Summary
Retinal explants hentet fra villtype makaker ble dyrket in vitro. Netthinnegenerasjon og cGMP-PKG-signalveien ble indusert ved bruk av PDE6-hemmeren zaprinast. cGMP-akkumulering i eksplantene ved forskjellige zaprinastkonsentrasjoner ble verifisert ved bruk av immunfluorescens.
Abstract
Arvelig retinal degenerasjon (RD) er preget av progressiv fotoreceptorcelledød. Overaktivering av den sykliske guanosinmonofosfat (cGMP) -avhengige proteinkinase (PKG) -banen i fotoreceptorceller forårsaker fotoreceptorcelledød, spesielt i modeller som har fosfodiesterase 6b (PDE6b) mutasjoner. Tidligere studier på RD har hovedsakelig brukt murine modeller som rd1 eller rd10 mus. Gitt de genetiske og fysiologiske forskjellene mellom mus og mennesker, er det viktig å forstå i hvilken grad netthinnene til primater og gnagere er sammenlignbare. Macaques deler et høyt nivå av genetisk likhet med mennesker. Derfor ble villtypemakaker (i alderen 1-3 år) valgt for in vitro-kulturen av retinale eksplanter som inkluderte retina-retinal pigmentepitel (RPE)-choroid-komplekset. Disse eksplantene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av PDE6-hemmeren zaprinast for å indusere cGMP-PKG-signalveien og simulere RD-patogenesen. cGMP-akkumulering og celledød i primater retinale eksplanter ble deretter verifisert ved hjelp av immunfluorescens og TUNEL-analysen. Primatretinalmodellen etablert i denne studien kan tjene til relevante og effektive studier av mekanismene for cGMP-PKG-avhengig RD, samt for utvikling av fremtidige behandlingsmetoder.
Introduction
Arvelig retinal degenerasjon (RD) er preget av progressiv fotoreceptorcelledød og er forårsaket av mutasjoner i et bredt spekter av patogene gener1. Sluttresultatet av RD er synstap, og i de aller fleste tilfeller forblir sykdommen uhelbredelig til denne dagen. Derfor er det viktig å studere de cellulære mekanismene som fører til fotoreceptordød ved hjelp av modeller som trofast representerer den menneskelige sykdomstilstanden. Her er primatbaserte modeller av spesiell interesse på grunn av deres nærhet til mennesker. Spesielt kan slike modeller fremme utviklingen av passende terapeutiske inngrep som kan stoppe eller forsinke fotoreceptorcelledød.
Tidligere forskning på mekanismene for celledød i RD har vist at reduksjon eller tap av fosfodiesterase 6 (PDE6) aktivitet forårsaket av RD-utløsende genmutasjoner fører til redusert hydrolyse av syklisk guanosinmonofosfat (cGMP) 2,3. cGMP er en spesifikk agonist av de sykliske nukleotid-styrte ionkanalene (CNGC) i stavens ytre segmenter (ROS) og er også et nøkkelmolekyl som er ansvarlig for konvertering av lyssignaler til elektriske signaler i virveldyrfotoreceptorceller4. Redusert cGMP-hydrolyse forårsaker akkumulering av cGMP i ROS, noe som fører til åpningen av CNGC 5. Følgelig aktiveres fototransduksjonsveiene, noe som resulterer i en økning i kationkonsentrasjoner i fotoreceptorceller. Denne prosessen påfører fotoreseptorer en metabolsk byrde, som når de overaktiveres, for eksempel ved mutasjoner i PDE6, kan forårsake celledød.
Mange studier har vist at en signifikant overakkumulering av cGMP i fotoreseptorer av musemodeller med forskjellige RD-genmutasjoner kan forårsake aktivering av cGMP-avhengig proteinkinase (PKG)3,6. Dette fører til en betydelig økning i døende, TUNEL-positive celler og en gradvis tynning av fotoreseptorcellelaget. Tidligere studier tyder på at PKG-overaktivering forårsaket av forhøyede cGMP-nivåer er en nødvendig og tilstrekkelig betingelse for induksjon av fotoreseptorcelledød 2,5. Studier på forskjellige musemodeller av RD har også vist at PKG-aktivering indusert av forhøyede cGMP-nivåer i fotoreseptorer, fører til overaktivering av nedstrøms effektorer som poly-ADP-ribosepolymerase 1 (PARP1), histondeacetylase (HDAC) og calpain 2,7,8,9. Dette innebærer årsakssammenhenger mellom disse forskjellige målproteinene og fotoreceptorcelledød.
Imidlertid var tidligere forskning på patologi, toksikofarmakologi og terapi av RD hovedsakelig basert på musemodeller for RD10,11,12. Likevel gjenstår enorme vanskeligheter i den kliniske oversettelsen av disse resultatene. Dette skyldes de betydelige genetiske og fysiologiske forskjellene mellom mus og mennesker, spesielt med hensyn til retinalstrukturen. I motsetning til dette deler ikke-menneskelige primater (NHP) også en høy grad av likhet med mennesker med hensyn til genetiske egenskaper, fysiologiske mønstre og miljøfaktorregulering. For eksempel ble optogenetisk terapi undersøkt som et middel for å gjenopprette retinal aktivitet i en NHP-modell13. Lingam og kolleger viste at god produksjonspraksis av menneskeindusert pluripotent stamcelleavledet retinal fotoreceptor-forløperceller kan redde keglefotoreceptorskader i NHP14. Derfor er NHP-modeller viktige for utforskning av RD-patogenese og utvikling av effektive behandlingsmetoder. Spesielt kan NHP-modeller av RD, som viser patogene mekanismer som ligner på mennesker, spille en kritisk rolle i studier på utvikling og in vivo toksikofarmakologianalyse av nye stoffer.
I lys av den lange livssyklusen, høye tekniske vanskeligheter og høye kostnader involvert i å etablere in vivo primatmodeller, etablerte vi en in vitro ikke-human primat (NHP) modell ved bruk av kulturer av eksplantet makaknetthinne. For det første ble villtypemakaker i alderen 1-3 år valgt for in vitro-kultur av retinale eksplanter, som inkluderte retina-RPE-choroid-komplekset. Eksplanter ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av PDE6-hemmeren zaprinast (100 μM, 200 μM og 400 μM) for å indusere cGMP-PKG-signalveien. Fotoreseptorcelledød ble kvantifisert og analysert ved hjelp av TUNEL-analysen, og cGMP-akkumulering i eksplanter ble verifisert via immunfluorescens. Gitt den høye graden av likhet med hensyn til cellefordeling og morfologi, retinallagtykkelse og andre fysiologiske egenskaper av retina mellom aper og mennesker, kan etableringen av cGMP-PKG-signalveien i in vitro retinalmodellen lette fremtidig forskning på patogenesen av RD, samt studier av utvikling og toksikofarmakologi av nye legemidler til RD-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestudien ble gjennomgått og godkjent av Ethics Review Committee of Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences (IACUC-PE-2022-06-002), og dyreetikkgjennomgang og dyreprotokoll fra Yunnan University (YNU20220149).
1. Fremstilling av retinal explants
- Få primatøyeboller fra villtype makaker, i alderen 1 til 3 år, lagre i vevslagringsløsning, og transport på is innen 3 timer etter enukleasjon etter at apene ble ofret eller etter naturlig død.
- For fremstilling av proteinase K-oppløsning, oppløs 25 mg proteinase K i 250 μL destillert vann, og tilsett deretter 225 μL av oppløsningen til 18,5 ml basalmedium (R16).
- Vask øyeeplene i 10 ml 5% povidon-jod (povidon-jod: vann = 1:19) i 30 s og dypp dem i 5% penicillin / streptomycin (PEN / STREP) :p hosfatbufret saltvann = 1:19 i 1 min for å unngå bakteriell forurensning. Deretter inkuberer øyebollene i 10 ml R16 medium i 5 minutter.
- Forvarm proteinase K-løsningen i en 37 ° C inkubator. Deretter senker øyebollene i 10 ml proteinase K-løsning og inkuberer i 2 minutter. Dyp øyebollene i 10 ml R16 + føtal bovint serum (1: 1) løsning, inkuber i 5 minutter, og overfør deretter øyebollene til 10 ml fersk R16 for en endelig vask.
- Skill ut sclera, hornhinnen, iris, linsen og glasslegemet, og kutt netthinnen fra 4 sider med pinsett og saks (figur 1A-L).
- Skjær retinale eksplanter med trefinblader i fem seksjoner - et 4 mm trefinblad for nasal / temporal / overlegen / underordnet side og et 6 mm trefinblad for sentralsiden (som inneholder optisk disk og makula; Figur 1M-O). Skjær i følgende avstand fra synsnervehodet: 1,5 mm for nasal, 4 mm for temporal og 2 mm for både øvre og nedre side.
- Overfør retina explants (som inneholder retina og choroid) med øyelokksdemper og plasser dem i midten av innsatsen, fotoreseptorsiden opp (figur 1P). Plasser ca. 1 ml komplett medium (R16 supplert med BSA, transferrin, progesteron, insulin, T3, kortikosteron, vitamin B1, vitamin B12, retinol, retinylacetat, DL-tokoferol, tokoferylacetat, linolsyre, L-cystein HCl, glutation, glutamin, vitamin C) under membranen på platen for å dekke netthinnen helt.
2. Primat retinal explant kultur
- Kultur retinal explants i komplett medium og sted i en 37 ° C inkubator luftet med fuktet 5% CO2.
- Påfør medikamentell behandling med passende konsentrasjon til retinalkulturmediet (f.eks. zaprinast i konsentrasjoner på 100 μM, 200 μM eller 400 μM). Bruk minst tre eksplanter per behandlingstilstand og bruk eksplanter uten medikament som kontroll. Behandle med stoffet i 4 dager.
3. Feste og kryoseksjonering
- Inkuber retinale eksplanter med 1 ml paraformaldehyd (PFA) i 45 minutter, skyll dem kort med 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS), og inkuber deretter med 10% sukrose i 10 minutter, 20% sukrose i 20 minutter og 30% sukrose i 30 minutter (1 ml for hver retina explant).
- Klipp retinale eksplanter ved hjelp av trefinblader for å sikre konsistens i størrelsen på eksplantene hentet fra forskjellige steder med følgende egenskaper: fire kvadranter i periferien, 6 mm i midten. Overfør deretter retinale eksplanter til en blikkboks (ca. 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) med O.C.T. innebyggingsmedium for å dekke vevet. Frys umiddelbart vevsseksjonene i flytende nitrogen og legges i et kjøleskap på -20 °C for oppbevaring.
- Bruk et skarpt blad til å trimme agar i en liten blokk som inneholder vevsprøven, kutt prøveblokkene i 10 μm seksjoner, og legg dem på adhesjonsmikroskopglass ved hjelp av en myk børste. Tørk deretter i 45 minutter ved 40 °C og oppbevares ved -20 °C til bruk.
4. Immunhistokjemi (figur 2)
- cGMP-farging
- Tørk lysbildene og tegne en hydrofob ring rundt retinalseksjonene med en flytende blokkeringspenn for å dekke prøvene.
- Dypp lysbildene i 200 μL med 0,3 % fosfatbuffersaltvann og Triton X-100 per lysbilde (PBST) i 10 minutter ved romtemperatur, og deretter i blokkeringsløsning (5 % normalt eselserum, 0,3 % PBST, 1 % BSA, 200 μL per lysbilde) i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber prøvene over natten med det primære antistoffet (1:250, saueanti-cGMP, 200 μL per lysbilde) fremstilt i blokkeringsløsningen ved 4 °C, og skyll deretter med PBS i 10 minutter (200 μL per lysbilde) 3x.
- Inkuber prøvene med sekundært antistoff (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 200 μL per lysbilde) i 1 time ved romtemperatur, og skyll deretter med PBS i 10 min, 3x. Dekk prøvene med et antifademonteringsmedium som inneholder 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), og oppbevar ved 4 °C i minst 30 minutter før avbildning.
- TUNEL farging
- Tørk lysbildene ved romtemperatur i 15 minutter og tegn en vannavvisende barrierering rundt netthinnevevsprøver med væskeblokkerpennen, og inkuber dem deretter i 40 ml PBS i 15 minutter.
- Inkuber lysbilder i 42 ml (per fem lysbilder) TBS (0,05 M Tris-buffer) ved 37 °C. Aspirer ut TBS, og inkuber prøvene med 6 μL proteinase K i 5 minutter. Deretter vasker du lysbildene 3x med TBS i 5 min hver gang.
- Utsett lysbildene til 40 ml etanol-eddiksyreoppløsning i choplin, dekk med et gjennomsiktig ark og inkuber ved -20 ° C i 5 minutter. Vask lysbildene 3x med TBS i 5 min hver gang.
- Utsett lysbildene for blokkeringsløsning (1% BSA, 200-300 μL per lysbilde i henhold til kravet) og inkuber i et fuktighetskammer i 1 time.
- Forbered TUNEL-settoppløsning, TMR-rød, i følgende forhold: 62,50 μL blokkeringsløsning (1% BSA), 56,25 μL merkeoppløsning (TMR-dUTP) og 6,25 μL av enzymet (andel for hvert lysbilde). Tilsett ca. 130 μL av denne oppløsningen per lysbilde og inkuber ved 37 °C i 1 time. Deretter vasker du lysbildene med PBS i 5 min (200 μL per lysbilde), 2x.
- Plasser dekkslides inneholdende 1-2 dråper antifademonteringsmedium med DAPI over prøvene, og inkuber deretter lysbildene ved 4 °C i minst 30 minutter før avbildning.
- cGMP-farging kombinert med TUNEL-farging
- cGMP-farging ble etterfulgt av TUNEL-farging. Følg trinnene for TUNEL-farging fra trinn 4.2.1 til trinn 4.2.5, og fortsett deretter trinnene for cGMP-farging fra trinn 4.1.2 til trinn 4.1.4.
- Utfør lys- og fluorescensmikroskopi med kameraparametere som følger: eksponeringstid = 125 ms, avkastningsstørrelse = 2752 x 2208, farge = B / M. Ta bilder ved hjelp av programvaren. Se for deg fire forskjellige felt med et digitalkamera ved 20x forstørrelse fra hver seksjon og få representative bilder fra de sentrale områdene av netthinnen ved hjelp av DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), med Z-Stack-skanning med et intervall = 1 μm og valgfritt = 1.251 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble Macaque monkey retinal explant kultur utført ved hjelp av eksplanter som inneholder retina-RPE-choroid-komplekset (figur 1, tilleggsfigur S1). Sammenlignet med in vitro-kulturen av retinale celler ved bruk av retina uten vedlagt RPE og choroid, letter vår eksplantkultur bedre celleoverlevelse og forlenger følgelig overlevelsen av fotoreceptorceller.
Vi brukte ulike konsentrasjoner av PDE6-hemmeren zaprinast (100 μM, 200 μM og 400 μM; Tilleggsfigur S2) indusere akkumulering av cGMP i fotoreseptorer og påfølgende aktivering av PKG in vitro. Hver konsentrasjonsbehandling ble gitt i henholdsvis 4 dager. Behandlingen av in vitro retinalmodellen med 400 μM zaprinast viste det største antallet TUNEL-positive celler, et signifikant cGMP-signal og lav toksisitet for RPE og nevronceller i den indre netthinnen. Den høye andelen TUNEL-positive celler i figur 2 antydet at økende cGMP-aktivitet kan forbedre zaprinast-indusert retinalcelledegenerasjon, og cGMP-akkumulering spiller en rolle i fotoreceptordegenerasjon. Den makake retinal degenerasjonsmodellen etablert i denne studien vil tjene til omfattende undersøkelser av mekanismene for cGMP-PKG-avhengig RP.
Figur 1: Produksjonsprosess av dyrking av netthinneplanter hos 1 år gamle makaker. (A-L) Skill ut sclera, hornhinnen, iris, linsen og glasslegemet, og kutt netthinnen fra fire sider med pinsett og saks. (VG Nett) Skjær retinaleksplantene med trefinblader i fem seksjoner - et 4 mm trefinblad for nasal/temporal/superior/inferior side, og et 6 mm trefinblad for midtsiden (inneholdende optisk skive og makula). (P) Overfør retinal explants (som inneholder retina og choroid) sommerfugl åpen til membranen og plasser membranen på en 6-brønns kulturplate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Evaluering av cGMP-aktiviteter innenfor ONL av retinale eksplanter av 1 år gammel ape. Explants ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av PDE6-hemmeren zaprinast (100 μM, 200 μM og 400 μM). Antallet TUNEL (røde) og cGMP (grønne) positive celler i de tre forskjellige konsentrasjonene var sterkt økt i ONL sammenlignet med kontroll (A-D). Sammenlignet med kontrollgruppen har TUNEL/cGMP-positive celler signifikante forskjeller i gruppene 100 μM, 200 μM og 400 μM. Kjerner ble farget med DAPI (blå). Et område av netthinnen behandlet med 400 μM zaprinast ble forstørret for å observere cGMP (grønne) og TUNEL (røde) positive celler alene, samt et sammenslått bilde. Feilfelt representerer standardavvik (SD); * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; = p ≤ 0,001; = p ≤ 0,0001. Forkortelser: GC = ganglionceller, INL = indre kjernelag, ONL = ytre nukleært lag, RPE = retinalpigmentepitel, cGMP = syklisk guanosinmonofosfat, PDE6 = fosfodiesterase 6. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Plassering av netthinneslag brukt til eksplantekulturer. Eksplanter avledet fra neseslag var lokalisert 1,5 mm fra synsnervehodet, mens denne avstanden var 4 mm for temporal og 2 mm for henholdsvis superior og inferior slag. Netthinneplanter ble oppnådd ved å kutte med trefinblader på fem steder - et 4 mm trefinblad for nasal/temporal/superior/inferior side og et 6 mm trefinblad for midtsiden (inneholdende optisk skive og makula). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: TUNEL-farging for døende celler. Kontroller netthinnen (A) og netthinner behandlet med Zaprinast i konsentrasjoner på 100 μM, 200 μM eller 400 μM (B-D). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Visuell fototransduksjon refererer til den biologiske prosessen der lyssignaler omdannes til elektriske signaler av fotoreceptorceller i øyets netthinne. Fotoreceptorceller er polariserte nevroner som er i stand til fototransduksjon, og det finnes to forskjellige typer fotoreceptorer kalt stenger og kegler etter formene til deres ytre segmenter. Stenger er ansvarlige for skotopisk syn og kjegler er ansvarlige for fotopisk og høy skarphetssyn. Arvelig RD relaterer seg til nevrodegenerative sykdommer karakterisert ved progressiv retinal fotoreceptorcelledød15.
Nåværende forskning på RD har hovedsakelig vært basert på musemodeller av RD, inkludert in vitro retinal explantkulturer avledet fra murine RD-modeller16. Imidlertid eksisterer det betydelige genetiske og fysiologiske forskjeller, spesielt i netthinnestruktur, mellom mus og mennesker. I motsetning til dette deler NHP en høy grad av likhet med mennesker, noe som gjør NHP-modeller mest hensiktsmessige for undersøkelsen av RD-patogenese og terapiutvikling.
I denne studien etablerte vi en in vitro NHP-modell ved å dyrke retinale eksplanter av makaker. Sammenlignet med rutinemessig enkeltcelle primærkultur og en in vitro-kultur av immortaliserte cellelinjer, kan en in vitro retinal eksplantkultur bevare retinal vevskonformasjon og intercellulære interaksjoner, noe som muliggjør bedre simulering av in vivo-forhold. I tillegg reduserer det i stor grad antall dyr som brukes og forkorter eksperimentell varighet, og gir en relativt kontrollerbar eksperimentell tilnærming for å undersøke effekten av ulike faktorer involvert i retinal utvikling eller degenerasjon.
Vellykket tilberedning av retinale eksplanter er avgjørende for vellykket etablering av in vitro retinale modeller. Basert på vår tidligere forskningserfaring med å forberede retinal explants for mus, oppsummerer vi her flere viktige punkter for monkey retinal explant forberedelse:
1) Forberedelse av planter må utføres så snart som mulig etter dyreofring og enukleasjon. Bruk av en vevslagringsløsning for oppbevaring av øyeeplet før bruk i eksplantpreparasjon anbefales, da det muliggjør bedre vedlikehold av cellens levedyktighet sammenlignet med fosfatbufret saltvann.
2) Tatt i betraktning den store størrelsen på apeøyeboller og de lange perioder med eksponering for ytre miljø, kan vasking av øyebollene med fortynnet povidoniodofor og en dobbel antibiotikaoppløsning før retinal explant-forberedelse redusere forurensninger. Vasking bør imidlertid ikke utføres i for lang varighet. Tilsetning av antibiotika under eksplantekultur anbefales ikke, da det kan påvirke cellens levedyktighet.
3) Enucleated eyeballs ble utsatt for en sekvensiell separasjon av sclera, hornhinnen, iris, linse og glasslegeme etterfulgt av kutting av netthinnen. I motsetning til mus øyeboller, som er små og hvor sclera og uvea er tett festet til hverandre, er monkey eyeballs relativt store og har en tøff sclera og suprachoroidal plass. Derfor er saks nødvendig for separasjon av sclera. Selv om dette ikke er et vanskelig skritt i håndteringen av enucleated monkey eyeballs, må det utvises forsiktighet for å unngå å skade retina og uvea. I tillegg må det tøffe fjærende ligamentet til apelinsen kuttes med saks før objektivet fjernes forsiktig. Separasjon av glasslegemet er et av de mest tidkrevende trinnene i eksplantasjonsprosessen på grunn av det store glasslegemet i apeøyet, den høye viskositeten til glasslegemet og det faste vedlegget av glasslegemet med netthinnen hos aper i alderen 1-3 år. Glasslegemet ble fjernet i størst mulig grad ved hjelp av saks og en pipette ble brukt for å lette den påfølgende overføringen og kulturen av retinale eksplanter. Vi er for tiden i ferd med å utforske raskere og mer effektive metoder for fjerning av glasslegemet. Retinale eksplanter (5 mm) ble kuttet ved hjelp av trefinblader for å sikre konsistens i størrelsen på eksplantene hentet fra forskjellige steder (stedegenskaper: fire kvadranter i periferien, 6 mm i midten). Under overføring av eksplanter til kulturinnsatser kan retina og choroid bli separert. Derfor er det nødvendig med skånsom og kvikk håndtering for å sikre at eksplantene overføres under selve første forsøket, da gjentatte forsøk kan forårsake netthinneskader. Til slutt bør mekanisk skade minimeres i størst mulig grad under hele retinal explant-forberedelsesprosessen for å unngå å skade retinalstrukturen. Tiden det tar for eksplantpreparasjon bør også minimeres for å unngå utilsiktet celledød.
4) Retinal eksplantkultur ble utført ved hjelp av eksplanter som inneholdt retina-RPE-choroid-komplekset. Sammenlignet med in vitro-kulturen av retinale celler ved bruk av retina uten vedlagt RPE og choroid, tillater vår eksplantkultur bedre celleoverlevelse og forlenger følgelig overlevelsen av fotoreceptorceller. Under kulturprosessen vender netthinnen oppover og årehinnen vender nedover. Sammenlignet med mus retinal explants er monkey retinal explants større i størrelse, noe som stiller større krav til kulturernæring. Derfor utførte vi daglige kulturmediumendringer for ape-retinal explant-kulturen i stedet for å vedta en kulturmediumendringsfrekvens på en gang hver 2. dag, som tidligere ble brukt til musens retinale eksplantkultur.
Samlet har vi etablert en in vitro NHP-modell gjennom kulturen av retinale eksplanter av makaker og deres behandling med zaprinast for å indusere cGMP-PKG-signalveien som ligner den som observeres i RD-patogenesen. Zaprinast er en PDE6-hemmer, og PDE6 opprettholder balansen mellom den intracellulære konsentrasjonen av cGMP som aktiverer PKG17,18. cGMP-PKG-banen kan negativt regulere oksidativ fosforylering og mitokondrieveier, og dermed påvirke retinal degenerasjon19. Induksjonen av cGMP-PKG-signalveien i denne in vitro NHP retinalmodellen etablerer den som en gunstig modell for fremtidig forskning på patogenesen av RD, samt for utvikling og toksikofarmakologi testing av nye legemidler til RD-behandling. Likevel har bruken av denne modellen noen begrensninger, spesielt dens relativt korte dyrkingsperioder, og de relativt høye kostnadene for primater. I løpet av vår fremtidige forskning vil denne in vitro-modellen bli brukt til postintervensjonsfunksjonell evaluering av netthinnen ved bruk av MEA og μERG. Informasjon og cellulære plasseringer av PKG-mål vil bli kombinert med måling av aktiviteter fra nedstrøms effektorer (f.eks. calpain, PARP og HDAC) og undersøkelser av relevante nevrodegenerative mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81960180), Zinke heritage foundation, og Charlotte og Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Vi takker Prof. Longbao Lv (Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming, Kina) for å dele apeøyebollene som ble brukt i denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
