संलग्न आरपीई और कोरॉइड के बिना रेटिना का उपयोग करने वाली रेटिना कोशिकाओं की इन विट्रो संस्कृति की तुलना में, हमारी खोज संस्कृति बेहतर सेल अस्तित्व की अनुमति देती है और तदनुसार फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के अस्तित्व को बढ़ाती है। संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, रेटिना ऊपर की ओर और कोरॉयड नीचे की ओर होता है। माउस रेटिना खोजों की तुलना में, बंदर रेटिना खोज आकार में बड़े होते हैं, जो संस्कृति पोषण पर अधिक मांग रखते हैं। इसलिए, हमने हर 2 दिनों में एक बार संस्कृति माध्यम परिवर्तन आवृत्ति को अपनाने के बजाय बंदर रेटिना खोज संस्कृति के लिए दैनिक संस्कृति माध्यम परिवर्तन किए, जिसका उपयोग पहले माउस रेटिना खोज संस्कृति के लिए किया गया था।
साथ में, हमने मकाक के रेटिना खोजों की संस्कृति के माध्यम से एक इन विट्रो एनएचपी मॉडल स्थापित किया है और आरडी रोगजनन में देखे गए सीजीएमपी-पीकेजी सिग्नलिंग मार्ग को प्रेरित करने के लिए जैपरिनस्ट के साथ उनका उपचार किया है। Zaprinast एक PDE6 अवरोधक है, और PDE6 सीजीएमपी की इंट्रासेल्युलर एकाग्रता के संतुलन को बनाए रखता है जो PKG17,18 को सक्रिय करता है। सीजीएमपी-पीकेजी मार्ग ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन और माइटोकॉन्ड्रियल मार्गों को नकारात्मक रूप से विनियमित कर सकता है, जिससे रेटिना अपघटन19 प्रभावित होता है। इस इन विट्रो एनएचपी रेटिना मॉडल में सीजीएमपी-पीकेजी सिग्नलिंग मार्ग का प्रेरण इसे आरडी के रोगजनन पर भविष्य के शोध के साथ-साथ आरडी उपचार के लिए नई दवाओं के विकास और विष विज्ञान परीक्षण के लिए एक अनुकूल मॉडल के रूप में स्थापित करता है। फिर भी, इस मॉडल के उपयोग की कुछ सीमाएं हैं, विशेष रूप से, इसकी अपेक्षाकृत कम संवर्धन अवधि, और प्राइमेट्स के लिए अपेक्षाकृत उच्च लागत। हमारे भविष्य के शोध के दौरान, इस इन विट्रो मॉडल का उपयोग एमईए और μERG का उपयोग करके रेटिना के हस्तक्षेप के बाद कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए किया जाएगा। पीकेजी लक्ष्यों की जानकारी और सेलुलर स्थानों को डाउनस्ट्रीम प्रभावकों (जैसे, अल्फा, पीएआरपी, और एचडीएसी) की गतिविधियों के माप और प्रासंगिक न्यूरोडीजेनेरेटिव तंत्र में जांच के साथ जोड़ा जाएगा।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
सभी लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 81960180), ज़िंके विरासत फाउंडेशन, और शार्लोट और टिस्टो केर्स्टन फाउंडेशन, युन्नान आई डिजीज क्लिनिकल मेडिकल सेंटर (जेडएक्स 2019-02-01) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। लोंगबाओ एलवी (इंस्टीट्यूट ऑफ जूलॉजी, चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज, कुनमिंग, चीन) को इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए बंदर ों की आंखों की पुतलियों को साझा करने के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
