Summary
Vahşi tip makaklardan elde edilen retinal eksplantlar in vitro olarak kültürlendi. Retinal dejenerasyon ve cGMP-PKG sinyal yolu PDE6 inhibitörü zaprinast kullanılarak indüklendi. Farklı zaprinast konsantrasyonlarındaki eksplantlarda cGMP birikimi, immünofloresan kullanılarak doğrulandı.
Abstract
Kalıtsal retinal dejenerasyon (RD), ilerleyici fotoreseptör hücre ölümü ile karakterizedir. Fotoreseptör hücrelerde siklik guanozin monofosfat (cGMP)-bağımlı protein kinaz (PKG) yolunun aşırı aktivasyonu, özellikle fosfodiesteraz 6b (PDE6b) mutasyonlarını barındıran modellerde fotoreseptör hücre ölümüne neden olur. RD ile ilgili önceki çalışmalarda esas olarak rd1 veya rd10 fareleri gibi murin modelleri kullanılmıştır. Fareler ve insanlar arasındaki genetik ve fizyolojik farklılıklar göz önüne alındığında, primat ve kemirgenlerin retinalarının ne ölçüde karşılaştırılabilir olduğunu anlamak önemlidir. Makaklar, insanlarla yüksek düzeyde genetik benzerlik paylaşır. Bu nedenle, retina-retinal pigment epiteli (RPE)-koroid kompleksini içeren retinal eksplantların in vitro kültürü için vahşi tip makaklar (1-3 yaş arası) seçildi. Bu eksplantlar, cGMP-PKG sinyal yolunu indüklemek ve RD patogenezini simüle etmek için farklı konsantrasyonlarda PDE6 inhibitörü zaprinast ile tedavi edildi. primat retinal eksplantlarda cGMP birikimi ve hücre ölümü daha sonra immünofloresan ve TUNEL testi kullanılarak doğrulandı. Bu çalışmada oluşturulan primat retinal modeli, cGMP-PKG'ye bağımlı RD mekanizmalarına ilişkin ilgili ve etkili çalışmaların yanı sıra gelecekteki tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine de hizmet edebilir.
Introduction
Kalıtsal retinal dejenerasyon (RD), ilerleyici fotoreseptör hücre ölümü ile karakterizedir ve çok çeşitli patojenik genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanır1. RD'nin nihai sonucu görme kaybıdır ve vakaların büyük çoğunluğunda hastalık bu güne kadar tedavi edilemez olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, fotoreseptör ölümüne yol açan hücresel mekanizmaları, insan hastalık durumunu sadık bir şekilde temsil eden modelleri kullanarak incelemek önemlidir. Burada, primat bazlı modeller, insanlara olan yakınlıkları nedeniyle özellikle ilgi çekicidir. Özellikle, bu tür modeller fotoreseptör hücre ölümünü durdurabilecek veya geciktirebilecek uygun terapötik müdahalelerin geliştirilmesini ilerletebilir.
RD'de hücre ölümü mekanizmaları üzerine yapılan önceki araştırmalar, RD'yi tetikleyen gen mutasyonlarının neden olduğu fosfodiesteraz 6 (PDE6) aktivitesinin azalmasının veya kaybının, siklik guanozin monofosfatın (cGMP) hidrolizinin azalmasına yol açtığını göstermiştir2,3. cGMP, çubuk dış segmentlerindeki (ROS'lar) siklik nükleotid kapılı iyon kanallarının (CNGC'ler) spesifik bir agonistidir ve aynı zamanda omurgalı fotoreseptör hücrelerinde ışık sinyallerinin elektrik sinyallerine dönüştürülmesinden sorumlu anahtar bir moleküldür4. Azaltılmış cGMP hidrolizi, ROS'larda cGMP birikimine neden olur ve CNGC'lerin açılmasına neden olur 5. Sonuç olarak, fototransdüksiyon yolları aktive edilir ve fotoreseptör hücrelerde katyon konsantrasyonlarında bir artışa neden olur. Bu süreç, fotoreseptörlere, örneğin PDE6'daki mutasyonlar tarafından aşırı aktive edildiğinde hücre ölümüne neden olabilecek metabolik bir yük getirir.
Birçok çalışma, farklı RD gen mutasyonlarına sahip fare modellerinin fotoreseptörlerinde önemli miktarda cGMP aşırı birikiminin, cGMP'ye bağımlı protein kinazının (PKG) aktivasyonuna neden olabileceğini göstermiştir3,6. Bu, ölme, TUNEL-pozitif hücrelerde önemli bir artışa ve fotoreseptör hücre tabakasının kademeli olarak incelmesine yol açar. Önceki çalışmalar, yüksek cGMP seviyelerinin neden olduğu PKG aşırı aktivasyonunun, fotoreseptör hücre ölümünün indüksiyonu için gerekli ve yeterli bir koşul olduğunu göstermektedir 2,5. RD'nin farklı fare modelleri üzerinde yapılan çalışmalar, fotoreseptörlerde yüksek cGMP seviyeleri tarafından indüklenen PKG aktivasyonunun, poli-ADP-riboz polimeraz 1 (PARP1), histon deasetilaz (HDAC) ve calpain 2,7,8,9 gibi aşağı akış efektörlerinin aşırı aktivasyonuna yol açtığını göstermiştir. Bu, bu farklı hedef proteinler ile fotoreseptör hücre ölümü arasındaki nedensel ilişkileri ima eder.
Bununla birlikte, RD'nin patolojisi, toksikofarmakolojisi ve tedavisi ile ilgili önceki araştırmalar esas olarak RD10,11,12 için fare modellerine dayanıyordu. Bununla birlikte, bu sonuçların klinik çevirisinde büyük zorluklar devam etmektedir. Bu, fareler ve insanlar arasındaki, özellikle retinal yapı ile ilgili önemli genetik ve fizyolojik farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Buna karşılık, insan olmayan primatlar (NHP'ler) ayrıca genetik özellikler, fizyolojik kalıplar ve çevresel faktör düzenlemesi açısından insanlarla yüksek derecede benzerlik göstermektedir. Örneğin, optogenetik tedavi, bir NHP model13'te retinal aktiviteyi geri kazanmanın bir yolu olarak araştırılmıştır. Lingam ve meslektaşları, iyi üretim uygulaması sınıfı insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı retinal fotoreseptör öncü hücrelerinin NHP14'te koni fotoreseptör hasarını kurtarabileceğini göstermiştir. Bu nedenle NHP modelleri, RD patogenezinin araştırılması ve etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi açısından önemlidir. Özellikle, insanlardakine benzer patojenik mekanizmalar sergileyen RD'nin NHP modelleri, yeni ilaçların geliştirilmesi ve in vivo toksikofarmakoloji analizi ile ilgili çalışmalarda kritik bir rol oynayabilir.
Uzun yaşam döngüsü, yüksek düzeyde teknik zorluklar ve in vivo primat modellerinin oluşturulmasında yer alan yüksek maliyet göz önüne alındığında, ekzode makak retina kültürlerini kullanarak in vitro insan dışı primat (NHP) modeli oluşturduk. İlk olarak, retina-RPE-koroid kompleksini içeren retinal eksplantların in vitro kültürü için 1-3 yaş arası vahşi tip makaklar seçildi. Eksplantlar daha sonra cGMP-PKG sinyal yolunu indüklemek için farklı konsantrasyonlarda PDE6 inhibitörü zaprinast (100 μM, 200 μM ve 400 μM) ile muamele edildi. Fotoreseptör hücre ölümü TUNEL testi kullanılarak ölçüldü ve analiz edildi ve eksplantlarda cGMP birikimi immünofloresan yoluyla doğrulandı. Maymunlar ve insanlar arasındaki hücre dağılımı ve morfolojisi, retina tabakası kalınlığı ve retinanın diğer fizyolojik özellikleri açısından yüksek derecede benzerlik göz önüne alındığında, in vitro retinal modelde cGMP-PKG sinyal yolunun kurulması, RD'nin patogenezi üzerine gelecekteki araştırmaları ve RD tedavisi için yeni ilaçların geliştirilmesi ve toksikofarmakolojisine yönelik çalışmaları kolaylaştırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan çalışması, Zooloji Enstitüsü Etik İnceleme Komitesi, Çin Bilimler Akademisi (IACUC-PE-2022-06-002) ve Yunnan Üniversitesi hayvan etiği incelemesi ve hayvan protokolü (YNU20220149) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Retinal eksplantların hazırlanması
- 1 ila 3 yaşları arasındaki vahşi tip makaklardan primat gözbebekleri elde edin, doku depolama çözeltisinde saklayın ve maymunlar kurban edildikten sonra veya doğal ölümden sonra enükleasyondan sonraki 3 saat içinde buz üzerinde taşıyın.
- Proteinaz K çözeltisinin hazırlanması için, 25 mg proteinaz K'yı 250 μL damıtılmış suda çözün ve daha sonra çözeltinin 225 μL'sini 18.5 mL bazal ortama (R16) ekleyin.
- Göz kürelerini 10 mL'de% 5 povidon-iyot (povidon-iyot: su = 1:19) içinde 30 saniye boyunca yıkayın ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için% 5 penisilin / streptomisin (PEN / STREP) :p hosphate tamponlu salin = 1:19 dakika boyunca 1:19'a batırın. Daha sonra, göz kürelerini 5 dakika boyunca 10 mL R16 ortamında inkübe edin.
- Proteinaz K çözeltisini 37 ° C'lik bir inkübatörde önceden ısıtın. Daha sonra, göz kürelerini 10 mL proteinaz K çözeltisine daldırın ve 2 dakika boyunca inkübe edin. Göz kürelerini 10 mL R16 + fetal sığır serumu (1: 1) çözeltisine batırın, 5 dakika inkübe edin ve ardından son bir yıkama için göz kürelerini 10 mL taze R16'ya aktarın.
- Sklera, kornea, iris, lens ve vitreus gövdesini ayırın ve retinayı cımbız ve makasla 4 taraftan kesin (Şekil 1A-L).
- Trefin bıçaklı retinal eksplantları beş bölüme ayırın - nazal / zamansal / üstün / alt taraf için 4 mm'lik bir trefin bıçağı ve orta taraf için 6 mm'lik bir trefin bıçağı (optik disk ve makula içeren; Şekil 1M-O). Optik sinir kafasından aşağıdaki mesafede kesin: nazal için 1,5 mm, geçici için 4 mm ve hem üst hem de alt taraf için 2 mm.
- Retina eksplantlarını (retina ve koroid içeren) göz kapağı depresörü ile aktarın ve bunları ekin ortasına, fotoreseptör tarafı yukarı doğru yerleştirin (Şekil 1P). Retinayı tamamen örtmek için plakadaki zarın altına yaklaşık 1 mL komple ortam (BSA, transferrin, progesteron, insülin, T3, kortikosteron, B1 vitamini, B12 vitamini, retinol, retinil asetat, DL-tokoferol, tokoferil asetat, linoleik asit, L-sistein HCl, glutatyon, glutamin, C vitamini ile desteklenmiş R16) yerleştirin.
2. Primat retinal eksplant kültürü
- Kültür retinal eksplantları tam ortamda ve nemlendirilmiş% 5 CO2 ile havalandırılmış 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirilir.
- Retinal kültür ortamına uygun konsantrasyonda ilaç tedavisi uygulayın (örneğin, 100 μM, 200 μM veya 400 μM konsantrasyonlarında zaprinest). Tedavi koşulu başına en az üç eksplant kullanın ve kontrol olarak ilaçsız eksplantlar kullanın. 4 gün boyunca ilaçla tedavi edin.
3. Sabitleme ve kriyo-kesitleme
- Retinal eksplantları 45 dakika boyunca 1 mL paraformaldehit (PFA) ile inkübe edin, 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile kısaca durulayın ve daha sonra 10 dakika boyunca% 10 sakaroz, 20 dakika boyunca% 20 sakkaroz ve% 30 sakkaroz ile 30 dakika boyunca inkübe edin (her retina eksplantı için 1 mL).
- Aşağıdaki özelliklere sahip farklı bölgelerden elde edilen eksplantların boyutunda tutarlılık sağlamak için trefin bıçakları kullanarak retinal eksplantları kesin: çevrede dört kadran, merkezde 6 mm. Daha sonra, retinal eksplantları dokuyu örtmek için O.C.T. gömme ortamı ile bir teneke kutuya (yaklaşık 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) aktarın. Hemen, doku bölümlerini sıvı azot içinde dondurun ve saklamak için -20 ° C'lik bir buzdolabına koyun.
- Agar'ı doku örneğini içeren küçük bir bloğa kırpmak için keskin bir bıçak kullanın, numune bloklarını 10 μm bölümlere ayırın ve yumuşak bir fırça kullanarak yapışma mikroskobu slaytlarına yerleştirin. Daha sonra, 40 ° C'de 45 dakika kurutun ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.
4. İmmünohistokimya (Şekil 2)
- cGMP boyama
- Slaytları kurutun ve örnekleri örtmek için retina bölümlerinin etrafına sıvı bloker kalemle hidrofobik bir halka çizin.
- Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 μL% 0.3 fosfat tampon salin ve slayt başına Triton X-100 (PBST) içine daldırın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici çözeltiye (% 5 normal eşek serumu,% 0.3 PBST,% 1 BSA,% 1 BSA,% 200 μL) daldırın.
- Numuneleri, 4 °C'de bloke edici çözeltide hazırlanan birincil antikor (1:250, koyun anti-cGMP, slayt başına 200 μL) ile gece boyunca inkübe edin ve daha sonra PBS ile 10 dakika (slayt başına 200 μL) 3x durulayın.
- Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikor (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, slayt başına 200 μL) ile inkübe edin ve ardından PBS ile 10 dakika, 3x durulayın. Numuneleri 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir antifade montaj ortamı ile örtün ve görüntülemeden önce en az 30 dakika boyunca 4 °C'de saklayın.
- TÜNEL boyama
- Slaytları oda sıcaklığında 15 dakika kurutun ve sıvı bloker kalemle retina dokusu örneklerinin etrafına su itici bir bariyer halkası çizin ve ardından 15 dakika boyunca 40 mL PBS'de inkübe edin.
- Slaytları 37 °C'de 42 mL (beş slayt başına) TBS (0,05 M Tris-tampon) içinde inkübe edin. TBS'yi aspire edin ve numuneleri 5 dakika boyunca 6 μL proteinaz K ile inkübe edin. Ardından, slaytları her seferinde 5 dakika boyunca TBS ile 3 kez yıkayın.
- Slaytları choplin içinde 40 mL etanol-asetik asit çözeltisine maruz bırakın, şeffaf bir tabaka ile örtün ve 5 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edin. Slaytları her seferinde 5 dakika boyunca TBS ile 3 kez yıkayın.
- Slaytları bloke edici çözeltiye maruz bırakın (% 1 BSA; ihtiyaca göre slayt başına 200-300 μL) ve 1 saat boyunca bir nem odasında inkübe edin.
- TUNEL kiti çözeltisi TMR kırmızısını aşağıdaki oranda hazırlayın: 62.50 μL bloke edici çözelti (% 1 BSA), 56.25 μL etiketleme çözeltisi (TMR-dUTP) ve 6.25 μL enzim (her slayt için oran). Slayt başına yaklaşık 130 μL bu çözeltiyi ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ardından, slaytları PBS ile 5 dakika (slayt başına 200 μL), 2x yıkayın.
- 1-2 damla antifade montaj ortamı içeren kapak slaytlarını DAPI ile numunelerin üzerine yerleştirin ve ardından slaytları görüntülemeden önce en az 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- cGMP boyama TÜNEL boyama ile kombine
- cGMP boyama işlemini TÜNEL boyama izledi. Adım 4.2.1'den adım 4.2.5'e kadar TÜNEL boyama adımlarını izleyin ve ardından adım 4.1.2'den adım 4.1.4'e kadar cGMP boyama adımlarına devam edin.
- Kamera parametreleriyle ışık ve floresan mikroskobunu aşağıdaki gibi gerçekleştirin: pozlama süresi = 125 ms, ROI boyutu = 2752 x 2208, Renk = B / M. Yazılımı kullanarak görüntüleri yakalayın. Her bölümden 20x büyütmede bir dijital kamera ile dört farklı alanı resmedin ve DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), Z-Stack taramasının aralık = 1 μm ve isteğe bağlı = 1.251 μm olduğu retinanın merkezi alanlarından temsili resimler elde edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada Makak maymunu retinal eksplant kültürü, retina-RPE-koroid kompleksini içeren eksplantlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Şekil 1, Ek Şekil S1). Ekli RPE ve koroid olmadan retinayı kullanan retina hücrelerinin in vitro kültürü ile karşılaştırıldığında, eksplant kültürümüz daha iyi hücre sağkalımını kolaylaştırır ve buna bağlı olarak fotoreseptör hücrelerin hayatta kalmasını uzatır.
PDE6 inhibitörü zaprinastının farklı konsantrasyonlarını kullandık (100 μM, 200 μM ve 400 μM; Ek Şekil S2) fotoreseptörlerde cGMP birikimini ve ardından in vitro PKG'nin aktivasyonunu indüklemek. Her konsantrasyon tedavisi sırasıyla 4 gün boyunca verildi. İn vitro retinal modelin 400 μM zaprinast ile tedavisi, en fazla sayıda TUNEL-pozitif hücre, önemli bir cGMP sinyali ve iç retinadaki RPE ve nöronal hücreler için düşük toksisite sergilemiştir. Şekil 2'deki TUNEL-pozitif hücrelerin yüksek oranı, artan cGMP aktivitesinin zaprinast kaynaklı retinal hücre dejenerasyonunu artırabileceğini ve cGMP birikiminin fotoreseptör dejenerasyonunda rol oynadığını öne sürmüştür. Bu çalışmada oluşturulan makak retinal dejenerasyon modeli, cGMP-PKG'ye bağımlı RP mekanizmalarının kapsamlı bir şekilde araştırılmasına hizmet edecektir.
Şekil 1: 1 yaşındaki makaklarda retinal eksplant kültürünün üretim süreci. (A-L) Sklera, kornea, iris, lens ve vitreus gövdesini ayırın ve retinayı cımbız ve makasla dört taraftan kesin. (M-O) Trefin bıçaklı retinal eksplantları beş bölüme ayırın - nazal / zamansal / üstün / alt taraf için 4 mm'lik bir trefin bıçağı ve orta taraf için 6 mm'lik bir trefin bıçağı (optik disk ve makula içeren). (P) Tereyağı ile taranmış retinal eksplantları (retina ve koroid içeren) zara aktarın ve zarı 6 delikli bir kültür plakasına yerleştirin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 1 yaşındaki maymunun retinal eksplantlarının ONL'sinde cGMP aktivitelerinin değerlendirilmesi. Eksplantlar farklı konsantrasyonlarda PDE6 inhibitörü zaprinast (100 μM, 200 μM ve 400 μM) ile muamele edildi. Üç farklı konsantrasyondaki TUNEL (kırmızı) ve cGMP (yeşil) pozitif hücrelerin sayısı, kontrol (A-D) ile karşılaştırıldığında ONL'de güçlü bir şekilde artmıştır. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, TUNEL / cGMP-pozitif hücreler 100 μM, 200 μM ve 400 μM gruplarında önemli farklılıklara sahiptir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. 400 μM zaprinast ile tedavi edilen retinanın bir alanı, yalnızca cGMP (yeşil) ve TUNEL (kırmızı) pozitif hücreleri ve birleştirilmiş bir görüntüyü gözlemlemek için büyütüldü. Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil eder; * = p ≤ 0.05; ** = p ≤ 0,01; = p ≤ 0,001; = p ≤ 0,0001. Kısaltmalar: GC'ler = ganglion hücreleri, INL = iç nükleer tabaka, ONL = dış nükleer tabaka, RPE = retinal pigment epiteli, cGMP = siklik guanozin monofosfat, PDE6 = fosfodiesteraz 6. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Eksplant kültürleri için kullanılan retinal punchların yeri. Nazal punchlardan elde edilen eksplantlar optik sinir kafasından 1.5 mm uzakta bulunurken, bu mesafe temporal punchlar için 4 mm, superior ve inferior punchlar için 2 mm idi. Retinal eksplantlar, beş yerde trefin bıçaklarıyla kesilerek elde edildi - nazal / zamansal / üstün / alt taraf için 4 mm'lik bir trefin bıçağı ve merkezi taraf için 6 mm'lik bir trefin bıçağı (optik disk ve makula içeren). Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S2: Ölmekte olan hücreler için TUNEL boyama. Kontrol retinası (A) ve Zaprinast ile tedavi edilen retinalar 100 μM, 200 μM veya 400 μM (B-D) konsantrasyonlarında. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Görsel fototransdüksiyon, ışık sinyallerinin gözün retinasındaki fotoreseptör hücreler tarafından elektrik sinyallerine dönüştürüldüğü biyolojik süreci ifade eder. Fotoreseptör hücreler, fototransdüksiyon yapabilen polarize nöronlardır ve dış segmentlerinin şekillerinden sonra çubuklar ve koniler olarak adlandırılan iki farklı fotoreseptör türü vardır. Çubuklar skotopik görmeden sorumludur ve koniler fotopik ve yüksek keskinlikte görmeden sorumludur. Kalıtsal RD, ilerleyici retinal fotoreseptör hücre ölümü ile karakterize nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilidir15.
RD ile ilgili güncel araştırmalar esas olarak, murin RD modellerinden türetilen in vitro retinal eksplant kültürleri de dahil olmak üzere RD'nin fare modellerine dayanmaktadır16. Bununla birlikte, özellikle retina yapısında, fareler ve insanlar arasında önemli genetik ve fizyolojik farklılıklar vardır. Buna karşılık, NHP'ler insanlarla yüksek derecede benzerlik gösterir, bu da NHP modellerini RD patogenezinin araştırılması ve tedavi gelişimi için en uygun hale getirir.
Bu çalışmada, makakların retinal eksplantlarını kültürleyerek in vitro NHP modeli oluşturduk. Rutin tek hücreli primer kültür ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının in vitro kültürü ile karşılaştırıldığında, in vitro retinal eksplant kültürü, retinal doku konformasyonunu ve hücreler arası etkileşimleri koruyabilir ve bu da in vivo koşulların daha iyi simülasyonunu sağlar. Ek olarak, kullanılan hayvan sayısını büyük ölçüde azaltır ve deney süresini kısaltır ve retina gelişimi veya dejenerasyonunda rol oynayan çeşitli faktörlerin etkilerini araştırmak için nispeten kontrol edilebilir bir deneysel yaklaşım sağlar.
Retinal eksplantların başarılı bir şekilde hazırlanması, in vitro retinal modellerin başarılı bir şekilde kurulması için çok önemlidir. Fareler için retinal eksplantları hazırlama konusundaki önceki araştırma deneyimimize dayanarak, burada maymun retinal eksplant hazırlığı için birkaç önemli noktayı özetliyoruz:
1) Eksplant hazırlığı, hayvan kurban ve enükleasyondan sonra mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır. Eksplant preparatında kullanılmadan önce göz küresi depolaması için bir doku depolama çözeltisinin kullanılması, fosfat tamponlu salin ile karşılaştırıldığında hücre canlılığının daha iyi korunmasını sağladığı için tavsiye edilir.
2) Maymun gözbebeklerinin büyüklüğü ve uzun süre dış ortama maruz kalma göz önüne alındığında, retinal eksplant preparasyonundan önce göz kürelerinin seyreltilmiş povidon iyodofor ve çift antibiyotik çözeltisi ile yıkanması kontaminasyonları azaltabilir. Bununla birlikte, yıkama aşırı uzun bir süre boyunca yapılmamalıdır. Eksplant kültürü sırasında antibiyotik eklenmesi, hücre canlılığını etkileyebileceğinden önerilmez.
3) Enüklee göz küreleri sklera, kornea, iris, lens ve vitreus gövdesinin ardışık olarak ayrılmasına ve ardından retinanın kesilmesine tabi tutuldu. Küçük olan ve sklera ve uveanın birbirine sıkıca bağlandığı fare göz kürelerinin aksine, maymun göz küreleri nispeten büyüktür ve sert bir sklera ve suprakoroidal alana sahiptir. Bu nedenle, skleranın ayrılması için makas gereklidir. Bu, enüklee maymun göz kürelerinin kullanımında zor bir adım olmasa da, retina ve uvea'ya zarar vermemek için özen gösterilmelidir. Ek olarak, maymun lensinin sert askı bağı, lensin dikkatli bir şekilde çıkarılmasından önce makasla kesilmelidir. Vitröz cismin ayrılması, maymun gözünün geniş vitreus odası, vitreus gövdesinin yüksek viskozitesi ve 1-3 yaş arası maymunlarda vitreus gövdesinin retina ile sıkı sıkıya bağlanması nedeniyle eksplant hazırlama işleminin en çok zaman alan adımlarından biridir. Vitreus gövdesi makas kullanılarak mümkün olduğunca çıkarıldı ve retinal eksplantların sonraki transferini ve kültürünü kolaylaştırmak için bir pipet kullanıldı. Şu anda vitreus cisimciklerinin çıkarılması için daha hızlı ve daha etkili yöntemler keşfetme sürecindeyiz. Retinal eksplantlar (5 mm), farklı bölgelerden elde edilen eksplantların boyutunda tutarlılık sağlamak için trefin bıçakları kullanılarak kesildi (bölge özellikleri: çevrede dört kadran, merkezde 6 mm). Eksplantların kültür eklerine aktarılması sırasında, retina ve koroid ayrılabilir. Bu nedenle, tekrarlanan girişimler retina hasarına neden olabileceğinden, eksplantların ilk denemenin kendisi sırasında aktarılmasını sağlamak için nazik ve çevik kullanım gereklidir. Son olarak, retina yapısına zarar vermemek için tüm retina eksplant hazırlama işlemi boyunca mekanik hasar mümkün olduğunca en aza indirilmelidir. Eksplant hazırlığı için harcanan süre, yanlışlıkla hücre ölümünü önlemek için de en aza indirilmelidir.
4) Retina eksplant kültürü, retina-RPE-koroid kompleksini içeren eksplantlar kullanılarak yapıldı. Bağlı RPE ve koroid olmadan retinayı kullanan retina hücrelerinin in vitro kültürü ile karşılaştırıldığında, eksplant kültürümüz daha iyi hücre sağkalımına izin verir ve buna bağlı olarak fotoreseptör hücrelerin hayatta kalmasını uzatır. Kültür işlemi sırasında retina yukarı ve koroid aşağı bakar. Fare retinal eksplantları ile karşılaştırıldığında, maymun retinal eksplantları boyut olarak daha büyüktür ve bu da kültür beslenmesine daha fazla talep getirmektedir. Bu nedenle, daha önce fare retinal eksplant kültürü için kullanılan 2 günde bir kültür ortamı değişim sıklığını benimsemek yerine, maymun retinal eksplant kültürü için günlük kültür ortamı değişiklikleri gerçekleştirdik.
Birlikte ele alındığında, makakların retinal eksplantlarının kültürü ve RD patogenezinde gözlenene benzer cGMP-PKG sinyal yolunu indüklemek için zaprinast ile tedavileri yoluyla in vitro NHP modeli oluşturduk. Zaprinast bir PDE6 inhibitörüdür ve PDE6, PKG17,18'i aktive eden hücre içi cGMP konsantrasyonunun dengesini korur. cGMP-PKG yolu oksidatif fosforilasyon ve mitokondriyal yolları negatif olarak düzenleyebilir ve böylece retinal dejenerasyonu etkileyebilir19. Bu in vitro NHP retinal modelinde cGMP-PKG sinyal yolunun indüksiyonu, RD'nin patogenezi üzerine gelecekteki araştırmaların yanı sıra RD tedavisi için yeni ilaçların geliştirilmesi ve toksikofarmakoloji testleri için uygun bir model olarak onu belirlemektedir. Bununla birlikte, bu modelin kullanımının, özellikle nispeten kısa kültürleme süreleri ve primatlar için nispeten yüksek maliyetleri gibi bazı sınırlamaları vardır. Gelecekteki araştırmalarımız sırasında, bu in vitro model, MEA ve μERG kullanılarak retinanın müdahale sonrası fonksiyonel değerlendirmesi için kullanılacaktır. PKG hedeflerinin bilgisi ve hücresel konumları, aşağı akış efektörlerinin (örneğin, calpain, PARP ve HDAC) aktivitelerinin ölçümü ve ilgili nörodejeneratif mekanizmalara yönelik araştırmalarla birleştirilecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81960180), Zinke miras vakfı ve Charlotte ve Tistou Kerstan Vakfı, Yunnan Göz Hastalığı Klinik Tıp Merkezi (ZX2019-02-01) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan maymun gözbebeklerini paylaştığı için Prof. Longbao Lv'ye (Zooloji Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi, Kunming, Çin) teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
