Summary
Explantes retinianos obtidos de macacos selvagens foram cultivados in vitro. A degeneração retiniana e a via de sinalização GMPc-PKG foram induzidas com o uso do inibidor de PDE6 zaprinast. O acúmulo de GMPc nos explantes em diferentes concentrações de zaprinast foi verificado por imunofluorescência.
Abstract
A degeneração hereditária da retina (DR) é caracterizada pela morte progressiva das células fotorreceptoras. A superativação da via da proteína quinase dependente de guanosina monofosfato (GMPc) cíclica (PKG) em células fotorreceptoras causa morte celular fotorreceptora, especialmente em modelos que abrigam mutações na fosfodiesterase 6b (PDE6b). Estudos prévios sobre DR utilizaram principalmente modelos murinos, como camundongos rd1 ou rd10 . Dadas as diferenças genéticas e fisiológicas entre camundongos e humanos, é importante entender até que ponto as retinas de primatas e roedores são comparáveis. Os macacos compartilham um alto nível de semelhança genética com os seres humanos. Portanto, macacos selvagens (com idade entre 1-3 anos) foram selecionados para o cultivo in vitro de explantes da retina que incluíram o complexo retina-epitélio pigmentar da retina (EPR)-coroide. Esses explantes foram tratados com diferentes concentrações do inibidor de PDE6 zaprinast para induzir a via de sinalização GMPc-PKG e simular a patogênese da DR. O acúmulo de GMPc e a morte celular em explantes de retina de primatas foram posteriormente verificados usando imunofluorescência e o ensaio TUNEL. O modelo de retina de primatas estabelecido neste estudo pode servir para estudos relevantes e efetivos sobre os mecanismos da DR dependente de GMPc-PKG, bem como para o desenvolvimento de futuras abordagens de tratamento.
Introduction
A degeneração hereditária da retina (DR) é caracterizada pela morte progressiva das células fotorreceptoras e causada por mutações em uma grande variedade de genes patogênicos1. O resultado final da DR é a perda da visão e, na grande maioria dos casos, a doença permanece intratável até hoje. Portanto, é importante estudar os mecanismos celulares que levam à morte dos fotorreceptores usando modelos que representem fielmente a condição da doença humana. Aqui, os modelos baseados em primatas são de particular interesse devido à sua proximidade com os humanos. Notadamente, tais modelos podem avançar no desenvolvimento de intervenções terapêuticas apropriadas que possam deter ou retardar a morte celular dos fotorreceptores.
Pesquisas prévias sobre os mecanismos de morte celular na DR demonstraram que a diminuição ou perda da atividade da fosfodiesterase 6 (PDE6) causada por mutações no gene desencadeante da DR leva à redução da hidrólise do monofosfato de guanosina cíclico (GMPc)2,3. O GMPc é um agonista específico dos canais iônicos dependentes de nucleotídeo cíclico (CNGCs) nos segmentos externos dos bastonetes (ROSs) e também é uma molécula-chave responsável pela conversão de sinais luminosos em sinais elétricos em células fotorreceptoras devertebrados4. A hidrólise reduzida do GMPc causa o acúmulo de GMPc em ROSs, levando à abertura de CNGCs 5. Consequentemente, as vias de fototransdução são ativadas, resultando em um aumento nas concentrações de cátions nas células fotorreceptoras. Esse processo impõe uma carga metabólica aos fotorreceptores, que quando superativados, por exemplo, por mutações na PDE6, podem causar morte celular.
Muitos estudos têm demonstrado que um acúmulo significativo de GMPc em fotorreceptores de modelos de camundongos com diferentes mutações no gene da DR pode causar a ativação da proteína quinase dependente de GMPc (PKG)3,6. Isso leva a um aumento substancial de células TUNEL-positivas e a um afinamento gradual da camada de células fotorreceptoras. Estudos prévios sugerem que a superativação de PKG causada por níveis elevados de GMPc é uma condição necessária e suficiente para a indução de morte de células fotorreceptoras 2,5. Estudos em diferentes modelos murinos de DR também mostraram que a ativação de PKG induzida por níveis elevados de GMPc em fotorreceptores leva à superativação de efetores a jusante, como poli-ADP-ribose polimerase 1 (PARP1), histona desacetilase (HDAC) e calpaína 2,7,8,9. Isso implica associações causais entre essas diferentes proteínas-alvo e a morte de células fotorreceptoras.
No entanto, pesquisas anteriores sobre a patologia, toxicofarmacologia e terapia da DR foram baseadas principalmente em modelos murinos para DR10,11,12. No entanto, ainda persistem imensas dificuldades na tradução clínica desses resultados. Isso se deve às consideráveis diferenças genéticas e fisiológicas entre camundongos e humanos, especialmente no que diz respeito à estrutura da retina. Em contraste, primatas não humanos (NHPs) também compartilham um alto grau de similaridade com humanos no que diz respeito a características genéticas, padrões fisiológicos e regulação de fatores ambientais. Por exemplo, a terapia optogenética foi investigada como um meio de restaurar a atividade retiniana em um modelo de PNH13. Lingam e seus colegas demonstraram que as células precursoras de fotorreceptores da retina derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos de boa prática de fabricação podem resgatar danos ao fotorreceptor do cone no NHP14. Portanto, modelos de PNH são importantes para a exploração da patogênese da DR e o desenvolvimento de métodos de tratamento eficazes. Em particular, modelos de PNH de DR, exibindo mecanismos patogênicos semelhantes aos de humanos, poderiam desempenhar um papel crítico em estudos sobre o desenvolvimento e análise toxicofarmacológica in vivo de novos fármacos.
Tendo em vista o longo ciclo de vida, o alto nível de dificuldades técnicas e o alto custo envolvido no estabelecimento de modelos in vivo de primatas, estabelecemos um modelo in vitro de primata não humano (NHP) usando culturas de retina de macaco explantado. Primeiramente, macacos selvagens com idade entre 1 e 3 anos foram selecionados para cultivo in vitro de explantes da retina, que incluíram o complexo retina-EPR-coróide. Os explantes foram então tratados com diferentes concentrações do inibidor de PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM) para induzir a via de sinalização GMP-PKG. A morte de células fotorreceptoras foi quantificada e analisada pelo ensaio TUNEL e o acúmulo de GMPc nos explantes foi verificado por imunofluorescência. Dado o alto grau de similaridade com relação à distribuição e morfologia celular, espessura da camada retiniana e outras características fisiológicas da retina entre macacos e humanos, o estabelecimento da via de sinalização GMPc-PKG no modelo retiniano in vitro pode facilitar futuras pesquisas sobre a patogênese da DR, bem como estudos sobre o desenvolvimento e toxicofarmacologia de novas drogas para o tratamento da DR.
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Protocol
O estudo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Revisão de Ética do Instituto de Zoologia da Academia Chinesa de Ciências (IACUC-PE-2022-06-002), e revisão de ética animal e protocolo animal da Universidade de Yunnan (YNU20220149).
1. Preparação de explantes de retina
- Obter globos oculares de primatas de macacos selvagens, com idades entre 1 e 3 anos de idade, armazenar em solução de armazenamento de tecidos e transportá-los no gelo dentro de 3 h após a enucleação após o sacrifício dos macacos ou após a morte natural.
- Para a preparação da solução de proteinase K, dissolver 25 mg de proteinase K em 250 μL de água destilada e, em seguida, adicionar 225 μL da solução a 18,5 ml de meio basal (R16).
- Lavar os globos oculares em 10 mL de iodopovidona a 5% (iodopovidona: água = 1:19) por 30 s e mergulhá-los em penicilina/estreptomicina a 5% (PEN/STREP):p solução salina tamponada com hosfato = 1:19 por 1 min para evitar contaminação bacteriana. Em seguida, incubar os globos oculares em 10 mL de meio R16 por 5 min.
- Pré-aqueça a solução de proteinase K em incubadora a 37 °C. Em seguida, imergir os globos oculares em 10 mL de solução de proteinase K e incubar por 2 min. Imergir os globos oculares em 10 mL de solução de R16 + soro fetal bovino (1:1), incubar por 5 min e, em seguida, transferir os globos oculares para 10 mL de R16 fresco para uma lavagem final.
- Separe a esclera, córnea, íris, cristalino e corpo vítreo e corte a retina de 4 lados com pinça e tesoura (Figura 1A-L).
- Cortar explantes de retina com lâminas de trefina em cinco seções - uma lâmina de trefina de 4 mm para o lado nasal/temporal/superior/inferior e uma lâmina de trefina de 6 mm para o lado central (contendo disco óptico e mácula; Figura 1M-O). Corte à seguinte distância da cabeça do nervo óptico: 1,5 mm para o lado nasal, 4 mm para o temporal e 2 mm para o lado superior e inferior.
- Transferir os explantes de retina (contendo retina e coroide) com depressor palpebral e colocá-los no meio da inserção, fotorreceptor de lado para cima (Figura 1P). Coloque aproximadamente 1 mL de meio completo (R16 suplementado com BSA, transferrina, progesterona, insulina, T3, corticosterona, vitamina B1, vitamina B12, retinol, acetato de retinila, DL-tocoferol, acetato de tocoferol, ácido linoleico, L-cisteína HCl, glutationa, glutamina, vitamina C) abaixo da membrana na placa para cobrir totalmente a retina.
2. Cultura de explantes retinianos de primatas
- Cultivar explantes de retina em meio completo e colocar em estufa a 37 °C aerada com 5% de CO2 umedificada.
- Aplicar o tratamento medicamentoso em concentração apropriada no meio de cultura da retina (por exemplo, zaprinast em concentrações de 100 μM, 200 μM ou 400 μM). Utilizar pelo menos três explantes por condição de tratamento e utilizar explantes sem fármaco como controle. Tratar com droga por 4 dias.
3. Fixação e criosseccionamento
- Incubar explantes da retina com 1 mL de paraformaldeído (PFA) por 45 min, lavá-los brevemente com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, incubar com sacarose a 10% por 10 min, sacarose a 20% por 20 min e sacarose a 30% por 30 min (1 mL para cada explante de retina).
- Cortar explantes de retina utilizando lâminas de trefina para garantir consistência no tamanho dos explantes obtidos de diferentes locais com as seguintes características: quatro quadrantes na periferia, 6 mm no centro. Em seguida, transfira os explantes da retina para uma caixa de flandres (cerca de 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) com meio de incorporação O.C.T. para cobrir o tecido. Congele imediatamente as secções de tecido em azoto líquido e coloque num frigorífico a -20 °C para armazenamento.
- Use uma lâmina afiada para aparar o ágar em um pequeno bloco contendo a amostra de tecido, corte os blocos de amostra em seções de 10 μm e coloque-os em lâminas de microscópio de adesão usando uma escova macia. Em seguida, secar por 45 min a 40 °C e armazenar a -20 °C até o uso.
4. Imuno-histoquímica (Figura 2)
- Coloração GMPc
- Seque as lâminas e desenhe um anel hidrofóbico ao redor das seções da retina com uma caneta bloqueadora de líquido para cobrir as amostras.
- Imergir as lâminas em 200 μL de solução salina tampão fosfato a 0,3% e Triton X-100 por lâmina (PBST) por 10 min à temperatura ambiente e, em seguida, em solução de bloqueio (5% de soro de burro normal, 0,3% PBST, 1% BSA, 200 μL por lâmina) por 1 h à temperatura ambiente.
- Incubar as amostras durante a noite com o anticorpo primário (1:250, anti-GMPc de ovelha, 200 μL por lâmina) preparado na solução de bloqueio a 4 °C e, em seguida, enxaguar com PBS por 10 min (200 μL por lâmina) 3x.
- Incubar as amostras com anticorpo secundário (1:300, Burro anti ovino Alxea Fluor 488, 200 μL por lâmina) por 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, enxaguar com PBS por 10 min, 3x. Cobrir as amostras com um meio de montagem antifade contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e conservar a 4 °C durante, pelo menos, 30 minutos antes da obtenção de imagens.
- Coloração TUNEL
- Secar as lâminas à temperatura ambiente por 15 min e desenhar um anel de barreira hidrorrepelente ao redor de amostras de tecido da retina com a caneta bloqueadora de líquido e, em seguida, incubá-las em 40 mL de PBS por 15 min.
- Incubar as lâminas em 42 mL (por cinco lâminas) de TBS (0,05 M Tris-buffer) a 37 °C. Aspirar a TBS e incubar as amostras com 6 μL de proteinase K por 5 min. Em seguida, lave as lâminas 3x com TBS por 5 min de cada vez.
- Expor as lâminas a 40 mL de solução de etanol-ácido acético na choplin, cobrir com uma folha transparente e incubar a -20 °C por 5 min. Lave as lâminas 3x com TBS por 5 min de cada vez.
- Expor as lâminas à solução de bloqueio (BSA a 1%; 200-300 μL por lâmina conforme a necessidade) e incubar em uma câmara de umidade por 1 h.
- Preparar a solução do kit TUNEL, vermelho TMR, na seguinte proporção: 62,50 μL de solução de bloqueio (BSA a 1%), 56,25 μL de solução de marcação (TMR-dUTP) e 6,25 μL de enzima (proporção para cada lâmina). Adicionar cerca de 130 μL desta solução por lâmina e incubar a 37 °C durante 1 h. Em seguida, lave as lâminas com PBS por 5 min (200 μL por lâmina), 2x.
- Coloque as lâminas de cobertura contendo 1-2 gotas de meio de montagem antifade com DAPI sobre as amostras e, em seguida, incube as lâminas a 4 °C por pelo menos 30 minutos antes da obtenção de imagens.
- Coloração cGMP combinada com coloração TUNEL
- A coloração GMPc foi seguida pela coloração TUNEL. Siga os passos da coloração TUNEL do passo 4.2.1 ao passo 4.2.5 e, em seguida, continue os passos da coloração cGMP do passo 4.1.2 ao passo 4.1.4.
- Realizar microscopia de luz e fluorescência com os parâmetros da câmera da seguinte forma: tempo de exposição = 125 ms, tamanho da ROI = 2752 x 2208, Cor = B/M. Capture imagens usando o software. Fotografar quatro campos diferentes com uma câmera digital com aumento de 20x de cada corte e obter fotos representativas das áreas centrais da retina usando DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), com varredura Z-Stack com intervalo = 1 μm e opcional = 1,251 μm.
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Representative Results
Neste estudo, a cultura de explantes de retina de macacos macacos foi realizada utilizando explantes contendo o complexo retina-EPR-coróide (Figura 1, Figura Suplementar S1). Em comparação com a cultura in vitro de células da retina usando a retina sem o EPR e a coroide anexados, nossa cultura de explantes facilita uma melhor sobrevivência celular e, consequentemente, prolonga a sobrevivência das células fotorreceptoras.
Foram utilizadas diferentes concentrações do inibidor de PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM; Figura Suplementar S2) induzir um acúmulo de GMPc em fotorreceptores e subsequente ativação de PKG in vitro. Cada tratamento de concentração foi administrado por 4 dias, respectivamente. O tratamento do modelo retiniano in vitro com zaprinast 400 μM exibiu o maior número de células positivas para TUNEL, um sinal significativo de GMPc e baixa toxicidade para o EPR e células neuronais na retina interna. A alta proporção de células positivas para TUNEL na Figura 2 sugeriu que o aumento da atividade do GMPc pode aumentar a degeneração das células da retina induzida pelo zaprinato e o acúmulo de GMPc desempenha um papel na degeneração dos fotorreceptores. O modelo de degeneração retiniana de macaco estabelecido neste estudo servirá para investigações abrangentes sobre os mecanismos do FRy dependente de GMPc-PKG.
Figura 1: Processo de produção do cultivo de explantes de retina em macacos de 1 ano de idade. (A-L) Separe a esclera, córnea, íris, lente e corpo vítreo e corte a retina de quatro lados com pinça e tesoura. (M-O) Cortar os explantes da retina com lâminas de trefina em cinco seções - uma lâmina de trefina de 4 mm para o lado nasal/temporal/superior/inferior e uma lâmina de trefina de 6 mm para o lado central (contendo disco óptico e mácula). (P) Transfira os explantes da retina (contendo retina e coroide) abertos para a membrana e coloque a membrana em uma placa de cultura de 6 poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação das atividades do GMPc dentro da ONL de explantes retinianos de macaco com 1 ano de idade. Os explantes foram tratados com diferentes concentrações do inibidor de PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM). O número de células positivas para TUNEL (vermelho) e GMPc (verde) nas três diferentes concentrações foi fortemente aumentado no ONL quando comparado com o controle (A-D). Em comparação com o grupo controle, as células positivas para TUNEL/GMPc têm diferenças significativas nos grupos de 100 μM, 200 μM e 400 μM. Os núcleos foram corados com DAPI (azul). Uma área da retina tratada com 400 μM de zaprinast foi ampliada para observar células positivas para GMPc (verde) e TUNEL (vermelho) isoladamente, bem como uma imagem mesclada. As barras de erro representam o desvio padrão (DP); * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; = p ≤ 0,001; = p ≤ 0,0001. Abreviações: GCs = células ganglionares, INL = camada nuclear interna, ONL = camada nuclear externa, EPR = epitélio pigmentar da retina, GMPc = monofosfato de guanosina cíclico, PDE6 = fosfodiesterase 6. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar S1: Localização dos punchs de retina utilizados para culturas de explantes. Os explantes derivados dos punchs nasais localizaram-se a 1,5 mm da cabeça do nervo óptico, enquanto essa distância foi de 4 mm para temporal e 2 mm para punchs superiores e inferiores, respectivamente. Os explantes da retina foram obtidos por corte com lâminas de trefina em cinco locais - uma lâmina de trefina de 4 mm para o lado nasal/temporal/superior/inferior e uma lâmina de trefina de 6 mm para o lado central (contendo disco óptico e mácula). Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S2: Coloração TUNEL para células moribundas. Controlar retina (A) e retinas tratadas com Zaprinast em concentrações de 100 μM, 200 μM ou 400 μM (B-D). Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A fototransdução visual refere-se ao processo biológico pelo qual os sinais luminosos são convertidos em sinais elétricos por células fotorreceptoras dentro da retina do olho. As células fotorreceptoras são neurônios polarizados capazes de fototransdução, e existem dois tipos diferentes de fotorreceptores denominados bastonetes e cones após as formas de seus segmentos externos. Os bastões são responsáveis pela visão escotópica e os cones são responsáveis pela visão fotópica e de alta acuidade. A DR hereditária relaciona-se a doenças neurodegenerativas caracterizadas pela morte progressiva das células fotorreceptoras daretina15.
A pesquisa atual sobre DR tem sido baseada principalmente em modelos murinos de DR, incluindo culturas in vitro de explantes retinianos derivados de modelos murinos de DR16. No entanto, existem diferenças genéticas e fisiológicas consideráveis, especialmente na estrutura da retina, entre camundongos e humanos. Em contraste, os NHPs compartilham um alto grau de similaridade com humanos, tornando os modelos de NHP mais apropriados para a investigação da patogênese da DR e desenvolvimento de terapia.
Neste estudo, estabelecemos um modelo in vitro de NHP através da cultura de explantes retinianos de macacos. Em comparação com a cultura primária unicelular de rotina e uma cultura in vitro de linhagens celulares imortalizadas, uma cultura in vitro de explantes da retina pode preservar a conformação do tecido da retina e as interações intercelulares, o que permite uma melhor simulação das condições in vivo. Além disso, reduz em grande parte o número de animais utilizados e encurta a duração experimental, além de fornecer uma abordagem experimental relativamente controlável para investigar os efeitos de vários fatores envolvidos no desenvolvimento ou degeneração da retina.
O sucesso da preparação de explantes de retina é crucial para o estabelecimento bem-sucedido de modelos de retina in vitro . Com base em nossa experiência de pesquisa anterior na preparação de explantes de retina para camundongos, resumimos aqui vários pontos-chave para a preparação de explantes de retina de macacos:
1) O preparo dos explantes deve ser realizado o mais rápido possível após o sacrifício e enucleação dos animais. Recomenda-se o uso de uma solução de armazenamento de tecidos para o armazenamento do globo ocular antes do uso no preparo do explante, pois permite uma melhor manutenção da viabilidade celular em comparação com a solução salina tamponada com fosfato.
2) Considerando o grande tamanho dos globos oculares de macaco e os longos períodos de exposição ao ambiente externo, lavar os globos oculares com iodóforo de povidona diluído e uma solução antibiótica dupla antes do preparo do explante retiniano pode reduzir as contaminações. No entanto, a lavagem não deve ser realizada por um período excessivamente longo. A adição de antibióticos durante a cultura de explantes não é recomendada, pois pode afetar a viabilidade celular.
3) Os globos oculares enucleados foram submetidos à separação sequencial da esclera, córnea, íris, cristalino e corpo vítreo, seguida do corte da retina. Ao contrário dos globos oculares de camundongos, que são pequenos e nos quais a esclera e a úvea estão firmemente presas uma à outra, os globos oculares de macaco são relativamente grandes e possuem uma esclera resistente e espaço supracoroidal. Portanto, a tesoura é necessária para a separação da esclera. Embora esta não seja uma etapa difícil no manuseio de globos oculares de macaco enucleados, deve-se ter cuidado para evitar danificar a retina e a úvea. Além disso, o ligamento suspensor resistente da lente do macaco deve ser cortado com tesoura antes da remoção cuidadosa da lente. A separação do corpo vítreo é uma das etapas mais demoradas do processo de preparação do explante devido à grande câmara vítrea do olho do macaco, à alta viscosidade do corpo vítreo e à fixação firme do corpo vítreo com a retina em macacos com idade entre 1 e 3 anos. O corpo vítreo foi removido na maior extensão possível com tesoura e uma pipeta foi usada para facilitar a posterior transferência e cultura dos explantes da retina. Estamos atualmente no processo de explorar métodos mais rápidos e eficazes para a remoção do corpo vítreo. Explantes de retina (5 mm) foram cortados com lâminas de trefina para garantir consistência no tamanho dos explantes obtidos de diferentes locais (características do local: quatro quadrantes na periferia, 6 mm no centro). Durante a transferência dos explantes para as pastilhas de cultura, a retina e a coroide podem se separar. Portanto, o manuseio suave e ágil é necessário para garantir que os explantes sejam transferidos durante a primeira tentativa, pois tentativas repetidas podem causar danos à retina. Por fim, os danos mecânicos devem ser minimizados ao máximo durante todo o processo de preparação do explante da retina para evitar danos à estrutura retiniana. O tempo de preparo dos explantes também deve ser minimizado para evitar a morte celular inadvertida.
4) A cultura de explantes retinianos foi realizada utilizando-se explantes contendo o complexo retina-EPR-coróide. Em comparação com a cultura in vitro de células da retina usando a retina sem o EPR e a coroide anexados, nossa cultura de explantes permite uma melhor sobrevivência celular e, consequentemente, prolonga a sobrevivência das células fotorreceptoras. Durante o processo de cultura, a retina está voltada para cima e a coroide para baixo. Em comparação com os explantes da retina de camundongos, os explantes da retina de macacos são maiores em tamanho, o que exige mais da nutrição da cultura. Portanto, realizamos trocas diárias do meio de cultura para a cultura de explantes de retina de macacos em vez de adotar uma frequência de troca de meio de cultura de uma vez a cada 2 dias, que foi usada anteriormente para a cultura de explantes de retina de camundongos.
Em conjunto, estabelecemos um modelo in vitro de NHP através da cultura de explantes retinianos de macacos e seu tratamento com zaprinast para induzir a via de sinalização GMPc-PKG semelhante à observada na patogênese da DR. Zaprinast é um inibidor da PDE6, e a PDE6 mantém o balanço da concentração intracelular de GMPc que ativa a PKG17,18. A via GMPc-PKG pode regular negativamente a fosforilação oxidativa e as vias mitocondriais, afetando a degeneração retiniana19. A indução da via de sinalização GMPc-PKG neste modelo retiniano de PNH in vitro estabelece-a como um modelo favorável para futuras pesquisas sobre a patogênese da DR, bem como para o desenvolvimento e testes toxicofarmacológicos de novas drogas para o tratamento da DR. No entanto, o uso desse modelo tem algumas limitações, notadamente seus períodos de cultivo relativamente curtos e os custos relativamente altos para primatas. Durante nossas pesquisas futuras, este modelo in vitro será utilizado para a avaliação funcional da retina pós-intervenção utilizando MEA e μERG. Informações e localizações celulares de alvos PKG serão combinadas com a medição das atividades de efetores a jusante (por exemplo, calpaína, PARP e HDAC) e investigações sobre os mecanismos neurodegenerativos pertinentes.
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Disclosures
Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 81960180), da fundação de herança Zinke e da Fundação Charlotte e Tistou Kerstan, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Agradecemos ao Prof. Longbao Lv (Instituto de Zoologia, Academia Chinesa de Ciências, Kunming, China) por compartilhar os globos oculares de macaco usados neste estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
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