Summary
Gli espianti retinici ottenuti da macachi selvatici sono stati coltivati in vitro. La degenerazione retinica e la via di segnalazione cGMP-PKG sono state indotte utilizzando l'inibitore della PDE6 zaprinast. L'accumulo di cGMP negli espianti a diverse concentrazioni di zaprinast è stato verificato utilizzando l'immunofluorescenza.
Abstract
La degenerazione retinica ereditaria (RD) è caratterizzata dalla progressiva morte delle cellule dei fotorecettori. L'iperattivazione della via ciclica della proteina chinasi dipendente dalla guanosina monofosfato (cGMP) (PKG) nelle cellule dei fotorecettori causa la morte delle cellule dei fotorecettori, specialmente nei modelli che ospitano mutazioni della fosfodiesterasi 6b (PDE6b). Precedenti studi sulla RD hanno utilizzato principalmente modelli murini come topi rd1 o rd10 . Date le differenze genetiche e fisiologiche tra topi e umani, è importante capire fino a che punto le retine di primati e roditori sono comparabili. I macachi condividono un alto livello di somiglianza genetica con gli esseri umani. Pertanto, i macachi selvatici (di età compresa tra 1-3 anni) sono stati selezionati per la coltura in vitro di espianti retinici che includevano il complesso epitelio pigmentato retinico-retinico (RPE)-coroide. Questi espianti sono stati trattati con diverse concentrazioni dell'inibitore della PDE6 zaprinast per indurre la via di segnalazione cGMP-PKG e simulare la patogenesi RD. L'accumulo di cGMP e la morte cellulare negli espianti retinici dei primati sono stati successivamente verificati utilizzando l'immunofluorescenza e il saggio TUNEL. Il modello retinico dei primati stabilito in questo studio può servire per studi pertinenti ed efficaci sui meccanismi della RD cGMP-PKG-dipendente, nonché per lo sviluppo di futuri approcci terapeutici.
Introduction
La degenerazione retinica ereditaria (RD) è caratterizzata dalla progressiva morte delle cellule dei fotorecettori ed è causata da mutazioni in un'ampia varietà di geni patogeni1. Il risultato finale della RD è la perdita della vista e nella stragrande maggioranza dei casi la malattia rimane incurabile fino ad oggi. Pertanto, è importante studiare i meccanismi cellulari che portano alla morte dei fotorecettori utilizzando modelli che rappresentino fedelmente la condizione della malattia umana. Qui, i modelli basati sui primati sono di particolare interesse a causa della loro vicinanza agli esseri umani. In particolare, tali modelli possono far progredire lo sviluppo di interventi terapeutici appropriati che possono arrestare o ritardare la morte cellulare dei fotorecettori.
Precedenti ricerche sui meccanismi di morte cellulare nella RD hanno dimostrato che la diminuzione o la perdita dell'attività della fosfodiesterasi 6 (PDE6) causata da mutazioni geniche che innescano RD porta a una ridotta idrolisi del guanosina monofosfato ciclico (cGMP)2,3. cGMP è un agonista specifico dei canali ionici ciclici nucleotide-dipendenti (CNGC) nei segmenti esterni dei bastoncelli (ROS) ed è anche una molecola chiave responsabile della conversione dei segnali luminosi in segnali elettrici nelle cellule fotorecettrici dei vertebrati4. La ridotta idrolisi del cGMP provoca l'accumulo di cGMP nei ROS, portando all'apertura dei CNGC 5. Di conseguenza, le vie di fototrasduzione vengono attivate, con conseguente aumento delle concentrazioni di cationi nelle cellule dei fotorecettori. Questo processo impone un carico metabolico sui fotorecettori, che se sovraattivato, ad esempio, da mutazioni nella PDE6, può causare la morte cellulare.
Molti studi hanno dimostrato che un significativo sovraaccumulo di cGMP nei fotorecettori di modelli murini con diverse mutazioni del gene RD può causare l'attivazione della proteina chinasi cGMP-dipendente (PKG)3,6. Ciò porta ad un sostanziale aumento delle cellule morenti, TUNEL-positive e ad un graduale assottigliamento dello strato cellulare del fotorecettore. Studi precedenti suggeriscono che la sovraattivazione di PKG causata da elevati livelli di cGMP è una condizione necessaria e sufficiente per l'induzione della morte cellulare dei fotorecettori 2,5. Studi su diversi modelli murini di RD hanno anche dimostrato che l'attivazione di PKG, indotta da elevati livelli di cGMP nei fotorecettori, porta a una sovraattivazione degli effettori a valle come la poli-ADP-ribosio polimerasi 1 (PARP1), l'istone deacetilasi (HDAC) e la calpain 2,7,8,9. Ciò implica associazioni causali tra queste diverse proteine bersaglio e la morte delle cellule dei fotorecettori.
Tuttavia, la ricerca precedente sulla patologia, tossicofarmacologia e terapia della RD si basava principalmente su modelli murini per RD10,11,12. Tuttavia, permangono immense difficoltà nella traduzione clinica di questi risultati. Ciò è dovuto alle notevoli differenze genetiche e fisiologiche tra topi e umani, soprattutto per quanto riguarda la struttura retinica. Al contrario, i primati non umani (NHP) condividono anche un alto grado di somiglianza con gli esseri umani per quanto riguarda le caratteristiche genetiche, i modelli fisiologici e la regolazione dei fattori ambientali. Ad esempio, la terapia optogenetica è stata studiata come mezzo per ripristinare l'attività retinica in un modello NHP13. Lingam e colleghi hanno dimostrato che le cellule precursori dei fotorecettori retinici derivati da cellule staminali pluripotenti derivate da cellule staminali di buona fabbricazione possono salvare il danno del fotorecettore del cono in NHP14. Pertanto, i modelli NHP sono importanti per l'esplorazione della patogenesi RD e lo sviluppo di metodi di trattamento efficaci. In particolare, i modelli NHP di RD, che presentano meccanismi patogenetici simili a quelli dell'uomo, potrebbero svolgere un ruolo critico negli studi sullo sviluppo e nell'analisi tossicofarmacologica in vivo di nuovi farmaci.
In considerazione del lungo ciclo di vita, dell'elevato livello di difficoltà tecniche e degli elevati costi necessari per stabilire modelli di primati in vivo, abbiamo stabilito un modello in vitro di primati non umani (NHP) utilizzando colture di retina di macaco espiantata. In primo luogo, i macachi selvatici di età compresa tra 1 e 3 anni sono stati selezionati per la coltura in vitro di espianti retinici, che includevano il complesso retina-RPE-coroide. Gli espianti sono stati quindi trattati con diverse concentrazioni dell'inibitore della PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM) per indurre la via di segnalazione cGMP-PKG. La morte cellulare dei fotorecettori è stata quantificata e analizzata utilizzando il test TUNEL e l'accumulo di cGMP negli espianti è stato verificato tramite immunofluorescenza. Dato l'elevato grado di somiglianza rispetto alla distribuzione cellulare e alla morfologia, allo spessore dello strato retinico e ad altre caratteristiche fisiologiche della retina tra scimmie e umani, la creazione della via di segnalazione cGMP-PKG nel modello retinico in vitro può facilitare la ricerca futura sulla patogenesi della RD, nonché gli studi sullo sviluppo e la tossicofarmacologia di nuovi farmaci per il trattamento delle RD.
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Protocol
Lo studio sugli animali è stato esaminato e approvato dal Comitato di revisione etica dell'Istituto di zoologia, dall'Accademia cinese delle scienze (IACUC-PE-2022-06-002) e dalla revisione dell'etica animale e dal protocollo animale dell'Università dello Yunnan (YNU20220149).
1. Preparazione di espianti retinici
- Ottenere bulbi oculari di primati da macachi selvatici, di età compresa tra 1 e 3 anni, conservarli in una soluzione di conservazione dei tessuti e trasportarli su ghiaccio entro 3 ore dall'enucleazione dopo che le scimmie sono state sacrificate o dopo la morte naturale.
- Per la preparazione della soluzione di proteinasi K, sciogliere 25 mg di proteinasi K in 250 μL di acqua distillata, quindi aggiungere 225 μL della soluzione a 18,5 mL di mezzo basale (R16).
- Lavare i bulbi oculari in 10 ml di povidone-iodio al 5% (povidone-iodio: acqua = 1:19) per 30 s e immergerli in 5% penicillina / streptomicina (PEN / STREP) :p soluzione salina tamponata con hosphate = 1:19 per 1 minuto per evitare la contaminazione batterica. Quindi, incubare i bulbi oculari in 10 ml di terreno R16 per 5 minuti.
- Preriscaldare la soluzione di proteinasi K in un incubatore a 37 °C. Quindi, immergere i bulbi oculari in 10 ml di soluzione di proteinasi K e incubare per 2 minuti. Immergere i bulbi oculari in 10 ml di soluzione di siero bovino fetale R16 + (1:1), incubare per 5 minuti, quindi trasferire i bulbi oculari in 10 ml di R16 fresco per un lavaggio finale.
- Separare la sclera, la cornea, l'iride, il cristallino e il corpo vitreo e tagliare la retina da 4 lati con pinzette e forbici (Figura 1A-L).
- Tagliare gli espianti retinici con lame trephine in cinque sezioni: una lama trephine da 4 mm per il lato nasale / temporale / superiore / inferiore e una lama trephine da 6 mm per il lato centrale (contenente disco ottico e macula; Figura 1M-O). Tagliare alla seguente distanza dalla testa del nervo ottico: 1,5 mm per nasale, 4 mm per temporale e 2 mm per lato superiore e inferiore.
- Trasferire gli espianti di retina (contenenti retina e coroide) con il depressore palpebrale e posizionarli al centro dell'inserto, con il fotorecettore rivolto verso l'alto (Figura 1P). Posizionare circa 1 mL di terreno completo (R16 integrato con BSA, transferrina, progesterone, insulina, T3, corticosterone, vitamina B1, vitamina B12, retinolo, acetato di retinile, DL-tocoferolo, tocoferolo acetato, acido linoleico, L-cisteina HCl, glutatione, glutammina, vitamina C) sotto la membrana sulla piastra per coprire completamente la retina.
2. Coltura retinica di espianti di primati
- Coltura retinica espianta in mezzo completo e posta in un incubatore a 37 °C aerato con 5% di CO 2 umidificato.
- Applicare il trattamento farmacologico a concentrazione appropriata sul terreno di coltura retinica (ad esempio, zaprinast a concentrazioni di 100 μM, 200 μM o 400 μM). Utilizzare almeno tre espianti per condizione di trattamento e utilizzare espianti senza farmaco come controllo. Trattare con un farmaco per 4 giorni.
3. Fissaggio e crio-sezionamento
- Incubare gli espianti retinici con 1 mL di paraformaldeide (PFA) per 45 minuti, sciacquarli brevemente con 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS), quindi incubare con il 10% di saccarosio per 10 minuti, il 20% di saccarosio per 20 minuti e il 30% di saccarosio per 30 minuti (1 mL per ogni espianto di retina).
- Tagliare gli espianti retinici utilizzando lame di trefina per garantire coerenza nelle dimensioni degli espianti ottenuti da siti diversi con le seguenti caratteristiche: quattro quadranti in periferia, 6 mm al centro. Quindi, trasferire gli espianti retinici in una scatola di latta (circa 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) con mezzo incorporante O.C.T. per coprire il tessuto. Congelare immediatamente le sezioni di tessuto in azoto liquido e metterle in frigorifero a -20 °C per la conservazione.
- Utilizzare una lama affilata per tagliare l'agar in un piccolo blocco contenente il campione di tessuto, tagliare i blocchi del campione in sezioni da 10 μm e posizionarli su vetrini da microscopio ad adesione usando una spazzola morbida. Quindi, asciugare per 45 minuti a 40 °C e conservare a -20 °C fino all'uso.
4. Immunoistochimica (Figura 2)
- Colorazione cGMP
- Asciugare i vetrini e disegnare un anello idrofobo attorno alle sezioni retiniche con una penna bloccante liquido per coprire i campioni.
- Immergere i vetrini in 200 μL di soluzione salina tampone fosfato allo 0,3% e Triton X-100 per vetrino (PBST) per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi in soluzione bloccante (siero normale d'asino al 5%, PBST allo 0,3%, BSA all'1%, 200 μL per vetrino) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare i campioni per una notte con l'anticorpo primario (1:250, pecora anti-cGMP, 200 μL per vetrino) preparato nella soluzione bloccante a 4 °C, quindi risciacquare con PBS per 10 minuti (200 μL per vetrino) 3x.
- Incubare i campioni con anticorpi secondari (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 200 μL per vetrino) per 1 h a temperatura ambiente, quindi risciacquare con PBS per 10 min, 3x. Coprire i campioni con un mezzo di montaggio antisbiadimento contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e conservare a 4 °C per almeno 30 minuti prima dell'imaging.
- Colorazione TUNEL
- Asciugare i vetrini a temperatura ambiente per 15 minuti e disegnare un anello barriera idrorepellente attorno ai campioni di tessuto retinico con la penna bloccante liquida, quindi incubarli in 40 ml di PBS per 15 minuti.
- Incubare vetrini in 42 ml (per cinque vetrini) di TBS (0,05 M Tris-buffer) a 37 °C. Aspirare il TBS e incubare i campioni con 6 μL di proteinasi K per 5 minuti. Quindi, lavare i vetrini 3 volte con TBS per 5 minuti ogni volta.
- Esporre i vetrini a 40 ml di soluzione di acido aceticolo nel choplin, coprire con un foglio trasparente e incubare a -20 °C per 5 minuti. Lavare i vetrini 3 volte con TBS per 5 minuti ogni volta.
- Esporre i vetrini a soluzione bloccante (1% BSA; 200-300 μL per vetrino secondo necessità) e incubare in una camera di umidità per 1 ora.
- Preparare la soluzione del kit TUNEL, TMR rosso, nella seguente proporzione: 62,50 μL di soluzione bloccante (1% BSA), 56,25 μL di soluzione di etichettatura (TMR-dUTP) e 6,25 μL dell'enzima (proporzione per ciascun vetrino). Aggiungere circa 130 μL di questa soluzione per vetrino e incubare a 37 °C per 1 ora. Quindi, lavare i vetrini con PBS per 5 minuti (200 μL per vetrino), 2x.
- Posizionare i vetrini di copertura contenenti 1-2 gocce di mezzo di montaggio antifade con DAPI sui campioni, quindi incubare i vetrini a 4 °C per almeno 30 minuti prima dell'imaging.
- Colorazione cGMP combinata con colorazione TUNEL
- La colorazione cGMP è stata seguita dalla colorazione TUNEL. Seguire i passaggi della colorazione TUNEL dal punto 4.2.1 al passaggio 4.2.5, quindi continuare i passaggi della colorazione cGMP dal punto 4.1.2 al passaggio 4.1.4.
- Eseguire la microscopia a luce e fluorescenza con i parametri della fotocamera come segue: tempo di esposizione = 125 ms, dimensione ROI = 2752 x 2208, colore = B / M. Cattura immagini utilizzando il software. Immagina quattro diversi campi con una fotocamera digitale con ingrandimento 20x da ciascuna sezione e ottieni immagini rappresentative dalle aree centrali della retina utilizzando DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), con scansione Z-Stack con intervallo = 1 μm e opzionale = 1,251 μm.
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Representative Results
In questo studio, la coltura retinica di espianti di scimmia macaco è stata eseguita utilizzando espianti contenenti il complesso retina-RPE-coroide (Figura 1, Figura supplementare S1). Rispetto alla coltura in vitro di cellule retiniche che utilizzano la retina senza RPE e coroide collegati, la nostra coltura di espianti facilita una migliore sopravvivenza cellulare e, di conseguenza, prolunga la sopravvivenza delle cellule dei fotorecettori.
Abbiamo utilizzato diverse concentrazioni dell'inibitore della PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM; Figura supplementare S2) indurre un accumulo di cGMP nei fotorecettori e successiva attivazione di PKG in vitro. Ogni trattamento di concentrazione è stato somministrato per 4 giorni, rispettivamente. Il trattamento del modello retinico in vitro con zaprinast da 400 μM ha mostrato il maggior numero di cellule TUNEL-positive, un significativo segnale cGMP e una bassa tossicità per l'RPE e le cellule neuronali nella retina interna. L'alta percentuale di cellule TUNEL-positive nella Figura 2 ha suggerito che l'aumento dell'attività del cGMP può aumentare la degenerazione delle cellule retiniche indotta da zaprinast e l'accumulo di cGMP svolge un ruolo nella degenerazione dei fotorecettori. Il modello di degenerazione retinica dei macachi stabilito in questo studio servirà per indagini complete sui meccanismi della RP cGMP-PKG-dipendente.
Figura 1: Processo di produzione della coltura di espianti retinici in macachi di 1 anno. (A-L) Separare la sclera, la cornea, l'iride, il cristallino e il corpo vitreo e tagliare la retina da quattro lati con pinzette e forbici. (M-O) Tagliare gli espianti retinici con lame di trephine in cinque sezioni: una lama trephine da 4 mm per il lato nasale / temporale / superiore / inferiore e una lama trephine da 6 mm per il lato centrale (contenente disco ottico e macula). (P) Trasferire gli espianti retinici (contenenti retina e coroide) aperti alla membrana e posizionare la membrana su una piastra di coltura a 6 pozzetti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Valutazione delle attività cGMP all'interno dell'ONL degli espianti retinici di scimmia di 1 anno. Gli espianti sono stati trattati con diverse concentrazioni dell'inibitore della PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM). Il numero di cellule positive TUNEL (rosso) e cGMP (verde) nelle tre diverse concentrazioni è stato fortemente aumentato nell'ONL rispetto al controllo (A-D). Rispetto al gruppo di controllo, le cellule TUNEL/cGMP-positive presentano differenze significative nei gruppi 100 μM, 200 μM e 400 μM. I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Un'area della retina trattata con zaprinast da 400 μM è stata ingrandita per osservare solo le cellule positive cGMP (verde) e TUNEL (rosso), nonché un'immagine unita. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD); * = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01; = p ≤ 0,001; = p ≤ 0,0001. Abbreviazioni: GCs = cellule ganglionari, INL = strato nucleare interno, ONL = strato nucleare esterno, RPE = epitelio pigmentato retinico, cGMP = guanosina monofosfato ciclico, PDE6 = fosfodiesterasi 6. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare S1: Posizione dei punzoni retinici utilizzati per le colture di espianto. Gli espianti derivati dai punzoni nasali erano situati a 1,5 mm dalla testa del nervo ottico, mentre questa distanza era di 4 mm per i pugni temporali e 2 mm per i pugni superiori e inferiori, rispettivamente. Gli espianti retinici sono stati ottenuti tagliando con lame trephine in cinque punti - una lama trephine da 4 mm per il lato nasale / temporale / superiore / inferiore e una lama trephine da 6 mm per il lato centrale (contenente disco ottico e macula). Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Colorazione TUNEL per cellule morenti. Controllare la retina (A) e le retine trattate con Zaprinast a concentrazioni di 100 μM, 200 μM o 400 μM (B-D). Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
La fototrasduzione visiva si riferisce al processo biologico mediante il quale i segnali luminosi vengono convertiti in segnali elettrici dalle cellule dei fotorecettori all'interno della retina dell'occhio. Le cellule dei fotorecettori sono neuroni polarizzati capaci di fototrasduzione, e ci sono due diversi tipi di fotorecettori chiamati coni e bastoncelli dopo le forme dei loro segmenti esterni. I bastoncelli sono responsabili della visione scotopica e i coni sono responsabili della visione fotopica e ad alta acuità. La RD ereditaria è correlata a malattie neurodegenerative caratterizzate da morte progressiva delle cellule dei fotorecettori retinici15.
La ricerca attuale sulla RD si è basata principalmente su modelli murini di RD, comprese colture di espianti retinici in vitro derivate da modelli murini di RD16. Tuttavia, esistono notevoli differenze genetiche e fisiologiche, specialmente nella struttura retinica, tra topi e umani. Al contrario, gli NHP condividono un alto grado di somiglianza con gli esseri umani, rendendo i modelli NHP più appropriati per lo studio della patogenesi RD e lo sviluppo della terapia.
In questo studio, abbiamo stabilito un modello NHP in vitro coltivando espianti retinici di macachi. Rispetto alla coltura primaria monocellulare di routine e a una coltura in vitro di linee cellulari immortalizzate, una coltura di espianti retinici in vitro può preservare la conformazione del tessuto retinico e le interazioni intercellulari, consentendo una migliore simulazione delle condizioni in vivo. Inoltre, riduce in gran parte il numero di animali utilizzati e riduce la durata sperimentale e fornisce un approccio sperimentale relativamente controllabile per studiare gli effetti di vari fattori coinvolti nello sviluppo o nella degenerazione della retina.
La preparazione efficace degli espianti retinici è fondamentale per il successo della creazione di modelli retinici in vitro . Sulla base della nostra precedente esperienza di ricerca sulla preparazione di espianti retinici per topi, riassumiamo qui diversi punti chiave per la preparazione dell'espianto retinico di scimmia:
1) La preparazione dell'espianto deve essere eseguita il più presto possibile dopo il sacrificio animale e l'enucleazione. Si raccomanda l'uso di una soluzione di conservazione dei tessuti per la conservazione del bulbo oculare prima dell'uso nella preparazione dell'espianto in quanto consente un migliore mantenimento della vitalità cellulare rispetto alla soluzione salina tamponata con fosfato.
2) Considerando le grandi dimensioni dei bulbi oculari delle scimmie e i lunghi periodi di esposizione all'ambiente esterno, lavare i bulbi oculari con iodophor di povidone diluito e una doppia soluzione antibiotica prima della preparazione dell'espianto retinico può ridurre le contaminazioni. Tuttavia, il lavaggio non deve essere eseguito per una durata eccessivamente lunga. L'aggiunta di antibiotici durante la coltura di espianti non è raccomandata in quanto può influire sulla vitalità cellulare.
3) I bulbi oculari enucleati sono stati sottoposti a una separazione sequenziale della sclera, della cornea, dell'iride, del cristallino e del corpo vitreo seguita dal taglio della retina. A differenza dei bulbi oculari dei topi, che sono piccoli e in cui la sclera e l'uvea sono strettamente attaccate l'una all'altra, i bulbi oculari delle scimmie sono relativamente grandi e possiedono una sclera dura e uno spazio sopracoroidale. Pertanto, le forbici sono necessarie per la separazione della sclera. Sebbene questo non sia un passo difficile nella gestione dei bulbi oculari delle scimmie enucleate, è necessario prestare attenzione per evitare di danneggiare la retina e l'uvea. Inoltre, il legamento sospensivo duro della lente della scimmia deve essere tagliato con le forbici prima dell'attenta rimozione della lente. La separazione del corpo vitreo è una delle fasi più dispendiose in termini di tempo del processo di preparazione dell'espianto a causa della grande camera vitreale dell'occhio di scimmia, dell'elevata viscosità del corpo vitreo e del fermo attaccamento del corpo vitreo con la retina nelle scimmie di età compresa tra 1-3 anni. Il corpo vitreo è stato rimosso nella massima misura possibile utilizzando le forbici e una pipetta è stata utilizzata per facilitare il successivo trasferimento e coltura degli espianti retinici. Attualmente stiamo esplorando metodi più rapidi ed efficaci per la rimozione del corpo vitreo. Gli espianti retinici (5 mm) sono stati tagliati utilizzando lame di trefina per garantire coerenza nelle dimensioni degli espianti ottenuti da siti diversi (caratteristiche del sito: quattro quadranti nella periferia, 6 mm al centro). Durante il trasferimento degli espianti agli inserti di coltura, la retina e la coroide possono separarsi. Pertanto, è necessaria una manipolazione delicata e agile per garantire che gli espianti vengano trasferiti durante il primo tentativo stesso, poiché i tentativi ripetuti possono causare danni alla retina. Infine, il danno meccanico dovrebbe essere ridotto al minimo nella massima misura possibile durante l'intero processo di preparazione dell'espianto retinico per evitare di danneggiare la struttura retinica. Anche il tempo necessario per la preparazione dell'espianto deve essere ridotto al minimo per evitare la morte cellulare involontaria.
4) La coltura retinica di espianti è stata eseguita utilizzando espianti contenenti il complesso retina-RPE-coroide. Rispetto alla coltura in vitro di cellule retiniche che utilizzano la retina senza RPE e coroide collegati, la nostra coltura di espianti consente una migliore sopravvivenza cellulare e di conseguenza prolunga la sopravvivenza delle cellule fotorecettrici. Durante il processo di coltura, la retina è rivolta verso l'alto e la coroide è rivolta verso il basso. Rispetto agli espianti retinici di topo, gli espianti retinici di scimmia sono di dimensioni maggiori, il che pone maggiori esigenze sulla nutrizione della coltura. Pertanto, abbiamo eseguito modifiche giornaliere del terreno di coltura per la coltura di espianti retinici di scimmia invece di adottare una frequenza di cambio del terreno di coltura di una volta ogni 2 giorni, che è stata utilizzata in precedenza per la coltura di espianti retinici di topo.
Nel loro insieme, abbiamo stabilito un modello NHP in vitro attraverso la coltura degli espianti retinici di macachi e il loro trattamento con zaprinast per indurre la via di segnalazione cGMP-PKG simile a quella osservata nella patogenesi RD. Zaprinast è un inibitore della PDE6 e la PDE6 mantiene l'equilibrio della concentrazione intracellulare di cGMP che attiva PKG17,18. La via cGMP-PKG può regolare negativamente la fosforilazione ossidativa e le vie mitocondriali, influenzando così la degenerazione retinica19. L'induzione della via di segnalazione cGMP-PKG in questo modello retinico NHP in vitro lo stabilisce come un modello favorevole per la ricerca futura sulla patogenesi della RD, nonché per lo sviluppo e la sperimentazione tossicofarmacologica di nuovi farmaci per il trattamento della RD. Tuttavia, l'uso di questo modello ha alcune limitazioni, in particolare i suoi periodi di coltura relativamente brevi e i costi relativamente elevati per i primati. Durante la nostra ricerca futura, questo modello in vitro sarà utilizzato per la valutazione funzionale post-intervento della retina utilizzando MEA e μERG. Le informazioni e le posizioni cellulari dei bersagli PKG saranno combinate con la misurazione delle attività degli effettori a valle (ad esempio, calpain, PARP e HDAC) e le indagini sui meccanismi neurodegenerativi pertinenti.
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Disclosures
Tutti gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (n. 81960180), della Zinke Heritage Foundation e della Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Ringraziamo il Prof. Longbao Lv (Istituto di Zoologia, Accademia Cinese delle Scienze, Kunming, Cina) per aver condiviso i bulbi oculari delle scimmie utilizzati in questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
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