यह पेपर इंजीनियरिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और सह-उलझा हुआ एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं के असमर्थ त्रि-आयामी समग्र नेटवर्क को चिह्नित करता है। कंपोजिट सक्रिय पुनर्गठन और बैलिस्टिक गति से गुजरते हैं, जो मायोसिन II और किनेसिन मोटर्स द्वारा संचालित होते हैं, और एक्टिन, सूक्ष्मनलिकाएं, मोटर प्रोटीन और निष्क्रिय क्रॉसलिंकर की सापेक्ष सांद्रता से ट्यून किए जाते हैं।
मिश्रित साइटोस्केलेटन, जिसमें अर्ध-लचीले एक्टिन फिलामेंट्स और कठोर सूक्ष्मनलिकाएं के अंतःक्रियात्मक नेटवर्क शामिल हैं, माइग्रेशन, साइटोकिनेसिस, आसंजन और मेकेनोसेंसिंग जैसी प्रमुख प्रक्रियाओं को चलाने के लिए मायोसिन II और काइन्सिन जैसे मोटर प्रोटीन का उपयोग करके बलों का पुनर्गठन और उत्पन्न करते हैं। जबकि एक्टिन-सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन की बहुमुखी प्रतिभा और अनुकूलनशीलता के लिए महत्वपूर्ण हैं, मायोसिन और काइन्सिन गतिविधि के साथ उनके अंतःक्रिया की समझ अभी भी नवजात है। यह काम वर्णन करता है कि सह-उलझे हुए एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं के असमर्थ त्रि-आयामी समग्र नेटवर्क को कैसे इंजीनियर किया जाए जो मायोसिन II और किन्सिन मोटर्स द्वारा संचालित सक्रिय पुनर्गठन और बैलिस्टिक गति से गुजरते हैं, और एक्टिन, सूक्ष्मनलिकाएं, मोटर प्रोटीन और निष्क्रिय क्रॉसलिंकर की सापेक्ष सांद्रता से ट्यून किए जाते हैं। मल्टी-स्पेक्ट्रल कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके समग्र पुनर्गठन और गति को सबसे प्रभावी ढंग से कल्पना करने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन फिलामेंट्स के फ्लोरेसेंस लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल भी विस्तृत हैं। अंत में, डेटा विश्लेषण विधियों के परिणाम जो मात्रात्मक रूप से गैर-संतुलन संरचना, गतिशीलता और यांत्रिकी को चिह्नित करने के लिए उपयोग किए जा सकते हैं, प्रस्तुत किए जाते हैं। इस असमर्थ बायोमिमेटिक प्लेटफॉर्म को फिर से बनाना और जांच करना मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कि कैसे युग्मित मोटर गतिविधि, समग्र यांत्रिकी और फिलामेंट गतिशीलता माइटोसिस से ध्रुवीकरण से लेकर मेकेनो-सनसनी तक असंख्य सेलुलर प्रक्रियाओं को जन्म दे सकती है।
साइटोस्केलेटन इंटरैक्टिंग बायोपॉलिमर का एक गतिशील समग्र नेटवर्क है जो कोशिकाओं को संरचनात्मक और यांत्रिक सहायता प्रदान करता है। संबद्ध आणविक मोटर्स और बाध्यकारी प्रोटीन कोशिकाओं को बढ़ने, आकार बदलने, कठोर होने, स्थानांतरित करने और यहां तक कि आत्म-उपचार करने की अनुमति देने के लिए साइटोस्केलेटन को पुनर्गठित और अनुकूलित करते हैं, जिससे माइग्रेशन और डिवीजन से लेकर मेकेनोसेंसिंग 1,2 तक असंख्य सेलुलर प्रक्रियाएं सक्षम होती हैं। सेलुलर बायोफिज़िक्स में इसके महत्व से परे, साइटोस्केलेटन घाव भरने और दवा वितरण से लेकर निस्पंदन और नरम रोबोटिक्स 1,3,4,5,6,7,8,9 तक संभावित सामग्री अनुप्रयोगों के साथ सक्रिय पदार्थ का एक सर्वोत्कृष्ट उदाहरण भी है।
साइटोस्केलेटन को इसकी अनूठी संरचनात्मक और यांत्रिक विविधता और बहुक्रियाशीलता के साथ संपन्न करने वाली दो प्रमुख विशेषताएं हैं: 1) इसकी समग्र प्रकृति, जिसमें कई अंतःक्रियात्मक प्रोटीन फिलामेंट्स शामिल हैं, जैसे कि अर्ध-लचीला एक्टिन फिलामेंट्स और कठोर सूक्ष्मनलिकाएं, साथ ही साथ उनके संबंधित बंधन और क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन 3,5,10; और 2) ऊर्जा-खपत मोटर्स, जैसे मायोसिन और किन्सिन के माध्यम से लगातार पुनर्गठन, स्थानांतरित, मोटा और काम करने की क्षमता, फिलामेंटस प्रोटीन 1,7,11,12,13 पर धक्का देना और खींचना। जबकि यह सुरुचिपूर्ण जटिलता साइटोस्केलेटन को सेल गतिशीलता, साइटोकिनेसिस और घाव भरने 3,6,7,11 के रूप में विविध प्रक्रियाओं को मध्यस्थ करने में सक्षम बनाती है, यह शोधकर्ताओं की क्षमता को पुनर्गठित इन विट्रो सिस्टम में साइटोस्केलेटन की विवो विशेषताओं में हस्ताक्षर को पुन: उत्पन्न करने की क्षमता में बाधा डालती है।
वर्तमान सीमांत पुनर्गठन प्रयास उलझे हुए और क्रॉसलिंक्ड एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं 3,10,14,15,16,17, बल-जनरेटिंग एक्टोमायोसिन नेटवर्क 2,8,18,19,20,21 और काइन्सिन-माइक्रोट्यूबुल्स द्वारा संचालित सक्रिय न्यूमैटिक्स के कंपोजिट पर ध्यान केंद्रित करते हैं इंटरैक्शन 22,23,24,25,26. स्थिर-राज्य एक्टिन-सूक्ष्मनलिका कंपोजिट को उभरते यांत्रिक गुणों को प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है 15,16,27, जैसे कि बढ़ी हुई फिलामेंट गतिशीलता और एकल-घटक प्रणालियों की तुलना में कठोरता में वृद्धि। इन विट्रो एक्टोमायोसिन सिस्टम पर अध्ययन ने संरचनात्मक और गतिशील गुणों की एक विस्तृत श्रृंखला की सूचना दी है जो एक्टिन, मायोसिन और क्रॉसलिंकर 28,29,30,31 की सांद्रता पर निर्भर करते हैं। उदाहरण के लिए, पर्याप्त क्रॉसलिंकिंग के साथ, एक्टोमायोसिन नेटवर्क बड़े पैमाने पर संकुचन और मोटे 2,28,30,32,33,34,35,36 से गुजरते हैं, जबकि क्रॉसलिंकर के बिना, नेटवर्क तेजी से, अस्थिर प्रवाह प्रदर्शित करते हैं और 19,29 को तोड़ते हैं . पुनर्गठित सूक्ष्मनलिका-आधारित सक्रिय नेमैटिक्स जो सूक्ष्मनलिका बंडलों को क्रॉसलिंक करने और खींचने के लिए काइन्सिन मोटर्स के समूहों का उपयोग करते हैं, को लंबे समय तक चलने वाले अशांत प्रवाह, विस्तार, बकलिंग, फ्रैक्चरिंग और उपचार 12,22,23,24,25,37,38,39,40,41 का प्रदर्शन करने के लिए सूचित किया गया है। 42,43,44,45,46,47.
हाल ही में, मायोसिन II मिनी-फिलामेंट्स द्वारा संचालित एक्टिन-माइक्रोट्यूबुल्स कंपोजिट को अव्यवस्थित प्रवाह और नेटवर्क टूटने की तुलना में अधिक व्यवस्थित संकुचन और नेटवर्क अखंडता का कारण दिखाया गया है जो क्रॉसलिंकर के बिना एक्टोमायोसिन नेटवर्क 17,26,48 प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, समग्र मजबूती और बल-उत्पादन का संयोजन अनुकूलित किया जाता है जब एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं तुलनीय सांद्रता पर मौजूद होती हैं। सूत्रीकरण अंतरिक्ष के इस क्षेत्र में प्रमुख उभरती विशेषताओं में बढ़ी हुई यांत्रिक शक्ति26, एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं26 की समन्वित गति, स्थिर निरंतर संकुचन और मेसोस्केल पुनर्गठन17 शामिल हैं।
यहां, प्रोटोकॉल को सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन फिलामेंट्स के सह-उलझे हुए और क्रॉसलिंक्ड कंपोजिट को इंजीनियर करने और ट्यून करने के लिए वर्णित किया गया है, जिन्हें क्रमशः एक्टिन फिलामेंट्स और माइक्रोट्यूबुल्स पर काम करने वाले मायोसिन II मिनी-फिलामेंट्स और किनेसिन क्लस्टर द्वारा संतुलन से बाहर धकेल दिया जाता है (चित्रा 1)। कंपोजिट के इस वर्ग की गतिशीलता, संरचना और यांत्रिकी को तंतुओं, मोटर्स और क्रॉसलिंकर की सापेक्ष सांद्रता द्वारा ट्यून किया जा सकता है ताकि उत्तेजक और अशांत प्रवाह, आइसोट्रोपिक संकुचन, त्वरण, मंदी, डी-मिक्सिंग, कठोरता, विश्राम और टूटने के समृद्ध चरण स्थान का प्रदर्शन किया जा सके। इस काम का ध्यान सक्रिय साइटोस्केलेटल कंपोजिट के इस वर्ग को तैयार करने और ट्यून करने पर है। हालांकि, वर्णित सक्रिय कंपोजिट को बेंचमार्क करने और चिह्नित करने में शोधकर्ताओं की सहायता के लिए, बहु-वर्णक्रमीय कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रभावी इमेजिंग विधियां भी विस्तृत हैं। अंत में, प्रमुख कम्प्यूटेशनल विश्लेषण विधियों के परिणाम जो कंपोजिट की गतिशीलता, संरचना और यांत्रिकी को मापने के लिए उपयोग किए जा सकते हैं, प्रस्तुत किए जाते हैं। शोधकर्ताओं को इन तरीकों को अपनाने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है – जिसमें अंतर गतिशील माइक्रोस्कोपी (डीडीएम), स्थानिक छवि ऑटोकोरिलेशन (एसआईए), और कण छवि वेलोसिमेट्री (पीआईवी) शामिल हैं – क्योंकि उन्हें कंपोजिट 17,26,49 की जटिल गतिशीलता और संरचनात्मक विविधता को चिह्नित करने के लिए अनुकूलित किया गया है।
नीचे वर्णित चरण कंपोजिट तैयार करने और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उन्हें इमेजिंग करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। अधिग्रहण के बाद डेटा विश्लेषण और ऑप्टिकल ट्वीज़र्स माप का वर्णन करने वाले प्रोटोकॉल पिछले कार्यों 17,26,48,50 में पाए जा सकते हैं, और अनुरोध पर प्रदान किए जा सकते हैं। सभी सामग्री प्रदान की गई सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।
ऊपर वर्णित पुनर्गठित प्रणाली की एक महत्वपूर्ण प्रगति इसकी मॉड्यूलरिटी और ट्यूनेबिलिटी है, इसलिए उपयोगकर्ताओं को अपने वांछित परिणामों के अनुरूप प्रोटीन, मोटर्स, क्रॉसलिंकर आदि की सांद्रता को संशोधित करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, चाहे वह किसी विशेष सेलुलर प्रक्रिया का अनुकरण करना हो या विशिष्ट कार्यक्षमता या यांत्रिक गुणों के साथ सामग्री इंजीनियर करना हो। एक्टिन और ट्यूबुलिन की एकाग्रता सीमा पर सीमाएं एक्टिन (~ 0.2 μM)57,58,59 और ट्यूबुलिन (~ 3 – 4 μM)60 को पॉलीमराइज़ करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण एकाग्रता द्वारा निचली सीमा पर निर्धारित की जाती हैं, और ऊपरी सीमा पर एक्टिन फिलामेंट्स (~ 90 μM)61,62 या सूक्ष्मनलिकाएं (~ 35 μM)63 के न्यूमेटिक संरेखण में संक्रमण द्वारा निर्धारित की जाती हैं। . एक्टिन मोनोमर्स और ट्यूबुलिन डिमर को पोलीमराइजेशन के बाद एक साथ मिश्रित करने के बजाय फिलामेंट्स में एक साथ पोलीमराइज्ड किया जाना चाहिए, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे समरूप रूप से इंटरपेनिट्रेटिंग परकोलेटेड नेटवर्क बनाते हैं जो सहक्रियात्मक रूप से एक-दूसरे का समर्थन करते हैं। कंपोजिट प्रदर्शित करने वाली उपन्यास गतिशीलता इस बातचीत पर निर्भर करती है। हालांकि दिखाए गए परिणामों को सफलतापूर्वक पुन: पेश करने के लिए प्रोटोकॉल में उल्लिखित सभी चरणों का पालन करना आम तौर पर महत्वपूर्ण है, कुछ चरण अधिक सटीक हैं, जबकि अन्य में विशिष्ट आवश्यकताओं और उपलब्ध संसाधनों को फिट करने के लिए संशोधित और समायोजित करने के लिए जगह है।
उदाहरण के लिए, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों को सुनिश्चित करने में एक महत्वपूर्ण कदम सामग्री की तालिका में प्रदान किए गए दिशानिर्देशों का पालन करते हुए अभिकर्मकों को ठीक से तैयार करना और संग्रहीत करना है। साइटोस्केलेटल प्रोटीन (एक्टिन, ट्यूबुलिन, मायोसिन, किन्सिन) लेबिल होते हैं और तरल नाइट्रोजन के साथ फ्लैश-जमे हुए होते हैं, और एकल-उपयोग वाले एलिकोट में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाने चाहिए। -80 डिग्री सेल्सियस से हटाने के बाद, एलिकोट को बर्फ पर रखा जाना चाहिए। साइटोस्केलेटल प्रोटीन अतिरिक्त फ्रीज-पिघलना चक्रों के बाद विश्वसनीय रूप से कार्य को बनाए नहीं रखते हैं।
सूक्ष्मनलिकाएं एक्टिन की तुलना में डीपोलीमराइजेशन और विकृत करने के प्रति अधिक संवेदनशील होती हैं। एक बार -80 डिग्री सेल्सियस से हटा दिए जाने के बाद, ट्यूबुलिन को पोलीमराइजेशन से पहले बर्फ पर रखा जाना चाहिए, और 12 घंटे के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए। एक बार बहुलक होने के बाद, सूक्ष्मनलिकाएं कमरे के तापमान पर रखी जानी चाहिए। डिपोलीमराइजेशन को रोकने के लिए टैक्सोल के साथ सूक्ष्मनलिकाएं स्थिर करना भी महत्वपूर्ण है। एक्टिन फिलामेंट्स का फेलोइडिन-स्थिरीकरण एटीपी-खपत करने वाले एक्टिन ट्रेडमिलिंग को दबाने के लिए भी महत्वपूर्ण है जो मायोसिन और काइन्सिन गतिविधि के साथ प्रतिस्पर्धा करता है।
मायोसिन मोटर्स का अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन एक और महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि यह निष्क्रिय मायोसिन मृत सिर को हटा देता है। एंजाइमेटिक रूप से निष्क्रिय मोनोमर्स को नहीं हटाने से एक्टिन नेटवर्क का निष्क्रिय क्रॉसलिंकिंग और गतिविधि का नुकसान होता है। मोटर्स की एटीपीस गतिविधि को बढ़ाने के लिए, क्रिएटिन फॉस्फेट और क्रिएटिन फॉस्फोकाइनेज64 जैसे एटीपी पुनर्जनन प्रणाली को शामिल किया जा सकता है।
अंत में, समग्र गतिविधि को बनाए रखने के लिए नमूना कक्ष की दीवारों पर फिलामेंट्स और मोटर्स के सोखने को रोकने की आवश्यकता होती है, जिसे माइक्रोस्कोप कवरलिप्स और स्लाइड्स के निष्क्रिय होने से प्राप्त किया जा सकता है। मोटर प्रोटीन विशेष रूप से सोखना के लिए प्रवण होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप समग्र को नमूना कक्ष की सतह पर खींचा जाता है, फील्ड-ऑफ-व्यू से बाहर निकल जाता है, 2 डी तक ढह जाता है, और अब गतिविधि से नहीं गुजरता है। कवरलिप्स और स्लाइड्स को सिलनाइज करना सतहों को पास करने और सोखना को रोकने का एक प्रभावी तरीका है (चरण 1 देखें)। इन विट्रो साइटोस्केलेटन प्रयोगों में प्रभावी ढंग से उपयोग की जाने वाली एक वैकल्पिक निष्क्रिय विधि कोशिका झिल्ली18 के समान लिपिड बाइलेयर के साथ सतह को कोटिंग कर रही है। यह विधि फायदेमंद है यदि कोई प्रोटीन को सतह पर जोड़ना चाहता है या अन्य विशिष्ट प्रोटीन-सतह इंटरैक्शन पेश करना चाहता है, क्योंकि बाइलेयर को कार्यात्मक बनाया जा सकता है। ऑप्टिकल ट्वीज़र्स प्रयोगों के लिए, माइक्रोसेफर्स का निष्क्रिय होना भी महत्वपूर्ण है, और कार्बोडिमाइड क्रॉसलिंकर रसायन विज्ञान48 के माध्यम से बीएसए या पीईजी के साथ कार्बोक्सिलेटेड माइक्रोसेफर्स को कोटिंग करके प्राप्त किया जा सकता है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल के कुछ पहलू हैं जिन्हें शोधकर्ता अपनी आवश्यकताओं के अनुरूप बदलने पर विचार कर सकते हैं। सबसे पहले, शोधकर्ता गैर-देशी बायोटिन-एनए क्रॉसलिंकर को जैविक क्रॉसलिंकर के साथ बदलने का विकल्प चुन सकते हैं, जैसे कि अल्फा-एक्टिनिन या एमएपी 65 जो क्रमशः एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं क्रॉसलिंक करते हैं,क्रमशः 28,65,66। यहां वर्णित कंपोजिट में गैर-देशी क्रॉसलिंकर का उपयोग देशी क्रॉसलिंकर्स की तुलना में उनकी बढ़ी हुई प्रजनन क्षमता, स्थिरता और ट्यूनेबिलिटी से प्रेरित है। मजबूत बायोटिन-एनए बॉन्ड के कारण, क्रॉसलिंकर को अधिकांश देशी क्रॉसलिंकर्स के बजाय स्थायी माना जा सकता है जो क्षणिक रूप से व्यापक टर्नओवर दरों के साथ बंधते हैं। क्षणिक क्रॉसलिंकिंग की गतिशीलता क्रॉसलिंकर और मोटर्स से गतिशीलता में योगदान को जटिल बनाती है। इसके अलावा, बायोटिन-एनए लिंकर का उपयोग बहुमुखी रूप से एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं दोनों को क्रॉसलिंक करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही क्रॉसलिंक एक्टिन को सूक्ष्मनलिकाएं भी। इस तरह, क्रॉसलिंकिंग रूपांकनों के बीच एक स्पष्ट तुलना की जा सकती है, अन्य सभी चर (जैसे, क्रॉसलिंकर आकार, बाध्यकारी आत्मीयता, स्टोइकोमेट्री, आदि) को तय रखा जा सकता है। अंत में, बायोटिन-एनए लिंकर को शामिल करने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों व्यापक रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, अच्छी तरह से विशेषता है, और आमतौर पर कई बायोफिज़िक्स प्रयोगशालाओं में उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, यहां वर्णित इन विट्रो प्लेटफॉर्म की प्रमुख शक्तियों में से एक इसकी मॉड्यूलरिटी है, इसलिए शोधकर्ताओं को बायोटिन-एनए लिंकर को मूल लिंकर के साथ मूल रूप से बदलने में सक्षम होना चाहिए।
दूसरे, वर्तमान प्रोटोकॉल में, एक्टिन मोनोमर्स और ट्यूबुलिन डिमर को नमूना कक्ष में जोड़ने से पहले सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक साथ फिलामेंट्स में पॉलीमराइज्ड किया जाता है। नमूना कक्ष में उलझे हुए फिलामेंटस प्रोटीन के घोल को प्रवाहित करने से प्रवाह संरेखण हो सकता है, विशेष रूप से सूक्ष्मनलिकाएं, जो कंपोजिट की वांछित आइसोट्रोपी और समरूपता को तोड़ती हैं। दरअसल, स्थिर-राज्य एक्टिन-सूक्ष्मनलिका कंपोजिट पर पूर्व कार्य में एक बड़ी प्रगति एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं 15,16,27 के आइसोट्रोपिक इंटरपेनिट्रेटिंग नेटवर्क के गठन को सुनिश्चित करने के लिए सीटू (नमूना कक्ष में) में एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं को-पॉलीमराइज करने की क्षमता थी। हालांकि, सक्रिय कंपोजिट के लिए इस दृष्टिकोण का विस्तार करने के लिए एक्टिन और ट्यूबुलिन पोलीमराइजेशन से पहले नमूने में मोटर्स को जोड़ने की आवश्यकता होगी और प्रयोगों से पहले पूरे नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक साथ इनक्यूबेट करना होगा। प्रोटोकॉल में इस भिन्नता के परीक्षणों के परिणामस्वरूप एक्टिन पोलीमराइजेशन कम हो गया है और कोई स्पष्ट मोटर गतिविधि नहीं हुई है, संभवतः प्रतिस्पर्धी एटीपीस गतिविधि और मोटर्स के लंबे समय तक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन के कारण। सौभाग्य से, वर्तमान प्रोटोकॉल का पालन करते समय कंपोजिट का कोई स्पष्ट प्रवाह संरेखण नहीं है, जैसा कि चित्रा 2, चित्रा 3 और चित्रा 6 में देखा जा सकता है। फिर भी, शोधकर्ताओं को प्रोटोकॉल डिजाइन करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है जो सक्रिय कंपोजिट के सीटू गठन की अनुमति देता है।
विचार का एक और बिंदु प्रतिदीप्ति लेबलिंग योजना है, जो नेटवर्क में सभी एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं को विरल रूप से लेबल करता है। इस लेबलिंग दृष्टिकोण को ट्रेसर फिलामेंट्स या माइक्रोसेफर्स के माध्यम से संरचना और गतिशीलता का अनुमान लगाने के बजाय नेटवर्क की संरचना को सीधे कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया गया था। हालांकि, व्यापार यह है कि व्यक्तिगत फिलामेंट्स उज्ज्वल रूप से लेबल और हल करने योग्य नहीं हैं। एक दृष्टिकोण जो शोधकर्ता एकल फिलामेंट्स को हल करने के साथ-साथ नेटवर्क संरचना की कल्पना करने के लिए ले सकते हैं, वह है एक और फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किए गए पूर्व-निर्मित फिलामेंट्स में डोप करना, ताकि आसपास के नेटवर्क और व्यक्तिगत फिलामेंट्स दोनों को एक साथ चित्रित किया जा सके। हालांकि, दो से अधिक फ्लोरोफोर और उत्तेजना / उत्सर्जन चैनलों का उपयोग करते समय, चैनलों के बीच रक्तस्राव को खत्म करना अक्सर कठिन होता है, इसलिए फ्लोरोफोरे, फिल्टर और लेजर तीव्रता चुनने में सावधानी बरतनी चाहिए।
एक संबंधित सीमा कंपोजिट में मायोसिन या किन्सिन मोटर्स की कल्पना करने में असमर्थता है। फ्लोरोसेंट-लेबल एक्टिन मोनोमर्स और ट्यूबुलिन डिमर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जबकि कंपोजिट में मायोसिन या काइन्सिन के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए इन-हाउस लेबलिंग की आवश्यकता होती है। शोधकर्ताओं को मोटर्स को लेबल करने के लिए अगला कदम उठाने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, जैसा कि पहले18,67 किया गया था, ताकि मोटर गतिविधि को स्पष्ट रूप से लिंक किया जा सके और हमारे कंपोजिट प्रदर्शित होने वाली गतिशीलता और संरचनाओं को बांध सकें।
अंत में, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, वर्तमान प्रोटोकॉल में, किनेसिन गतिविधि की शुरुआत और अवधि को नियंत्रित नहीं किया जाता है। क्योंकि मायोसिन गतिविधि को ब्लेबिस्टैटिन के फोटो-डिएक्टिवेशन का उपयोग करके नियंत्रित किया जाता है, जैसा कि ऊपर वर्णित है, काइन्सिन के समान प्रकाश-सक्रियण में निर्माण करने के लिए, कोई प्रकाश-सक्रिय एटीपी को शामिल कर सकता है।
यहां वर्णित डिजाइनों की जटिलता का निर्माण करने के लिए, सेलुलर स्थितियों की बेहतर नकल करने और गतिशील-संरचना-फ़ंक्शन पैरामीटर स्थान को व्यापक बनाने के लिए, भविष्य का काम मध्यवर्ती फिलामेंट्स को शामिल करने पर ध्यान केंद्रित करेगा, जैसे कि विमेंटिन68,69, साथ ही अन्य मोटर्स जैसे डायनेन13,70। एक्टिन लंबाई14 को नियंत्रित करने के लिए विभिन्न सांद्रता में गेलसोलिन को भी शामिल किया जाएगा, साथ ही सूक्ष्मनलिका कठोरता को नियंत्रित करने के लिए ताऊ प्रोटीन भी शामिल किया जाएगा।
सारांश में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल वर्णन करते हैं कि साइटोस्केलेटन-प्रेरित सक्रिय पदार्थ प्रणालियों की गतिशीलता, संरचना और यांत्रिकी को कैसे डिजाइन, बनाया और चिह्नित किया जाए, जिसमें दो अलग-अलग सक्रिय बल-उत्पन्न करने वाले घटक होते हैं जो एक ही प्रणाली में विभिन्न सब्सट्रेट्स पर कार्य करते हैं। यह असमर्थ और मॉड्यूलर प्लेटफ़ॉर्म पुनर्गठन प्रयासों को सेलुलर साइटोस्केलेटन की नकल करने के करीब एक महत्वपूर्ण कदम लाता है और स्वतंत्र रूप से शामिल करके, हटाकर और ट्यूनिंग करके एक विस्तृत चरण स्थान में अपने गुणों को प्रोग्राम करने की अनूठी क्षमता प्रदान करता है। इसके अलावा, इस बहुमुखी प्रणाली के सभी घटक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं (सामग्री की तालिका देखें), रॉस लैब में शुद्ध किए गए किन्सिन डिमर को छोड़कर, जैसा कि पहले50 में वर्णित है, और अनुरोध पर उपलब्ध है। अंत में, सभी विश्लेषण कोड GitHub49 के माध्यम से स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है और मुफ्त प्रोग्रामिंग भाषाओं और सॉफ्टवेयर (पायथन और फिजी) पर आधारित है। इन प्रणालियों को डिजाइन करने के लिए प्रोटोकॉल का पारदर्शी प्रसार उम्मीद है कि इस मंच को विभिन्न विशेषज्ञता, पृष्ठभूमि, संस्थागत संबद्धता और अनुसंधान लक्ष्यों के साथ उपयोगकर्ताओं के विविध समूह के लिए अधिक सुलभ बना देगा।
The authors have nothing to disclose.
हम डेटा विश्लेषण के साथ सहायता के लिए माया हेंडिजा और डॉ जोनाथन मिशेल को और सहायक चर्चाओं और मार्गदर्शन के लिए डॉ जेनेट शेउंग, डॉ मौमिता दास और डॉ माइकल रस्ट को स्वीकार करते हैं। इस शोध को आरएमआरए और जेएलआर को दिए गए विलियम एम. केक फाउंडेशन रिसर्च ग्रांट और एनएसएफ डीएमआरईएफ अवार्ड (डीएमआर 2119663) और आरएमआर-ए और आरजेएम को दिए गए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ आर 15 ग्रांट्स (आर15जीएम123420, 2आर15जीएम123420-02) द्वारा समर्थित किया गया था।
(-)-Blebbistatin Abbreviation used in paper: blebbistatin |
Sigma Aldrich | B0560 | Stock Concentration: 200 μM in DMSO Storage: dessicated, in DMSO, -20ºC Stock and Experiment Recipes: dissolve 1 mg of powder to 200 μM in DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: limited shelf-life, typically stops functioning reliably after 3-4 months. purchase and prepare new solution every 3 months. |
1:20 488-tubulin:tubulin mixture Abbreviation used in paper: 5-488-tubulin |
NA | NA | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and 488-tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
1:20 R-tubulin:tubulin mixture Abbreviation used in paper: 5-R-tubulin |
NA | NA | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and rhodamine tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
actin (biotin): skeletal muscle Abbreviation used in paper: biotin-actin |
Cytoskeleton | AB07 | Stock Concentration: 1 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: (1) immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM, (2) once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC for up to 1 week |
actin (rhodamine): rabbit skeletal muscle Abbreviation used in paper: R-actin |
Cytoskeleton | AR05 | Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week |
adenosine triphosphate Abbreviation used in paper: ATP |
Thermo Fisher Scientific | A1048 | Stock Concentration: 100 mM Storage: in solution (pH 7), -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconsitute in DI H20, bring pH to 7 with NaOH Storage, Handling, Troubleshooting Notes: routinely check pH and adjust as needed, hydrolyzes over time, replace every ~6-12 months |
AlexaFluor488 Phalloidin Abbreviation used in paper: 488-phalloidin |
Thermo Fisher Scientific | A12379 | Stock Concentration: 100 μM DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 20 μM in PEM (1 μL in 4 μL PEM) |
AlexaFluor488–labeled actin Abbreviation used in paper: 488-actin |
Thermo Fisher Scientific | A12373 | Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: this item has been discontinued |
Basic Plasma Cleaner Abbreviation used in paper: plasma cleaner |
Harrick Plasma | PDC-32G | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Abbreviation used in paper: transparent film |
Thermo Fisher Scientific | 13-374-5 | |
D-(+)-Glucose Abbreviation used in paper: |
Thermo Fisher Scientific | A1682836 | Stock Concentration: 100x Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 4.5 mg/ml in DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should 45 μg/mL |
D-Biotin Abbreviation used in paper: biotin |
Fisher Scientific | BP232-1 | Stock Concentration: 1.02 mM in PEM Storage: dessicated, 4ºC |
deionized nanopure water Abbreviation used in paper: DI |
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Dimethyldichlorosilane Abbreviation used in paper: silane |
Thermo Fisher Scientific | D/3820/PB05 | Stock Concentration: 2% dissolved in Toulene |
Dithiothreitol Abbreviation used in paper: DTT |
Thermo Fisher Scientific | R0861 | Stock Concentration: 1 M in DMSO Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: dilute to 2 mM in PEM immediately before each experiment |
DMSO Anhydrous Abbreviation used in paper: DMSO |
Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
F-Buffer Abbreviation used in paper: F-buffer |
NA | NA | Stock Concentration: 10x Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: 10 mM Imidazole (pH 7.0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.2 mM ATP |
G-Buffer Abbreviation used in paper: G-buffer |
NA | NA | Stock Concentration: 10x Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: 2.0 mM Tris (pH 8), 0.2 mM ATP, 0.5 mM DTT, 0.1 mM CaCl2. Store at -20°C. |
glass microscope slide Abbreviation used in paper: slide |
Thermo Fisher Scientific | 22-310397 | |
Glucose oxidase + catalase + β-mercaptoethanol Abbreviation used in paper: GOC |
Sigma Aldrich | G2133-250KU, C1345, 63689 | Stock Concentration: 100x Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC Stock and Experiment Recipes: For 100x: 4.3 mg/ml glucose oxidase, 0.7 mg/ml catalase, 0.5% v/v β-mercaptoethanol in DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should be: 0.005% β-mercaptoethanol, 43 μg/mL glucose oxidase, 7 μg/mL catalase |
glu-GOC oxygen scavenging system Abbreviation used in paper: glu-GOC |
NA | NA | Stock Concentration: 100x Storage: prepare fresh each time Stock and Experiment Recipes: mix equal parts Glu and GOC and add at 1/100 final sample volume immediately before imaging Storage, Handling, Troubleshooting Notes: prepare from Glu and GOC immediately before imaging |
Guanosine triphosphate Abbreviation used in paper: GTP |
Thermo Fisher Scientific | R0461 | Stock Concentration: 100 mM Storage: 100 μL aliquots at -20ºC |
Instant Mix 1-minute epoxy Abbreviation used in paper: epoxy |
Loctite | 1366072 | |
Kinesin-1 401 BIO 6x HIS Abbreviation used in paper: kinesin |
Prepared in JL Ross Lab at Syracuse University | NA | Stock Concentration: 8.87 μM in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Storage, Handling, Troubleshooting Notes: biotinylated dimers form kinesin clusters, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
NeutrAvidin Abbreviation used in paper: NA |
Thermo Fisher Scientific | 31000 | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM |
No 1. glass coverslips (24 mm x 24 mm) Abbreviation used in paper: coverslip |
Thermo Fisher Scientific | 12-548-CP | |
Paclitaxel Abbreviation used in paper: Taxol |
Thermo Fisher Scientific | P3456 | Stock Concentration: 2 mM in DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 200 μM in DMSO (0.4 μL in 3.6 μL DMSO) |
PEM-100 Abbreviation used in paper: PEM |
NA | NA | Stock Concentration: 1x Storage: room temperature (RT) Stock and Experiment Recipes: 100 mM K-PIPES (pH 6.8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: use KOH to adjust pH to 6.8, recheck pH often and adjust accordingly |
phalloidin Abbreviation used in paper: phalloidin |
Thermo Fisher Scientific | P3457 | Stock Concentration: 100 μM in DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC, adhere closely to storage/handling conditions Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: susceptible to impurities in its preparation and denaturing, identifiable as large amorphous aggregates of actin in samples |
porcine brain tubulin Abbreviation used in paper: tubulin |
Cytoskeleton | T240 | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
Potassium Chloride Abbreviation used in paper: KCl |
Thermo Fisher Scientific | AM9640G | Stock Concentration: 4 M Storage: RT |
Rabbit skeletal actin Abbreviation used in paper: actin |
Cytoskeleton | AKL99 | Stock Concentration: 2 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week |
Rabbit skeletal myosin II Abbreviation used in paper: myosin |
Cytoskeleton | MY02 | Stock Concentration: 10 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 10 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: monomers form minifilaments at low KCl, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
Tubulin (biotin): porcine brain Abbreviation used in paper: biotin-tubulin |
Cytoskeleton | T333P | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM |
Tubulin (fluorescent HiLyte 488): porcine brain Abbreviation used in paper: 488-tubulin |
Cytoskeleton | TL488M | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
tubulin (rhodamine): porcine brain Abbreviation used in paper: R-tubulin |
Cytoskeleton | TL590M | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
Tween 20 Abbreviation used in paper: Tween20 |
Thermo Fisher Scientific | J20605.AP | Stock Concentration: 1% v/v in DI H20 Storage: RT |
ultracentrifuge grade microtubes Abbreviation used in paper: Beckman-Coulter Optima Max XP |
Beckman Coultier | 343776 | Storage, Handling, Troubleshooting Notes: 8×34 mm PC |
UV light curing glue Abbreviation used in paper: UV glue |
Pharda | SKG-2869 |