Summary
Los explantes retinianos obtenidos de macacos de tipo silvestre se cultivaron in vitro. La degeneración retiniana y la vía de señalización cGMP-PKG se indujeron utilizando el inhibidor de la PDE6 zaprinast. La acumulación de cGMP en los explantes a diferentes concentraciones de zaprinast se verificó mediante inmunofluorescencia.
Abstract
La degeneración retiniana hereditaria (DR) se caracteriza por la muerte celular fotorreceptora progresiva. La sobreactivación de la vía de la proteína quinasa (PKG) dependiente de guanosina monofosfato cíclico (GMPc) en las células fotorreceptoras causa la muerte celular fotorreceptora, especialmente en modelos que albergan mutaciones en la fosfodiesterasa 6b (PDE6b). Estudios previos sobre RD han utilizado principalmente modelos murinos como ratones rd1 o rd10 . Dadas las diferencias genéticas y fisiológicas entre ratones y humanos, es importante entender hasta qué punto las retinas de primates y roedores son comparables. Los macacos comparten un alto nivel de similitud genética con los humanos. Por lo tanto, se seleccionaron macacos de tipo silvestre (de 1 a 3 años) para el cultivo in vitro de explantes de retina que incluyeron el complejo retina-epitelio pigmentario retiniano (EPR)-coroides. Estos explantes fueron tratados con diferentes concentraciones del inhibidor de la PDE6 zaprinast para inducir la vía de señalización cGMP-PKG y simular la patogénesis de la DR. La acumulación de cGMP y la muerte celular en explantes retinianos de primates se verificaron posteriormente mediante inmunofluorescencia y el ensayo TUNEL. El modelo retiniano de primates establecido en este estudio puede servir para estudios relevantes y efectivos sobre los mecanismos de DR dependientes de cGMP-PKG, así como para el desarrollo de futuros enfoques de tratamiento.
Introduction
La degeneración retiniana hereditaria (DR) se caracteriza por la muerte celular fotorreceptora progresiva y es causada por mutaciones en una amplia variedad de genes patógenos1. El resultado final de la RD es la pérdida de visión y en la gran mayoría de los casos la enfermedad sigue siendo intratable hasta el día de hoy. Por lo tanto, es importante estudiar los mecanismos celulares que conducen a la muerte de los fotorreceptores utilizando modelos que representen fielmente la condición de la enfermedad humana. Aquí, los modelos basados en primates son de particular interés debido a su cercanía con los humanos. En particular, tales modelos pueden avanzar en el desarrollo de intervenciones terapéuticas apropiadas que pueden detener o retrasar la muerte de las células fotorreceptoras.
Investigaciones previas sobre los mecanismos de muerte celular en la DR han demostrado que la disminución o pérdida de la actividad de la fosfodiesterasa 6 (PDE6) causada por mutaciones del gen desencadenante de la DR conduce a una hidrólisis reducida del monofosfato de guanosina cíclico (GMPc)2,3. El GMPc es un agonista específico de los canales iónicos dependientes de nucleótidos cíclicos (CNGC) en los segmentos externos de bastones (ROS) y también es una molécula clave responsable de la conversión de señales luminosas en señales eléctricas en células fotorreceptoras de vertebrados4. La hidrólisis reducida de cGMP provoca la acumulación de cGMP en ROS, lo que lleva a la apertura de CNGC 5. En consecuencia, las vías de fototransducción se activan, lo que resulta en un aumento de las concentraciones de cationes en las células fotorreceptoras. Este proceso impone una carga metabólica a los fotorreceptores, que cuando se sobreactivan, por ejemplo, por mutaciones en la PDE6, pueden causar la muerte celular.
Muchos estudios han demostrado que una sobreacumulación significativa de GMPc en fotorreceptores de modelos de ratón con diferentes mutaciones del gen RD puede causar la activación de la proteína quinasa dependiente de cGMP (PKG)3,6. Esto conduce a un aumento sustancial de las células moribundas positivas para TUNEL y un adelgazamiento gradual de la capa celular fotorreceptora. Estudios previos sugieren que la sobreactivación del PKG causada por niveles elevados de GMPc es una condición necesaria y suficiente para la inducción de la muerte celular fotorreceptora 2,5. Los estudios en diferentes modelos de ratón de RD también han demostrado que la activación de PKG inducida por niveles elevados de cGMP en fotorreceptores, conduce a la sobreactivación de efectores aguas abajo como la poli-ADP-ribosa polimerasa 1 (PARP1), histona deacetilasa (HDAC) y calpaína 2,7,8,9. Esto implica asociaciones causales entre estas diferentes proteínas diana y la muerte celular fotorreceptora.
Sin embargo, la investigación previa sobre la patología, toxicofarmacología y terapia de la DR se basó principalmente en modelos de ratón para la DR10,11,12. Sin embargo, siguen existiendo inmensas dificultades en la traducción clínica de estos resultados. Esto se debe a las considerables diferencias genéticas y fisiológicas entre ratones y humanos, especialmente con respecto a la estructura retiniana. En contraste, los primates no humanos (NHP) también comparten un alto grado de similitud con los humanos con respecto a las características genéticas, los patrones fisiológicos y la regulación de los factores ambientales. Por ejemplo, la terapia optogenética fue investigada como un medio para restaurar la actividad retiniana en un modelo NHP13. Lingam y sus colegas demostraron que las células precursoras de fotorreceptores de retina derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos de buena fabricación pueden rescatar el daño de los fotorreceptores de cono en NHP14. Por lo tanto, los modelos de NHP son importantes para la exploración de la patogénesis de la DR y el desarrollo de métodos de tratamiento efectivos. En particular, los modelos NHP de DR, que exhiben mecanismos patogénicos similares a los de los humanos, podrían desempeñar un papel crítico en los estudios sobre el desarrollo y el análisis toxicofarmacológico in vivo de nuevos fármacos.
En vista del largo ciclo de vida, el alto nivel de dificultades técnicas y el alto costo involucrado en el establecimiento de modelos de primates in vivo , establecimos un modelo de primates no humanos in vitro (NHP) utilizando cultivos de retina de macaco explantada. En primer lugar, se seleccionaron macacos de tipo silvestre de 1 a 3 años para el cultivo in vitro de explantes de retina, que incluía el complejo retina-RPE-coroides. Los explantes se trataron con diferentes concentraciones del inhibidor de la PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM y 400 μM) para inducir la vía de señalización cGMP-PKG. La muerte celular fotorreceptora se cuantificó y analizó mediante el ensayo TUNEL, y la acumulación de cGMP en explantes se verificó mediante inmunofluorescencia. Dado el alto grado de similitud con respecto a la distribución celular y la morfología, el grosor de la capa retiniana y otras características fisiológicas de la retina entre monos y humanos, el establecimiento de la vía de señalización cGMP-PKG en el modelo retiniano in vitro puede facilitar futuras investigaciones sobre la patogénesis de la DR, así como estudios sobre el desarrollo y la toxicofarmacología de nuevos fármacos para el tratamiento de la DR.
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Protocol
El estudio en animales fue revisado y aprobado por el Comité de Revisión Ética del Instituto de Zoología de la Academia China de Ciencias (IACUC-PE-2022-06-002), y la revisión de ética animal y protocolo animal de la Universidad de Yunnan (YNU20220149).
1. Preparación de explantes retinianos
- Obtener globos oculares de primates de macacos de tipo salvaje, de 1 a 3 años de edad, almacenar en solución de almacenamiento de tejidos y transportar en hielo dentro de las 3 h de la enucleación después de que los monos fueron sacrificados o después de la muerte natural.
- Para la preparación de la solución de proteinasa K, disolver 25 mg de proteinasa K en 250 μL de agua destilada, y luego añadir 225 μL de la solución a 18,5 ml de medio basal (R16).
- Lave los globos oculares en 10 ml de povidona yodada al 5% (povidona yodada: agua = 1:19) durante 30 s y sumérjalos en penicilina/estreptomicina al 5% (PEN/STREP):p solución salina tamponada con hosfato = 1:19 durante 1 minuto para evitar la contaminación bacteriana. Luego, incubar los globos oculares en 10 ml de R16 medio durante 5 min.
- Precaliente la solución de proteinasa K en una incubadora a 37 °C. Luego, sumerja los globos oculares en 10 ml de solución de proteinasa K e incube durante 2 minutos. Sumerja los globos oculares en 10 ml de R16 + solución de suero bovino fetal (1:1), incubar durante 5 minutos y luego transfiera los globos oculares a 10 ml de R16 fresco para un lavado final.
- Separe la esclerótica, la córnea, el iris, el cristalino y el cuerpo vítreo, y corte la retina de 4 lados con pinzas y tijeras (Figura 1A-L).
- Cortar los explantes retinianos con láminas de trefina en cinco secciones: una hoja de trefina de 4 mm para el lado nasal/temporal/superior/inferior y una hoja de trefina de 6 mm para el lado central (que contiene disco óptico y mácula; Figura 1M-O). Corte a la siguiente distancia de la cabeza del nervio óptico: 1,5 mm para nasal, 4 mm para temporal y 2 mm para el lado superior e inferior.
- Transfiera los explantes de retina (que contienen retina y coroides) con depresor palpebral y colóquelos en el centro del inserto, con el lado del fotorreceptor hacia arriba (Figura 1P). Coloque aproximadamente 1 ml de medio completo (R16 suplementado con BSA, transferrina, progesterona, insulina, T3, corticosterona, vitamina B1, vitamina B12, retinol, acetato de retinilo, DL-tocoferol, acetato de tocoferilo, ácido linoleico, L-cisteína HCl, glutatión, glutamina, vitamina C) debajo de la membrana en la placa para cubrir completamente la retina.
2. Cultivo de explante retiniano de primates
- Cultivar explantes retinianos en medio completo y colocar en una incubadora a 37 °C aireada conCO2 humidificado al 5%.
- Aplique el tratamiento farmacológico a la concentración adecuada en el medio de cultivo de retina (p. ej., zaprinast a concentraciones de 100 μM, 200 μM o 400 μM). Use al menos tres explantes por condición de tratamiento y use explantes sin medicamento como control. Tratar con medicamento durante 4 días.
3. Fijación y crioseccionamiento
- Incubar los explantes retinianos con 1 ml de paraformaldehído (PFA) durante 45 min, enjuagarlos brevemente con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego incubar con sacarosa al 10% durante 10 min, sacarosa al 20% durante 20 min y sacarosa al 30% durante 30 min (1 ml por cada explante de retina).
- Cortar los explantes retinianos utilizando láminas de trefina para asegurar la consistencia en el tamaño de los explantes obtenidos de diferentes sitios con las siguientes características: cuatro cuadrantes en la periferia, 6 mm en el centro. Luego, transfiera los explantes de retina a una caja de hojalata (aproximadamente 1.5 cm x 1.5 cm x 1.5 cm) con medio de incrustación O.C.T. para cubrir el tejido. Inmediatamente, congele las secciones de tejido en nitrógeno líquido y colóquelas en un refrigerador a -20 °C para su almacenamiento.
- Use una cuchilla afilada para recortar el agar en un bloque pequeño que contenga la muestra de tejido, corte los bloques de muestra en secciones de 10 μm y colóquelos en portaobjetos de microscopio de adhesión con un cepillo suave. A continuación, secar durante 45 min a 40 °C y conservar a -20 °C hasta su uso.
4. Inmunohistoquímica (Figura 2)
- Tinción cGMP
- Seque los portaobjetos y dibuje un anillo hidrófobo alrededor de las secciones de la retina con un bolígrafo bloqueador de líquidos para cubrir las muestras.
- Sumerja los portaobjetos en 200 μL de solución salina tampón fosfato al 0,3% y Triton X-100 por portaobjetos (PBST) durante 10 minutos a temperatura ambiente, y luego en solución de bloqueo (suero de burro normal al 5%, PBST al 0,3%, BSA al 1%, 200 μL por portaobjetos) durante 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar las muestras durante la noche con el anticuerpo primario (1:250, anti-GMP de oveja, 200 μL por portaobjetos) preparado en la solución de bloqueo a 4 °C, y luego enjuagar con PBS durante 10 min (200 μL por portaobjetos) 3x.
- Incubar las muestras con anticuerpo secundario (1:300, Burro anti oveja Alxea Fluor 488, 200 μL por portaobjetos) durante 1 h a temperatura ambiente, y luego enjuagar con PBS durante 10 min, 3x. Cubrir las muestras con un medio de montaje antidecoloración que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y conservar a 4 °C durante al menos 30 minutos antes de la obtención de imágenes.
- Tinción TUNEL
- Seque los portaobjetos a temperatura ambiente durante 15 minutos y dibuje un anillo de barrera repelente al agua alrededor de las muestras de tejido retiniano con la pluma bloqueadora de líquidos, y luego incubarlos en 40 ml de PBS durante 15 minutos.
- Incubar portaobjetos en 42 ml (por cinco portaobjetos) de TBS (tampón Tris de 0,05 M) a 37 °C. Aspirar el TBS e incubar las muestras con 6 μL de proteinasa K durante 5 min. Luego, lave las diapositivas 3 veces con TBS durante 5 minutos cada vez.
- Exponga los portaobjetos a 40 ml de solución de etanol-ácido acético en la colina, cubra con una lámina transparente e incube a -20 °C durante 5 min. Lave las diapositivas 3 veces con TBS durante 5 minutos cada vez.
- Exponer los portaobjetos a una solución de bloqueo (BSA al 1%; 200-300 μL por portaobjetos según el requisito) e incubar en una cámara de humedad durante 1 h.
- Prepare la solución del kit TUNEL, TMR rojo, en la siguiente proporción: 62,50 μL de solución bloqueante (BSA al 1%), 56,25 μL de solución de marcado (TMR-dUTP) y 6,25 μL de la enzima (proporción para cada portaobjetos). Añadir aproximadamente 130 μL de esta solución por portaobjetos e incubar a 37 °C durante 1 h. Luego, lave los portaobjetos con PBS durante 5 minutos (200 μL por portaobjetos), 2x.
- Coloque portaobjetos que contengan 1-2 gotas de medio de montaje antidecoloración con DAPI sobre las muestras y, a continuación, incube los portaobjetos a 4 °C durante al menos 30 minutos antes de la obtención de imágenes.
- Tinción cGMP combinada con tinción TUNEL
- La tinción cGMP fue seguida por la tinción TUNEL. Siga los pasos de tinción TUNEL del paso 4.2.1 al paso 4.2.5, y luego continúe los pasos de tinción cGMP del paso 4.1.2 al paso 4.1.4.
- Realice microscopía de luz y fluorescencia con los parámetros de la cámara de la siguiente manera: tiempo de exposición = 125 ms, tamaño de ROI = 2752 x 2208, color = B / M. Capture imágenes utilizando el software. Imagine cuatro campos diferentes con una cámara digital con un aumento de 20x desde cada sección y obtenga imágenes representativas de las áreas centrales de la retina utilizando DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), con escaneo Z-Stack que tiene un intervalo = 1 μm y opcional = 1.251 μm.
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Representative Results
En este estudio, se realizó un cultivo de explante retiniano de mono macaco utilizando explantes que contenían el complejo retina-EPR-coroides (Figura 1, Figura Suplementaria S1). En comparación con el cultivo in vitro de células retinianas que utilizan la retina sin el EPR y la coroides adjuntos, nuestro cultivo de explante facilita una mejor supervivencia celular y, en consecuencia, prolonga la supervivencia de las células fotorreceptoras.
Se utilizaron diferentes concentraciones del inhibidor de la PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM y 400 μM; Figura suplementaria S2) para inducir una acumulación de GMPc en fotorreceptores y posterior activación de PKG in vitro. Cada tratamiento de concentración se administró durante 4 días, respectivamente. El tratamiento del modelo retiniano in vitro con zaprinast de 400 μM mostró el mayor número de células TUNEL-positivas, una señal significativa de GMPc y baja toxicidad para el EPR y las células neuronales en la retina interna. La alta proporción de células positivas para TUNEL en la Figura 2 sugirió que el aumento de la actividad de cGMP puede mejorar la degeneración de las células retinianas inducida por zaprinast y la acumulación de cGMP desempeña un papel en la degeneración de los fotorreceptores. El modelo de degeneración retiniana de macacos establecido en este estudio servirá para investigaciones exhaustivas sobre los mecanismos de la RP dependiente de cGMP-PKG.
Figura 1: Proceso de producción del cultivo de explante retiniano en macacos de 1 año de edad. (A-L) Separe la esclerótica, la córnea, el iris, el cristalino y el cuerpo vítreo, y corte la retina de cuatro lados con pinzas y tijeras. (M-O) Corte los explantes retinianos con láminas de trefina en cinco secciones: una hoja de trefina de 4 mm para el lado nasal/temporal/superior/inferior, y una hoja de trefina de 6 mm para el lado central (que contiene disco óptico y mácula). (P) Transferir los explantes retinianos (que contienen retina y coroides) abiertos a la membrana y colocar la membrana en una placa de cultivo de 6 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de las actividades de GMPc dentro del ONL de explantes retinianos de monos de 1 año de edad. Los explantes se trataron con diferentes concentraciones del inhibidor de la PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM y 400 μM). El número de células positivas TUNEL (rojo) y cGMP (verde) en las tres concentraciones diferentes aumentó considerablemente en ONL en comparación con el control (A-D). En comparación con el grupo control, las células TUNEL/cGMP positivas tienen diferencias significativas en los grupos de 100 μM, 200 μM y 400 μM. Los núcleos fueron teñidos con DAPI (azul). Un área de la retina tratada con zaprinast de 400 μM se amplió para observar células positivas cGMP (verde) y TUNEL (roja) solas, así como una imagen fusionada. Las barras de error representan la desviación estándar (DE); * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; = p ≤ 0,001; = p ≤ 0,0001. Abreviaturas: GCs = células ganglionares, INL = capa nuclear interna, ONL = capa nuclear externa, RPE = epitelio pigmentario retiniano, cGMP = monofosfato de guanosina cíclico, PDE6 = fosfodiesterasa 6. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Localización de punzones retinianos utilizados para cultivos de explantes. Los explantes derivados de punzones nasales se localizaron a 1,5 mm de la cabeza del nervio óptico, mientras que esta distancia fue de 4 mm para los punzones temporales y de 2 mm para los punzones superiores e inferiores, respectivamente. Los explantes retinianos se obtuvieron mediante corte con hojas de trefina en cinco ubicaciones: una hoja de trefina de 4 mm para el lado nasal/temporal/superior/inferior y una hoja de trefina de 6 mm para el lado central (que contiene disco óptico y mácula). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria S2: Tinción TUNEL para células moribundas. Controlar la retina (A) y las retinas tratadas con Zaprinast en concentraciones de 100 μM, 200 μM o 400 μM (B-D). Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La fototransducción visual se refiere al proceso biológico por el cual las señales de luz se convierten en señales eléctricas por las células fotorreceptoras dentro de la retina del ojo. Las células fotorreceptoras son neuronas polarizadas capaces de fototransducción, y hay dos tipos diferentes de fotorreceptores denominados bastones y conos después de las formas de sus segmentos externos. Los bastones son responsables de la visión escotópica y los conos son responsables de la visión fotópica y de alta agudeza. La DR hereditaria se relaciona con enfermedades neurodegenerativas caracterizadas por muerte celular fotorreceptora retiniana progresiva15.
La investigación actual sobre DR se ha basado principalmente en modelos murinos de DR, incluyendo cultivos de explantes retinianos in vitro derivados de modelos murinosde DR 16. Sin embargo, existen considerables diferencias genéticas y fisiológicas, especialmente en la estructura de la retina, entre ratones y humanos. En contraste, los NHP comparten un alto grado de similitud con los humanos, lo que hace que los modelos de NHP sean los más apropiados para la investigación de la patogénesis de la DR y el desarrollo de terapias.
En este estudio, establecimos un modelo de NHP in vitro mediante el cultivo de explantes retinianos de macacos. En comparación con el cultivo primario unicelular de rutina y un cultivo in vitro de líneas celulares inmortalizadas, un cultivo de explante de retina in vitro puede preservar la conformación del tejido retiniano y las interacciones intercelulares, lo que permite una mejor simulación de las condiciones in vivo. Además, reduce en gran medida el número de animales utilizados y acorta la duración experimental, y proporciona un enfoque experimental relativamente controlable para investigar los efectos de diversos factores involucrados en el desarrollo o la degeneración de la retina.
La preparación exitosa de los explantes de retina es crucial para el establecimiento exitoso de modelos retinianos in vitro . Basándonos en nuestra experiencia previa de investigación en la preparación de explantes retinianos para ratones, resumimos aquí varios puntos clave para la preparación del explante retiniano de mono:
1) La preparación del explante debe realizarse tan pronto como sea posible después del sacrificio y la enucleación del animal. Se recomienda el uso de una solución de almacenamiento de tejido para el almacenamiento del globo ocular antes de su uso en la preparación de explantes, ya que permite un mejor mantenimiento de la viabilidad celular en comparación con la solución salina tamponada con fosfato.
2) Teniendo en cuenta el gran tamaño de los globos oculares de mono y los largos períodos de exposición al ambiente externo, lavar los globos oculares con yodoforo de povidona diluido y una solución antibiótica dual antes de la preparación del explante retiniano puede reducir las contaminaciones. Sin embargo, el lavado no debe realizarse durante un período excesivamente largo. No se recomienda la adición de antibióticos durante el cultivo de explantes, ya que puede afectar la viabilidad celular.
3) Los globos oculares enucleados se sometieron a una separación secuencial de la esclerótica, la córnea, el iris, el cristalino y el cuerpo vítreo seguida del corte de la retina. A diferencia de los globos oculares de ratón, que son pequeños y en los que la esclerótica y la úvea están estrechamente unidas entre sí, los globos oculares de mono son relativamente grandes y poseen una esclerótica dura y un espacio supracoroideo. Por lo tanto, se requieren tijeras para la separación de la esclerótica. Aunque este no es un paso difícil en el manejo de los globos oculares de mono enucleados, se debe tener cuidado para evitar dañar la retina y la úvea. Además, el duro ligamento suspensorio de la lente del mono debe cortarse con tijeras antes de retirar cuidadosamente la lente. La separación del cuerpo vítreo es uno de los pasos más lentos del proceso de preparación del explante debido a la gran cámara vítrea del ojo de mono, la alta viscosidad del cuerpo vítreo y la firme unión del cuerpo vítreo con la retina en monos de 1 a 3 años. El cuerpo vítreo se extrajo en la mayor medida posible con tijeras y se utilizó una pipeta para facilitar la posterior transferencia y cultivo de los explantes retinianos. Actualmente estamos en el proceso de explorar métodos más rápidos y efectivos para la eliminación del cuerpo vítreo. Los explantes retinianos (5 mm) se cortaron con cuchillas de trefina para asegurar la consistencia en el tamaño de los explantes obtenidos de diferentes sitios (características del sitio: cuatro cuadrantes en la periferia, 6 mm en el centro). Durante la transferencia de explantes a inserciones de cultivo, la retina y la coroides pueden separarse. Por lo tanto, se requiere un manejo suave y ágil para garantizar que los explantes se transfieran durante el primer intento, ya que los intentos repetidos pueden causar daño a la retina. Por último, el daño mecánico debe minimizarse en la mayor medida posible durante todo el proceso de preparación del explante retiniano para evitar dañar la estructura de la retina. El tiempo necesario para la preparación del explante también debe minimizarse para evitar la muerte celular inadvertida.
4) El cultivo de explante retiniano se realizó utilizando explantes que contenían el complejo retina-EPR-coroides. En comparación con el cultivo in vitro de células retinianas utilizando la retina sin el EPR y la coroides adjuntos, nuestro cultivo de explante permite una mejor supervivencia celular y, en consecuencia, prolonga la supervivencia de las células fotorreceptoras. Durante el proceso de cultivo, la retina mira hacia arriba y la coroides hacia abajo. En comparación con los explantes de retina de ratón, los explantes de retina de mono son más grandes en tamaño, lo que impone mayores demandas en la nutrición del cultivo. Por lo tanto, realizamos cambios diarios del medio de cultivo para el cultivo de explante retiniano de mono en lugar de adoptar una frecuencia de cambio de medio de cultivo de una vez cada 2 días, que se utilizó previamente para el cultivo de explante retiniano de ratón.
En conjunto, hemos establecido un modelo de NHP in vitro a través del cultivo de los explantes retinianos de macacos y su tratamiento con zaprinast para inducir la vía de señalización cGMP-PKG similar a la observada en la patogénesis RD. Zaprinast es un inhibidor de la PDE6, y la PDE6 mantiene el equilibrio de la concentración intracelular de GMPc que activa el PKG17,18. La vía cGMP-PKG puede regular negativamente la fosforilación oxidativa y las vías mitocondriales, afectando así la degeneración retiniana19. La inducción de la vía de señalización cGMP-PKG en este modelo retiniano in vitro NHP lo establece como un modelo favorable para futuras investigaciones sobre la patogénesis de la DR, así como para el desarrollo y pruebas toxicofarmacológicas de nuevos fármacos para el tratamiento de la DR. Sin embargo, el uso de este modelo tiene algunas limitaciones, en particular, sus períodos de cultivo relativamente cortos y los costos relativamente altos para los primates. Durante nuestra investigación futura, este modelo in vitro se utilizará para la evaluación funcional posterior a la intervención de la retina utilizando MEA y μERG. La información y la ubicación celular de los objetivos de PKG se combinarán con la medición de las actividades de los efectores aguas abajo (por ejemplo, calpaína, PARP y HDAC) y las investigaciones sobre los mecanismos neurodegenerativos pertinentes.
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Disclosures
Todos los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81960180), la Fundación del Patrimonio Zinke y la Fundación Charlotte y Tistou Kerstan, Centro Médico Clínico de Enfermedades Oculares de Yunnan (ZX2019-02-01). Agradecemos al Prof. Longbao Lv (Instituto de Zoología, Academia China de Ciencias, Kunming, China) por compartir los globos oculares de mono utilizados en este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
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