Dette papir præsenterer protokoller til konstruktion og karakterisering af justerbare tredimensionelle sammensatte netværk af sammenfiltrede actinfilamenter og mikrotubuli. Kompositter gennemgår aktiv omstrukturering og ballistisk bevægelse, drevet af myosin II og kinesinmotorer, og er indstillet af de relative koncentrationer af actin, mikrotubuli, motorproteiner og passive tværbindinger.
Det sammensatte cytoskelet, der omfatter interagerende netværk af semifleksible actinfilamenter og stive mikrotubuli, omstrukturerer og genererer kræfter ved hjælp af motorproteiner såsom myosin II og kinesin til at drive nøgleprocesser såsom migration, cytokinese, vedhæftning og mekanosensing. Mens actin-mikrotubulus-interaktioner er nøglen til cytoskelettets alsidighed og tilpasningsevne, er en forståelse af deres samspil med myosin- og kinesinaktivitet stadig spirende. Dette arbejde beskriver, hvordan man konstruerer justerbare tredimensionelle sammensatte netværk af sammenfiltrede actinfilamenter og mikrotubuli, der gennemgår aktiv omstrukturering og ballistisk bevægelse, drevet af myosin II- og kinesinmotorer og er indstillet af de relative koncentrationer af actin, mikrotubuli, motorproteiner og passive tværbindinger. Protokoller til fluorescensmærkning af mikrotubuli og actinfilamenter for mest effektivt at visualisere sammensat omstrukturering og bevægelse ved hjælp af multispektral konfokal billeddannelse er også detaljerede. Endelig præsenteres resultaterne af dataanalysemetoder, der kan bruges til kvantitativt at karakterisere ikke-ligevægtsstruktur, dynamik og mekanik. Genskabelse og undersøgelse af denne justerbare biomimetiske platform giver værdifuld indsigt i, hvordan koblet motoraktivitet, sammensat mekanik og filamentdynamik kan føre til utallige cellulære processer fra mitose til polarisering til mekano-sensation.
Cytoskelettet er et dynamisk sammensat netværk af interagerende biopolymerer, der giver strukturel og mekanisk støtte til celler. Tilknyttede molekylære motorer og bindende proteiner omstrukturerer og tilpasser cytoskelettet for at give celler mulighed for at vokse, ændre form, stivne, bevæge sig og endda selvhelbrede, hvilket muliggør utallige cellulære processer lige fra migration og division til mekanosenserende 1,2. Ud over dets betydning i cellulær biofysik er cytoskelettet også et kendetegnende eksempel på aktivt stof med potentielle materialeanvendelser lige fra sårheling og lægemiddelafgivelse til filtrering og blød robotik 1,3,4,5,6,7,8,9.
De to nøgleegenskaber, der giver cytoskelettet sin unikke strukturelle og mekaniske mangfoldighed og multifunktionalitet, er: 1) dets sammensatte natur, der omfatter flere interagerende proteinfilamenter, såsom semifleksible actinfilamenter og stive mikrotubuli samt deres tilknyttede bindings- og tværbindingsproteiner 3,5,10; og 2) dets evne til kontinuerligt at omstrukturere, bevæge sig, grove og udføre arbejde via energiforbrugende motorer, såsom myosiner og kinesiner, der skubber og trækker i de filamentøse proteiner 1,7,11,12,13. Mens denne elegante kompleksitet gør det muligt for cytoskelettet at formidle processer så forskellige som cellemotilitet, cytokinese og sårheling 3,6,7,11, hæmmer det forskernes evne til at reproducere cytoskelettets signatur in vivo-egenskaber i rekonstituerede in vitro-systemer.
Den nuværende grænserekonstitutionsindsats fokuserer på kompositter af sammenfiltrede og tværbundne actinfilamenter og mikrotubuli 3,10,14,15,16,17, kraftgenererende actomyosinnetværk2,8,18,19,20,21 og aktiv nematik drevet af kinesinmikrotubuli interaktioner 22,23,24,25,26. Steady-state actin-mikrotubulus-kompositter har vist sig at vise nye mekaniske egenskaber15,16,27, såsom forbedret filamentmobilitet og øget stivhed sammenlignet med enkeltkomponentsystemer 27. Undersøgelser af in vitro actomyosinsystemer har rapporteret en bred vifte af strukturelle og dynamiske egenskaber, der afhænger af koncentrationerne af actin, myosin og tværbindinger 28,29,30,31. For eksempel gennemgår actomyosinnetværk med tilstrækkelig tværbinding storskala sammentrækning og grovhed 2,28,30,32,33,34,35,36, mens netværk uden tværbindinger viser hurtig, destabiliserende flow og brister 19,29 . Rekonstitueret mikrotubuli-baseret aktiv nematik, der bruger klynger af kinesinmotorer til tværbinding og træk på mikrotubulusbundter, er rapporteret at udvise langvarige turbulente strømme, forlængelse, spændning, brud og heling 12,22,23,24,25,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47.
For nylig har actin-mikrotubuluskompositter drevet af myosin II mini-filamenter vist sig at føre til mere ordnet sammentrækning og netværksintegritet sammenlignet med den uordnede strømning og netværksbrud, som actomyosinnetværk uden tværbindinger udviser 17,26,48. Desuden optimeres kombinationen af sammensat robusthed og kraftgenerering, når actin og mikrotubuli er til stede ved sammenlignelige koncentrationer. Nøgle emergente funktioner i denne region af formuleringsrum omfatter forbedret mekanisk styrke 26, koordineret bevægelse af actin og mikrotubuli26, stabil vedvarende sammentrækning og mesoskala omstrukturering17.
Her beskrives protokoller til at konstruere og indstille sammenfiltrede og tværbundne kompositter af mikrotubuli og actinfilamenter, der skubbes ud af ligevægt af myosin II minifilamenter og kinesinklynger, der virker på henholdsvis actinfilamenter og mikrotubuli (figur 1). Dynamikken, strukturen og mekanikken i denne klasse af kompositter kan indstilles af de relative koncentrationer af filamenter, motorer og tværbindinger for at udvise et rigt faserum med advektiv og turbulent strømning, isotrop sammentrækning, acceleration, deceleration, deblanding, afstivning, afslapning og brud. Fokus for dette arbejde er på at forberede og indstille denne klasse af aktive cytoskeletale kompositter. For at hjælpe forskere med at benchmarke og karakterisere de beskrevne aktive kompositter er effektive billeddannelsesmetoder ved hjælp af multispektral konfokal mikroskopi imidlertid også detaljeret. Endelig præsenteres resultater af centrale beregningsanalysemetoder, der kan bruges til at måle dynamikken, strukturen og mekanikken i kompositterne. Forskere opfordres til at vedtage disse metoder – som omfatter differentiel dynamisk mikroskopi (DDM), rumlig billedautokorrelation (SIA) og partikelbilledvelocimetri (PIV) – da de er optimeret til at karakterisere den komplekse dynamik og strukturelle mangfoldighed af kompositterne 17,26,49.
Trinene beskrevet nedenfor fokuserer på at forberede kompositterne og billeddanne dem ved hjælp af konfokal mikroskopi. Protokoller, der beskriver dataanalyse efter indsamling og optiske pincetmålinger, kan findes i tidligere værker 17,26,48,50 og leveres efter anmodning. Alle materialer er angivet i den medfølgende materialetabel.
Et vigtigt fremskridt i det rekonstituerede system, der er beskrevet ovenfor, er dets modularitet og tunabilitet, så brugerne opfordres til at ændre koncentrationerne af proteiner, motorer, tværbindinger osv., Så de passer til deres ønskede resultater, hvad enten det er at efterligne en bestemt cellulær proces eller konstruere et materiale med specifik funktionalitet eller mekaniske egenskaber. Begrænsninger i koncentrationsområdet for actin og tubulin er fastsat til den nedre grænse ved den kritiske koncentration, der er nødvendig for at polymerisere actin (~ 0,2 μM) 57,58,59 og tubulin (~ 3 – 4 μM)60 og ved den øvre grænse ved overgangen til nematisk justering af actinfilamenter (~ 90 μM)61,62 eller mikrotubuli (~ 35 μM)63 . Actinmonomerer og tubulindimere bør polymeriseres til filamenter sammen i stedet for blandet sammen efter polymerisation for at sikre, at de danner homogent interpenetrerende perkolerede netværk, der synergistisk understøtter hinanden. Den nye dynamik, som kompositterne udviser, er afhængig af denne interaktion. Selvom det generelt er vigtigt at følge alle trin som beskrevet i protokollen for at kunne gengive de viste resultater, er nogle trin mere krævende, mens andre har plads til at ændre og justere, så de passer til specifikke behov og tilgængelige ressourcer.
For eksempel er et vigtigt skridt i at sikre reproducerbare resultater korrekt forberedelse og opbevaring af reagenserne i henhold til retningslinjerne i materialetabellen. Cytoskeletale proteiner (actin, tubulin, myosin, kinesin) er labile og bør eliciteres, flashfryses med flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C i engangsalikvoter. Når aliquoterne er fjernet fra -80 °C, skal de opbevares på is. Cytoskeletale proteiner bevarer ikke pålideligt funktionen efter yderligere fryse-optøningscyklusser.
Mikrotubuli er mere følsomme over for depolymerisering og denaturering end actin. Når tubulin er fjernet fra -80 °C, skal det opbevares på is før polymerisation og anvendes inden for 12 timer. Når de er polymeriseret, skal mikrotubuli opbevares ved stuetemperatur. Det er også afgørende at stabilisere mikrotubuli med taxol for at forhindre depolymerisering. Phalloidin-stabilisering af actinfilamenter er ligeledes vigtigt for at undertrykke den ATP-forbrugende actin-løbebånd, der konkurrerer med myosin og kinesinaktivitet.
Ultracentrifugering af myosinmotorer er et andet kritisk trin, da det fjerner inaktive myosin døde hoveder. Ikke at fjerne de enzymatisk inaktive monomerer resulterer i passiv tværbinding af actinnetværket og tab af aktivitet. For at forlænge ATPase-aktiviteten af motorer kan et ATP-regenereringssystem såsom kreatinphosphat og kreatinphosphokinase64 inkorporeres.
Endelig kræver opretholdelse af sammensat aktivitet hæmning af adsorption af filamenter og motorer til væggene i prøvekammeret, hvilket kan opnås ved passivering af mikroskopdækslerne og diasene. Motorproteiner er særligt tilbøjelige til adsorption, hvilket resulterer i, at kompositten trækkes til overfladen af prøvekammeret, bevæger sig ud af synsfeltet, kollapser til 2D og ikke længere undergår aktivitet. Silanisering af dækslikkerne og diasene er en effektiv måde at passivere overfladerne på og forhindre adsorption (se trin 1). En alternativ passiveringsmetode, der anvendes effektivt i in vitro cytoskeletforsøg, er at belægge overfladen med et lipiddobbeltlag, svarende til cellemembranen18. Denne metode er fordelagtig, hvis man ønsker at binde proteiner til overfladen eller introducere andre specifikke protein-overflade-interaktioner, fordi dobbeltlaget kan funktionaliseres. For optiske pinceteksperimenter er passivering af mikrosfærerne også kritisk og kan opnås ved at belægge carboxylerede mikrosfærer med BSA eller PEG via carbodimid-tværbindingskemi48.
Der er et par aspekter af de præsenterede protokoller, som forskere kan overveje at ændre, så de passer til deres behov. For det første kan forskere vælge at erstatte ikke-native biotin-NA-crosslinkere med biologiske crosslinkers, såsom alfa-actinin eller MAP65, der tværbinder actin og mikrotubuli henholdsvis 28,65,66. Brugen af ikke-native crosslinkere i de kompositter, der er beskrevet her, er motiveret af deres forbedrede reproducerbarhed, stabilitet og tunabilitet sammenlignet med native crosslinkers. På grund af den stærke biotin-NA-binding kan crosslinkere antages at være permanente, snarere end de fleste indfødte crosslinkers, der forbigående binder med vidtrækkende omsætningshastigheder. Dynamikken i forbigående tværbinding komplicerer analysen af bidragene fra tværbindinger og motorer til dynamikken. Desuden kan biotin-NA-linkere bruges alsidigt til at forbinde både actin og mikrotubuli samt tværbinding actin til mikrotubuli. På denne måde kan der foretages en entydig sammenligning mellem tværbindingsmotiver, der holder alle andre variabler (f.eks. Tværbindingsstørrelse, bindingsaffinitet, støkiometri osv.) faste. Endelig er de reagenser, der er nødvendige for at inkorporere biotin-NA-linkere, bredt kommercielt tilgængelige, velkarakteriserede og almindeligt anvendte i mange biofysiklaboratorier. En af de vigtigste styrker ved in vitro-platformen, der er beskrevet her, er imidlertid dens modularitet, så forskere bør være i stand til problemfrit at erstatte biotin-NA-linkere med native linkere, hvis de vælger det.
For det andet polymeriseres actinmonomerer og tubulinddimerer i den nuværende protokol i filamenter sammen i et centrifugerør, inden de tilsættes til prøvekammeret. Tilstrømning af opløsningen af sammenfiltrede filamentøse proteiner ind i prøvekammeret kan forårsage strømningsjustering, især af mikrotubuli, som bryder den ønskede isotropi og homogenitet af kompositterne. Faktisk var et stort fremskridt i tidligere arbejde med steady-state actin-mikrotubuli kompositter evnen til at co-polymerisere actin og mikrotubuli in situ (i prøvekammeret) for at sikre dannelse af isotrope interpenetrerende netværk af actin og mikrotubuli15,16,27. En udvidelse af denne fremgangsmåde til aktive kompositter vil imidlertid kræve, at motorerne tilsættes til prøven inden actin- og tubulinpolymerisation, og at hele prøven inkuberes sammen ved 37 °C forud for forsøg. Test af denne variation i protokollen har resulteret i reduceret actinpolymerisation og ingen mærkbar motoraktivitet, sandsynligvis på grund af konkurrerende ATPase-aktivitet og den langvarige 37 °C inkubation af motorerne. Heldigvis er der ingen synlig flowjustering af kompositter, når man følger de nuværende protokoller, som det kan ses i figur 2, figur 3 og figur 6. Ikke desto mindre opfordres forskere til at designe protokoller, der giver mulighed for in situ-dannelse af aktive kompositter.
Et andet overvejelsespunkt er fluorescensmærkningsordningen, som indebærer sparsom mærkning af alle actinfilamenter og mikrotubuli i netværket. Denne mærkningsmetode blev optimeret til direkte at visualisere netværkets struktur i stedet for at udlede struktur og dynamik via sporfilamenter eller mikrosfærer. Afvejningen er imidlertid, at individuelle filamenter ikke er lyst mærket og løselige. En tilgang, som forskere kunne tage for både at løse enkeltfilamenter såvel som visualisere netværksstruktur, er at dope i præformede filamenter mærket med en anden fluorophore, så både det omgivende netværk og individuelle filamenter kunne afbildes samtidigt. Men når du bruger mere end to fluorophorer og excitation / emissionskanaler, er blødning mellem kanaler ofte svært at eliminere, så man skal være forsigtig med at vælge fluorophorer, filtre og laserintensiteter.
En relateret begrænsning er manglende evne til at visualisere myosin- eller kinesinmotorerne i kompositterne. De fluorescerende mærkede actinmonomerer og tubulindimere, der anvendes, er kommercielt tilgængelige, mens visualisering af myosin eller kinesin i kompositter kræver intern mærkning. Forskere opfordres til at tage det næste skridt til at mærke motorer, som tidligeregjort 18,67, for at kunne utvetydigt forbinde motoraktivitet og binding til den dynamik og strukturer, som vores kompositter udviser.
Endelig er det vigtigt at bemærke, at i den nuværende protokol kontrolleres kinesinaktivitetens begyndelse og varighed ikke. Fordi myosinaktiviteten styres ved hjælp af fotodeaktivering af blebbistatin, som beskrevet ovenfor, for at opbygge lignende lysaktivering af kinesin, kan man inkorporere lysaktiveret ATP.
For at opbygge kompleksiteten af de designs, der er beskrevet her, for bedre at efterligne cellulære forhold og udvide parameterrummet for dynamisk struktur-funktion, vil det fremtidige arbejde fokusere på at inkorporere mellemliggende filamenter, såsom vimentin68,69, samt andre motorer såsom dynein13,70. Gelsolin vil også blive inkorporeret i forskellige koncentrationer for at kontrollere actinlængde14 samt tau-protein til kontrol af mikrotubulusstivhed.
Sammenfattende beskriver de præsenterede protokoller, hvordan man designer, skaber og karakteriserer dynamikken, strukturen og mekanikken i cytoskelet-inspirerede aktive stofsystemer, der indeholder to separate aktive kraftgenererende komponenter, der virker på forskellige substrater i et enkelt system. Denne justerbare og modulære platform bringer rekonstitutionsindsatsen et vigtigt skridt tættere på at efterligne det cellulære cytoskelet og tilbyder den unikke evne til at programmere dets egenskaber på tværs af et bredt faserum ved uafhængigt at inkorporere, fjerne og indstille de forskellige komponenter. Desuden er alle komponenter i dette alsidige system kommercielt tilgængelige (se Materialetabel), bortset fra kinesin dimers, der renses i Ross Lab, som beskrevet tidligere50, og tilgængelige efter anmodning. Endelig er al analysekode frit tilgængelig via GitHub49 og er baseret på gratis programmeringssprog og software (Python og Fiji). Den gennemsigtige formidling af protokoller til design af disse systemer vil forhåbentlig gøre denne platform mere tilgængelig for en forskelligartet gruppe brugere med forskellig ekspertise, baggrund, institutionelle tilknytninger og forskningsmål.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Maya Hendija og Dr. Jonathan Michel for hjælp med dataanalyse og Dr. Janet Sheung, Dr. Moumita Das og Dr. Michael Rust for nyttige diskussioner og vejledning. Denne forskning blev støttet af et William M. Keck Foundation Research Grant og NSF DMREF Award (DMR 2119663) tildelt RMRA og JLR og National Institutes of Health R15 Grants (R15GM123420, 2R15GM123420-02) tildelt RMR-A og RJM.
(-)-Blebbistatin Abbreviation used in paper: blebbistatin |
Sigma Aldrich | B0560 | Stock Concentration: 200 μM in DMSO Storage: dessicated, in DMSO, -20ºC Stock and Experiment Recipes: dissolve 1 mg of powder to 200 μM in DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: limited shelf-life, typically stops functioning reliably after 3-4 months. purchase and prepare new solution every 3 months. |
1:20 488-tubulin:tubulin mixture Abbreviation used in paper: 5-488-tubulin |
NA | NA | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and 488-tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
1:20 R-tubulin:tubulin mixture Abbreviation used in paper: 5-R-tubulin |
NA | NA | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and rhodamine tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
actin (biotin): skeletal muscle Abbreviation used in paper: biotin-actin |
Cytoskeleton | AB07 | Stock Concentration: 1 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: (1) immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM, (2) once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC for up to 1 week |
actin (rhodamine): rabbit skeletal muscle Abbreviation used in paper: R-actin |
Cytoskeleton | AR05 | Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week |
adenosine triphosphate Abbreviation used in paper: ATP |
Thermo Fisher Scientific | A1048 | Stock Concentration: 100 mM Storage: in solution (pH 7), -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconsitute in DI H20, bring pH to 7 with NaOH Storage, Handling, Troubleshooting Notes: routinely check pH and adjust as needed, hydrolyzes over time, replace every ~6-12 months |
AlexaFluor488 Phalloidin Abbreviation used in paper: 488-phalloidin |
Thermo Fisher Scientific | A12379 | Stock Concentration: 100 μM DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 20 μM in PEM (1 μL in 4 μL PEM) |
AlexaFluor488–labeled actin Abbreviation used in paper: 488-actin |
Thermo Fisher Scientific | A12373 | Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: this item has been discontinued |
Basic Plasma Cleaner Abbreviation used in paper: plasma cleaner |
Harrick Plasma | PDC-32G | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Abbreviation used in paper: transparent film |
Thermo Fisher Scientific | 13-374-5 | |
D-(+)-Glucose Abbreviation used in paper: |
Thermo Fisher Scientific | A1682836 | Stock Concentration: 100x Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 4.5 mg/ml in DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should 45 μg/mL |
D-Biotin Abbreviation used in paper: biotin |
Fisher Scientific | BP232-1 | Stock Concentration: 1.02 mM in PEM Storage: dessicated, 4ºC |
deionized nanopure water Abbreviation used in paper: DI |
|||
Dimethyldichlorosilane Abbreviation used in paper: silane |
Thermo Fisher Scientific | D/3820/PB05 | Stock Concentration: 2% dissolved in Toulene |
Dithiothreitol Abbreviation used in paper: DTT |
Thermo Fisher Scientific | R0861 | Stock Concentration: 1 M in DMSO Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: dilute to 2 mM in PEM immediately before each experiment |
DMSO Anhydrous Abbreviation used in paper: DMSO |
Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
F-Buffer Abbreviation used in paper: F-buffer |
NA | NA | Stock Concentration: 10x Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: 10 mM Imidazole (pH 7.0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.2 mM ATP |
G-Buffer Abbreviation used in paper: G-buffer |
NA | NA | Stock Concentration: 10x Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: 2.0 mM Tris (pH 8), 0.2 mM ATP, 0.5 mM DTT, 0.1 mM CaCl2. Store at -20°C. |
glass microscope slide Abbreviation used in paper: slide |
Thermo Fisher Scientific | 22-310397 | |
Glucose oxidase + catalase + β-mercaptoethanol Abbreviation used in paper: GOC |
Sigma Aldrich | G2133-250KU, C1345, 63689 | Stock Concentration: 100x Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC Stock and Experiment Recipes: For 100x: 4.3 mg/ml glucose oxidase, 0.7 mg/ml catalase, 0.5% v/v β-mercaptoethanol in DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should be: 0.005% β-mercaptoethanol, 43 μg/mL glucose oxidase, 7 μg/mL catalase |
glu-GOC oxygen scavenging system Abbreviation used in paper: glu-GOC |
NA | NA | Stock Concentration: 100x Storage: prepare fresh each time Stock and Experiment Recipes: mix equal parts Glu and GOC and add at 1/100 final sample volume immediately before imaging Storage, Handling, Troubleshooting Notes: prepare from Glu and GOC immediately before imaging |
Guanosine triphosphate Abbreviation used in paper: GTP |
Thermo Fisher Scientific | R0461 | Stock Concentration: 100 mM Storage: 100 μL aliquots at -20ºC |
Instant Mix 1-minute epoxy Abbreviation used in paper: epoxy |
Loctite | 1366072 | |
Kinesin-1 401 BIO 6x HIS Abbreviation used in paper: kinesin |
Prepared in JL Ross Lab at Syracuse University | NA | Stock Concentration: 8.87 μM in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Storage, Handling, Troubleshooting Notes: biotinylated dimers form kinesin clusters, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
NeutrAvidin Abbreviation used in paper: NA |
Thermo Fisher Scientific | 31000 | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM |
No 1. glass coverslips (24 mm x 24 mm) Abbreviation used in paper: coverslip |
Thermo Fisher Scientific | 12-548-CP | |
Paclitaxel Abbreviation used in paper: Taxol |
Thermo Fisher Scientific | P3456 | Stock Concentration: 2 mM in DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 200 μM in DMSO (0.4 μL in 3.6 μL DMSO) |
PEM-100 Abbreviation used in paper: PEM |
NA | NA | Stock Concentration: 1x Storage: room temperature (RT) Stock and Experiment Recipes: 100 mM K-PIPES (pH 6.8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: use KOH to adjust pH to 6.8, recheck pH often and adjust accordingly |
phalloidin Abbreviation used in paper: phalloidin |
Thermo Fisher Scientific | P3457 | Stock Concentration: 100 μM in DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC, adhere closely to storage/handling conditions Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: susceptible to impurities in its preparation and denaturing, identifiable as large amorphous aggregates of actin in samples |
porcine brain tubulin Abbreviation used in paper: tubulin |
Cytoskeleton | T240 | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
Potassium Chloride Abbreviation used in paper: KCl |
Thermo Fisher Scientific | AM9640G | Stock Concentration: 4 M Storage: RT |
Rabbit skeletal actin Abbreviation used in paper: actin |
Cytoskeleton | AKL99 | Stock Concentration: 2 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week |
Rabbit skeletal myosin II Abbreviation used in paper: myosin |
Cytoskeleton | MY02 | Stock Concentration: 10 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 10 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: monomers form minifilaments at low KCl, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
Tubulin (biotin): porcine brain Abbreviation used in paper: biotin-tubulin |
Cytoskeleton | T333P | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM |
Tubulin (fluorescent HiLyte 488): porcine brain Abbreviation used in paper: 488-tubulin |
Cytoskeleton | TL488M | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
tubulin (rhodamine): porcine brain Abbreviation used in paper: R-tubulin |
Cytoskeleton | TL590M | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
Tween 20 Abbreviation used in paper: Tween20 |
Thermo Fisher Scientific | J20605.AP | Stock Concentration: 1% v/v in DI H20 Storage: RT |
ultracentrifuge grade microtubes Abbreviation used in paper: Beckman-Coulter Optima Max XP |
Beckman Coultier | 343776 | Storage, Handling, Troubleshooting Notes: 8×34 mm PC |
UV light curing glue Abbreviation used in paper: UV glue |
Pharda | SKG-2869 |