Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rekonstituera och karakterisera aktin-mikrotubulikompositer med avstämbar motordriven dynamik och mekanik

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64228
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1, 1
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College, 3Department of Physics, Syracuse University

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta dokument presenterar protokoll för konstruktion och karakterisering av avstämbara tredimensionella kompositnätverk av samintrasslade aktinfilament och mikrotubuli. Kompositer genomgår aktiv omstrukturering och ballistisk rörelse, driven av myosin II- och kinesinmotorer, och stäms av de relativa koncentrationerna av aktin, mikrotubuli, motorproteiner och passiva tvärbindare.

Abstract

Den sammansatta cytoskeletten, som består av interagerande nätverk av semiflexibla aktinfilament och styva mikrotubuli, omstrukturerar och genererar krafter med hjälp av motorproteiner såsom myosin II och kinesin för att driva viktiga processer såsom migration, cytokinese, vidhäftning och mekanosensering. Medan aktin-mikrotubuliinteraktioner är nyckeln till cytoskelettens mångsidighet och anpassningsförmåga, är en förståelse för deras samspel med myosin- och kinesinaktivitet fortfarande framväxande. Detta arbete beskriver hur man konstruerar avstämbara tredimensionella kompositnätverk av samintrasslade aktinfilament och mikrotubuli som genomgår aktiv omstrukturering och ballistisk rörelse, driven av myosin II och kinesinmotorer, och är inställda av de relativa koncentrationerna av aktin, mikrotubuli, motorproteiner och passiva tvärbindare. Protokoll för fluorescensmärkning av mikrotubuli och aktinfilament för att mest effektivt visualisera sammansatt omstrukturering och rörelse med hjälp av multispektral konfokal avbildning är också detaljerade. Slutligen presenteras resultaten av dataanalysmetoder som kan användas för att kvantitativt karakterisera icke-jämviktsstruktur, dynamik och mekanik. Att återskapa och undersöka denna avstämbara biomimetiska plattform ger värdefull insikt i hur kopplad motorisk aktivitet, kompositmekanik och filamentdynamik kan leda till otaliga cellulära processer från mitos till polarisering till mekano-sensation.

Introduction

Cytoskeletten är ett dynamiskt kompositnätverk av interagerande biopolymerer som ger strukturellt och mekaniskt stöd till celler. Associerade molekylära motorer och bindande proteiner omstrukturerar och anpassar cytoskeletten för att tillåta celler att växa, ändra form, stelna, röra sig och till och med självläka, vilket möjliggör otaliga cellulära processer som sträcker sig från migration och delning till mekanosens 1,2. Utöver dess betydelse i cellulär biofysik är cytoskelettet också ett typiskt exempel på aktiv materia med potentiella materialapplikationer som sträcker sig från sårläkning och läkemedelsleverans till filtrering och mjuk robotik 1,3,4,5,6,7,8,9.

De två viktigaste egenskaperna som ger cytoskeletten dess unika strukturella och mekaniska mångfald och multifunktionalitet är: 1) dess sammansatta natur, bestående av flera interagerande proteinfilament, såsom halvflexibla aktinfilament och styva mikrotubuli, samt deras associerade bindande och tvärbindande proteiner 3,5,10; och 2) dess förmåga att kontinuerligt omstrukturera, flytta, grova och utföra arbete via energiförbrukande motorer, såsom myosiner och kinesiner, trycka och dra på de trådformiga proteinerna 1,7,11,12,13. Även om denna eleganta komplexitet gör det möjligt för cytoskeletten att förmedla processer så olika som cellmotilitet, cytokinese och sårläkning 3,6,7,11, hämmar det forskarnas förmåga att reproducera cytoskelettens signatur in vivo-egenskaper i rekonstituerade in vitro-system.

Nuvarande gränsrekonstitueringsinsatser fokuserar på kompositer av intrasslade och tvärbundna aktinfilament och mikrotubuli 3,10,14,15,16,17, kraftgenererande aktomyosinnätverk2,8,18,19,20,21 och aktiv nematik driven av kinesin-mikrotubuli interaktioner22,23,24,25,26. Steady-state aktin-mikrotubulikompositer har visat sig uppvisa emergenta mekaniska egenskaper15,16,27, såsom förbättrad filamentrörlighet och ökad styvhet jämfört med enkomponentsystem 27. Studier på in vitro-aktomyosinsystem har rapporterat ett brett spektrum av strukturella och dynamiska egenskaper som beror på koncentrationerna av aktin, myosin och tvärbindare28,29,30,31. Till exempel, med tillräcklig tvärbindning, genomgår aktomyosinnätverk storskalig sammandragning och grov 2,28,30,32,33,34,35,36, medan utan tvärbindare visar nätverk snabbt, destabiliserande flöde och brott 19,29 . Rekonstituerade mikrotubulibaserade aktiva nematik som använder kluster av kinesinmotorer för att tvärbinda och dra i mikrotubulibuntar har rapporterats uppvisa långvariga turbulenta flöden, förlängning, buckling, sprickbildning och läkning 12,22,23,24,25,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47.

På senare tid har aktin-mikrotubulikompositer drivna av myosin II-minifilament visat sig leda till mer ordnad sammandragning och nätverksintegritet jämfört med det oordnade flödet och nätverksbrottet som aktomyosinnätverk utan tvärbindare uppvisar 17,26,48. Dessutom optimeras kombinationen av sammansatt robusthet och kraftgenerering när aktin och mikrotubuli är närvarande vid jämförbara koncentrationer. Viktiga framväxande funktioner i denna region av formuleringsutrymme inkluderar förbättrad mekanisk styrka 26, samordnad rörelse av aktin och mikrotubuli26, stadig ihållande sammandragning och mesoskala omstrukturering17.

Här beskrivs protokoll för att konstruera och ställa in samtrasslade och tvärbundna kompositer av mikrotubuli och aktinfilament som skjuts ut ur jämvikt av myosin II minifilament och kinesinkluster som verkar på aktinfilament respektive mikrotubuli (figur 1). Dynamiken, strukturen och mekaniken i denna klass av kompositer kan ställas in av de relativa koncentrationerna av filament, motorer och tvärbindare för att uppvisa ett rikt fasutrymme av advektivt och turbulent flöde, isotrop sammandragning, acceleration, retardation, avblandning, förstyvning, avslappning och bristning. Fokus för detta arbete ligger på att förbereda och ställa in denna klass av aktiva cytoskelettkompositer. Men för att hjälpa forskare att jämföra och karakterisera de beskrivna aktiva kompositerna beskrivs också effektiva avbildningsmetoder som använder multispektral konfokalmikroskopi. Slutligen presenteras resultat av viktiga beräkningsanalysmetoder som kan användas för att mäta kompositernas dynamik, struktur och mekanik. Forskare uppmuntras att anta dessa metoder - som inkluderar differentiell dynamisk mikroskopi (DDM), rumslig bildautokorrelation (SIA) och partikelbildsvelocimetri (PIV) - eftersom de har optimerats för att karakterisera den komplexa dynamiken och strukturella mångfalden hos kompositerna 17,26,49.

Stegen som beskrivs nedan fokuserar på att förbereda kompositerna och avbilda dem med konfokalmikroskopi. Protokoll som beskriver dataanalys efter förvärv och optiska pincettmätningar finns i tidigare verk 17,26,48,50 och tillhandahålls på begäran. Allt material är listat i materialförteckningen som tillhandahålls.

Protocol

1. Förbered silaniserade täckglas och mikroskopglas för att förhindra adsorption av proteiner till kammarytor

OBS: Detta är en 2-dagars process. Silaniserade bilder kan beredas upp till 1 månad före användning.

  1. Placera täckglas nr 1 (24 mm x 24 mm) och mikroskopglas (1 tum x 3 tum) i ett särskilt ställ som passar i plasmarengöraren. Placera galler i plasmarengörare och kör i 20 minuter.
  2. Överför täckglas och glidbanor till ett nytt ställ som endast är avsett för användning med silan och placera galler i glasbehållaren för att rengöra glasögonen enligt beskrivningen nedan.
    1. Sänk ner täckglas och glidbanor i 100% aceton i 1 h. Sänk ner täckglas och glidbanor i 100% etanol i 10 min.
    2. Sänk ner täckglas och rutschkanor i avjoniserat vatten (DI) i 5 minuter. Upprepa rengöringsstegen ytterligare två gånger.
    3. Sänk ner täckglas och rutschkanor i nyberedda 0,1 M KOH i 15 min. Sänk ner täckglas och diabilder i färsk DI i 5 min. Upprepa detta steg två gånger till.
  3. Lufttorkade täckglas och glidbanor i 10 min. Behandla rengjorda täckglas och glidbanor med silan för att producera hydrofoba ytor enligt beskrivningen nedan.
    OBS: Utför följande steg i en dragskåp.
    1. Sänk ner torkade täckglas och diabilder i 2% silan (upplöst i toluen) i 5 minuter. Använd en tratt för att hälla tillbaka silan i den avsedda flaskan för att återanvända upp till fem gånger.
    2. Sänk ner täckglas och glidbanor i 100% etanol i 5 min. Byt ut etanol mot färsk etanol. Sänk ner täckglas och rutschkanor i 5 minuter.
    3. Sänk ner täckglas och diabilder i färsk DI i 5 min. Upprepa etanol- och DI-tvättsteget ytterligare två gånger med färsk etanol och DI varje gång. Lufttorkade täckglas och glidbanor i 10 min.

2. Förbereda aktiv aktin-mikrotubulikomposit som drivs av myosinminifilament

  1. Ta bort inaktivt myosin via aktinfilamentbindning och utför pull-down via ultracentrifugering enligt beskrivningen nedan.
    1. Polymerisera aktin till filament. Använd en precisionsmikropipett och sterila pipettspetsar, kombinera i ett mikrocentrifugrör: 1,87 μL DI, 1,3 μL 10x G-buffert, 1,3 μL 10x F-buffert, 1,63 μL 4 M KCl, 4,53 μL aktin (47,6 μM) och 1,08 μL 100 μM falloidin.
      OBS: För att säkerställa tillräcklig polymerisation bör aktinkoncentrationen och aktin:falloidinmolförhållandet vara 18,4 μM respektive 2:1.
    2. Rör försiktigt lösningen upp och ner för att blanda och lägg sedan på is i mörkret i ≥1 h. Kyl ultracentrifugen till 4 °C. Ta bort myosinalikvoten från -80 °C och lägg på is.
      OBS: Slutför steg 2.2 vid denna punkt medan aktin polymeriseras.
    3. Efter ≥1 h aktinpolymerisation, tillsätt 1,3 μL 10 mM ATP och 2 μL 19 μM myosin till det polymeriserade aktinet.
      OBS: Det molära förhållandet aktin: myosin bör vara >5 för att säkerställa tillräcklig borttagning av inaktiva myosinmotorer (dvs. döda huvuden).
    4. Rör försiktigt lösningen upp och ner för att blanda. Överför till ett rör av ultracentrifugkvalitet.
      Centrifugera vid 4 °C och 121 968 x g i 30 minuter.
  2. Förbered ett sammansatt sammansatt nätverk av aktinfilament och mikrotubuli enligt beskrivningen nedan.
    OBS: Börja 30 min före myosinavknoppning (steg 2.1.4).
    1. Ställ in ett värmeblock på 37 °C. Använd en precisionsmikropipett och sterila pipettspetsar för att lägga till följande i ett mikrocentrifugrör: 13,9 μL PEM, 3 μL 1% Tween20, 1,55 μL 47,6 μM aktin, 0,36 μL 34,8 μM R-aktin, 0,3 μL 250 mM ATP, 0,87 μL 100 μM falloidin, 1,91 μL 5-488-tubulin, 0,3 μL 100 mM GTP, och 0,75 μL 200 μM Taxol, till en total volym av 23 μl.
      OBS: Koncentrationerna av aktin och tubulin som anges är för en komposit med 2,9 μM aktin och 2,9 μM tubulin. Total proteinkoncentration är c = c A + c T = 5,8 μM och molär aktinfraktion är cA / (c A + cT) = Φ A = 0,5. Se steg 2.5 för att justera dessa värden.
    2. Rör försiktigt lösningen upp och ner för att blanda och placera den på ett 37 °C värmeblock skyddat från ljus i 1 timme.
  3. Förbered provkamrarna för konfokala avbildningsexperiment enligt beskrivningen nedan.
    OBS: Slutför steg 2.1.4 och 2.2.2 under väntetider.
    1. Placera två silaniserade glidbanor sida vid sida på en kokplatta (avstängd), lägg två remsor termoplastisk tätningsfilm över glasrutschbanorna ~ 3 mm från varandra och placera två silaniserade täckglas över den termoplastiska tätningsfilmen för att bilda en provkammare.
    2. Vrid värmeplattan på låg inställning tills täckglasen binder fast till glidbanor med smält termoplastisk tätningsfilm (~ 1-2 min). Tryck ner med jämnt tryck för att säkerställa bindning samtidigt som ~ 100 μm avstånd mellan de två ytorna bibehålls.
    3. Ta bort kamrarna och stäng av kokplattan. Etikettkammare med (+) och (-). (+) kammaren kommer att vara för det aktiva provet (med myosin) och (-) kammaren kommer att vara kontrollen (inget myosin). Se till att varje kammare rymmer ≤ 10 μL vätska.
  4. Förbered exempel på bild enligt beskrivningen nedan.
    OBS: Det är viktigt att slutföra detta steg omedelbart efter att steg 2.1 och 2.2 har slutförts.
    1. Ta försiktigt bort myosin-aktinprovet från ultracentrifugen (steg 2.1.4) och rör omedelbart upp de översta 7,5 μl av supernatanten och överför till ett nytt mikrocentrifugrör.
    2. Ta bort aktin-mikrotubuliprovet från värmeblocket och blanda försiktigt i 1,5 μL 10x D-glukos, 1,5 μL 10x GOC och 1,5 μL 1 mM blebbistatin. Dela upp lösningen i två alikvoter på 13,7 μl och märk som (+) och (-).
    3. Blanda i 1,28 μl supernatant från steg 2.4.1 till (+) alikvot. Blanda i 1,28 μl DI till (-) alikvoten. Flöda långsamt varje lösning in i motsvarande kammare (steg 2.3) via kapillärverkan. Var försiktig så att du inte introducerar luftbubblor i kanalen.
    4. Försegla de två öppna ändarna av varje kanal med snabbtorkande epoxi eller UV-lim. Se till att limet är helt torrt innan det placeras på mikroskopet. Bild omedelbart enligt beskrivningen i steg 3.
      OBS: UV-lim är fördelaktigt eftersom det härdar nästan omedelbart vid UV-exponering. Men eftersom blebbistatin är UV-känsligt är det viktigt att endast lokalt belysa limet (vid provkammarens kanter) med en liten UV-trollstav för att undvika att inaktivera blebbistatinet.
  5. Valfritt: variera proteinkoncentrationerna för att ställa in dynamiken och strukturen hos kompositerna.
    OBS: Följande steg föreslås ändringar av stegen ovan för att variera koncentrationerna av aktin, mikrotubuli och myosin om så önskas.
    1. Följ stegen som beskrivs ovan med undantag för följande ändringar i steg 2.2.1 och 2.4.3.
    2. För att variera koncentrationerna av aktin och mikrotubuli och därigenom justera c och ΦA, öka eller minska volymen aktin, R-aktin och 5-488-tubulin som används i steg 2.2.1, som önskat26. När du varierar aktinkoncentrationen, justera R-aktin och falloidin molära koncentrationer proportionellt för att upprätthålla samma molära förhållanden med aktin. Justera volymen PEM så att blandningens slutliga volym förblir 23 μl. Alla andra komponentvolymer och koncentrationer förblir desamma.
    3. För att variera myosinkoncentrationen, justera volymen myosin som tillsätts till (+) alikvoten i steg 2.4.3 efter önskemål. Justera DI-volymen som läggs till i (-) alikvoten i enlighet med detta. Justera PEM-volymen i steg 2.2.1 för att ta hänsyn till ökningen eller minskningen av myosin (+) och DI (-) volymen, så att den slutliga volymen för varje prov ((+) och (-)) är 14,98 μl.

3. Avbildning och karakterisering av aktiva kompositer med konfokalmikroskopi

  1. För att avbilda aktomyosin-mikrotubulikompositer framställda i steg 2, använd ett laserskanningskonfokalmikroskop (LSCM) eller liknande mikroskop med ett 60x 1,4 NA oljedoppningsmål. För att samtidigt visualisera aktinfilament och mikrotubuli i separata fluorescenskanaler, använd en 561 nm laser med 565/591 nm excitations-/emissionsfilter och en 488 nm laser med 488/525 nm excitations-/emissionsfilter.
  2. Placera provkammaren på mikroskopet så att kontrollkanalen placeras direkt över målet. Se till att det finns ett oljegränssnitt mellan målet och täckglaset.
  3. Använd scenkontrollerna för att sätta kontrollkompositen i fokus och hitta sedan båda ytorna på provkammaren. Flytta z-positionen till mitten av provkammaren. Kontrollera om det finns tydliga trådformiga nätverk enligt figur 2.
  4. Visualisera fortfarande kontrollkammaren, justera intensiteten hos varje laser för att möjliggöra samtidig visualisering av aktinfilament och mikrotubuli. Behåll lägsta möjliga laserintensitet för att förhindra fotoblekning (vanligare i aktinkanalen) och blöda igenom (vanligtvis från mikrotubuli till aktinkanalen).
  5. För att karakterisera det inaktiva kontrollprovet, samla in tre tidsserier (videor) med 256 x 256 kvadratpixlar (213 μm x 213 μm) bilder vid 2,65 fps för totalt ≥1000 bilder. Samla varje tidsserie i ett annat område i provkammaren åtskilda av ≥500 μm. Se till att det finns minimal detekterbar rörelse och inget flöde eller omstrukturering.
  6. Stäng av lasern på 488 nm och använd scenkontrollerna för att flytta till (+) kammaren.
  7. Använd 568 nm-lasern för att visualisera mikrotubuli i (+) kanalen för att säkerställa korrekt nätverksbildning (figur 2) och identifiera provkammarens axiella centrum (som kan skilja sig från kontrollkammarens centrala z-läge).
  8. Slå på 488 nm lasern och upprepa steg 3.5 ovan med följande ändringar. Samla in tidsserier i upp till 45 minuter och stoppa förvärvet när provet antingen rör sig utanför synfältet, brister eller fotobleker. Spela in 5-10 tidsserier och håll reda på den tid då varje tidsserie börjar i förhållande till början av den första tidsserien.
  9. Analysera data med DDM, SIA och PIV enligt beskrivningen i figur 3, figur 4, figur 5 och tidigare17,48,50,51.
    OBS: 488 nm-lasern aktiverar lokalt myosin ATPas-aktivitet genom att avaktivera blebbistatin, så den bör endast slås på i början av datainsamlingen så att t = 0 är i början av tidsserien. Dessa förvärvsparametrar är optimerade för DDM-analys (differential dynamic microscopy) som gjorts tidigare26.

4. Framställning av aktiva aktin-mikrotubulikompositer drivna av kinesinmotorer

OBS: Följande steg skapar aktin-mikrotubulikompositer som drivs ur jämvikt av kinesinmotorer eller en kombination av kinesin och myosin50.

  1. Förbered kinesin- och myosinmotorer enligt beskrivningen nedan.
    1. Om myosin ingår, följ steg 2.1.
    2. För att bilda kinesinmotorkluster som binder och utövar krafter mellan par mikrotubuli, använd en mikropipett och sterila pipettspetsar för att lägga till följande till ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör: 1,16 μL PEM, 2,74 μL 8,87 μM kinesindimerer, 7,29 μL 83,3 μM NeutrAvidin, 0,81 μL 2mM DTT . Blanda försiktigt genom att pipettera lösningen upp och ner och inkubera skyddat från ljus (använd ett svart mikrocentrifugrör eller linda in i folie) i 30 minuter vid 4 °C.
      OBS: Det molära förhållandet mellan kinesindimerer och NA är 1:25.
  2. Följ steg 2.3 för att förbereda provkammare och gör tre kamrar istället för två. Utför detta steg under kinesinkubation (steg 4.1.2) och myosinultracentrifugering (steg 4.1.1).
  3. Förbered co-intrasslat kompositnätverk av aktinfilament och mikrotubuli.
    1. Ställ in värmeblocket på 37 °C. Använd en mikropipett och sterila pipettspetsar för att lägga till följande till ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör: 3,21 μL PEM, 4,5 μL 1% Tween20, 2,18 μL 47,6 μM aktin, 3,46 μL 5-R-tubulin, 4,5 μL 100 mM ATP, 4,5 μL 10 mM GTP, 1,13 μL 200 μM Taxol och 1,57 μL 20 μM 488-phalloidin. Se till att den totala volymen är 25 μl.
    2. Rör försiktigt lösningen upp och ner för att blanda och placera på 37 °C värmeblock som är skyddat från ljus i 1 timme. Ta bort röret från värmeblocket och använd en mikropipett för att försiktigt blanda i 0,84 μL 100 μM falloidin. Inkubera i 5-10 min vid rumstemperatur, skyddad mot ljus.
      OBS: Att lägga till falloidin i detta steg, snarare än i steg 4.3.1, förbättrar fluorescensmärkningen av aktinfilament, eftersom 488-phalloidin inte behöver konkurrera med omärkt falloidin för aktinbindningsställen.
  4. Förbered aktiva kompositer för konfokal avbildning.
    1. Tillsätt 1,13 μl 200 μM blebbistatin, 1,35 μL 10x Glu och 1,35 μL 10x GOC till lösningen från steg 4.3.2 och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner. Dela upp lösningen i tre alikvoter på 10 μl och märk som (K), (K+M) och (-).
    2. Blanda i 2,54 μl myosin från steg 2.1.4 till alikvoten (K+M). Blanda i 2,54 μl PEM till (K) och (-) alikvoter.
    3. Använd en mikropipett och sterila pipettspetsar för att tillsätta 2,5 μL kinesinkluster från steg 4.1.2 till (K) och (K+M) alikvoter. Pipett upp och ner för att blanda. Blanda i 2,5 μL PEM till (-) med samma teknik.
      OBS: Koncentrationerna av aktin och tubulin som anges är för en komposit med 2,32 μM aktin och 3,48 μM tubulin. Total proteinkoncentration är c = c A + c T = 5,8 μM och molär aktinfraktion är cA / (c A + cT) = Φ A = 0,4. Kinesin- och myosinkoncentrationerna är 0,35 μM respektive 0,47 μM. Se steg 2.5 för allmänna riktlinjer för att justera c A, cT, c och ΦA.
    4. Använd en mikropipett och strömma långsamt varje lösning in i motsvarande kanal i de beredda provkamrarna (steg 4.2) via kapillärverkan. Tryck ner mycket långsamt och försiktigt på pipetten för att inte införa luftbubblor i kanalen.
    5. Försegla de två öppna ändarna av varje kanal med snabbtorkande epoxi eller UV-härdbart lim. Se till att limet är helt torrt innan det placeras på mikroskopet.
      OBS: Det är viktigt att detta steg görs snabbt för att minimera tiden som kinesinet agerar utan att övervakas. Av denna anledning rekommenderas epoxi som härdar på 1 min (snarare än 5 eller 10 min). UV-härdbart lim är fördelaktigt i detta avseende eftersom det härdar nästan omedelbart vid UV-exponering.
  5. Bildberedda prover omedelbart, efter steg 3, med undantag för följande viktiga ändringar. Eftersom kinesin inte styrs av ljusaktivering börjar det fungera omedelbart efter steg 4.4.3, så markera den här gången som t = 0. För att avbilda kompositen så nära det ursprungliga inaktiva tillståndet (t = 0) som möjligt, avbilda kanalerna (K) och (K + M) först och notera den tid som gått mellan steg 4.4.3 och början av datainsamlingen (steg 3.8). I praktiken är denna förflutna tid ~ 5 min.

5. Integrering av passiva tvärbindare i aktiva kompositer

OBS: Dessa steg beskriver hur man använder biotinylerade aktin- och tubulinunderenheter och NeutrAvidin (NA) för att passivt tvärbinda aktin till aktin (A-A) eller mikrotubuli till mikrotubuli (M-M) i de aktiva kompositer som beskrivs i steg 4.

  1. Förbered A-A- eller M-M-tvärbindningskomplex med biotinylerade proteiner (biotin-aktin eller biotin-tubulin), NA och biotin i förhållandet 2:2:1 biotin-aktin/tubulin:biotin:NA. Starta den här processen före steg 4 .
    1. För A-A-tvärbindare, använd en mikropipett och sterila pipettspetsar för att tillsätta 2 μL 11,6 μM biotin-aktin, 1,39 μL 8,33 μM NA, 2,27 μL 1,02 μM biotin och 4,34 μL PEM till ett mikrocentrifugrör. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner.
    2. För M-M-tvärbindare, använd en mikropipett och sterila pipettspetsar för att tillsätta 1,86 μL 4,55 μM biotin-tubulin, 1,11 μL 8,33 μM NA, 1,82 μL 1,02 μM biotin och 5,21 μL PEM till ett mikrocentrifugrör. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner.
    3. Förpacka rören eller rören från steg 5.1.1 och/eller 5.1.2 i termoplastisk tätningsfilm för att skapa en vattentät tätning. Placera i en flotationsflotte i ett temperaturkontrollerat ljuddämparbad som är inställt på 4 °C.
    4. Sonicate i 90 min vid 4 °C. I praktiken är det bäst att sätta sonicator i ett kallt rum och lägga till ispaket till ultraljudsbehandling badet för att bibehålla låg temperatur.
  2. För att införliva tvärbindningskomplex i prover för avbildning, följ steg 4.3 och ändra steg 4.3.1 enligt beskrivningen nedan för A-A-tvärbindning (steg 5.2.1) eller M-M-tvärbindning (steg 5.2.2).
    1. För A-A-tvärbindning, kombinera följande i ett mikrocentrifugrör: 1,94 μL PEM, 4,50 μL 1% Tween20, 2,18 μL 47,6 μM aktin, 3,46 μL 45,5 μM 5-R-tubulin, 1,13 μL A-tvärbindare (steg 5.1.1), 4,50 μL 100 mM ATP, 4,50 μL 10 mM GTP, 1,13 μL 200 μM Taxol, och 1,57 μL 20 μM 488-falloidin. Se till att den totala volymen är 25 μl.
    2. För M-M-tvärbindning, kombinera följande i ett mikrocentrifugrör: 1,97 μL PEM, 4,50 μL 1% Tween20, 2,18 μL 47,6 μM aktin, 3,76 μL 45,5 μM 5-R-tubulin, 1,13 μL 1:4 utspädning av M-M tvärbindare (steg 5.1.2), 4,50 μL av 100 mM ATP, 4,50 μL av 10 mM GTP, 1,13 μL av 200 μM Taxol, och 1,57 μL 20 μM 488-falloidin. Se till att den totala volymen är 25 μl.
  3. Följ steg 4.3.2-4.5 med de specifika koncentrationerna för ett tvärbindare: aktinmolförhållande av RA = 0,02 och tvärbindare: tubulin molärt förhållande av RT = 0,005. Dessa R A- och R T-värden resulterar i liknande längder mellan tvärbindare längs aktinfilament och mikrotubuli (d A 60 nm och d MT 67 nm), uppskattade med d A = I monomer/2R AEquation 1, därI-monomer är längden på en aktinmonomer, och dMT Equation 1 = I-ring/26R T, därI-ringen är längden på enring med 13 tubuliner15, 17.

Representative Results

För att bestämma framgångsrik beredning av aktiva kompositer (figur 1) och för att karakterisera deras dynamik och struktur används ett laserscanningsfluorescensmikroskop med minst två fluorescenskanaler för att visualisera aktinfilamenten och mikrotubuli samtidigt (figur 2 och figur 6). Alla aktinfilament och mikrotubuli i kompositerna är glest märkta, snarare än dopning i spårämnen, som ofta görs i in vitro-studier . Denna metod säkerställer att den uppmätta dynamiken och strukturen är representativ för själva kompositen snarare än spårämnena som bildas under andra förhållanden än kompositerna. Av denna anledning kan enskilda aktinfilament och mikrotubuli vanligtvis inte lösas, snarare visar bilder mesoskala nätverksstruktur (figur 2 och figur 6).

Denna märkningsmetod optimerades för rumsliga bildautokorrelationsanalyser (SIA) och differentiell dynamisk mikroskopi (DDM) som undersöker dynamiken och strukturen i ömsesidigt Fourierrum (figur 4, figur 5 och figur 8)52,53,54,55. Partikelbildsvelocimetri (PIV) kan också användas för att avbilda och karakterisera dynamik- och flödesfält (figur 3 och figur 7), men det kräver pixelbinning (lägre rumslig upplösning) och större fördröjningstidssteg (lägre tidsupplösning) än SIA och DDM för att eliminera felaktiga vektorer som uppstår från brus i de täta lågsignalbilderna. PIV rekommenderas dock för kvalitativ undersökning av flödesfält och bekräftelse av DDM-resultat (figur 4 och figur 8)26,50.

Provkarakterisering av de beskrivna nätverken med hjälp av dessa analyser (dvs. DDM, SIA, PIV) tillhandahålls för att hjälpa forskare att anta liknande analyser för att jämföra och karakterisera sina prover. Detaljerade beskrivningar av dessa tekniker ligger dock utanför ramen för detta arbete. För detaljerade beskrivningar av hur man utför DDM på dessa och andra liknande system, inklusive användarvänlig Python-kod, se tidigare verk 17,26,49,50 och referenserna där inom. För detaljer om hur man utför SIA och PIV på de system som beskrivs här, riktas läsaren till tidigare verk17,50.

Flera kontroller, som beskrivs nedan, bör göras för att säkerställa att kompositerna fungerar som förväntat. En komposit utan myosin eller kinesin bör verka väsentligen statisk med minimala termiska fluktuationer eller drift. Aktinfilament och mikrotubuli bör se ut som sammantrasslade och homogent fördelade, med minimal buntning, aggregering eller fasseparation av aktin och mikrotubuli i ett synfält på ~200 μm x 200 μm (figur 2, längst till vänster)17. Man bör förvänta sig ett liknande resultat för kompositer som innehåller myosin men inte utsätts för 488 nm ljus (för att inaktivera blebbistatin).

Vid införlivande av myosin och exponering för 488 nm ljus genomgår kompositerna sammandragning som till stor del är isotrop och liknande för aktin och mikrotubuli, vilket ses i mikroskopbilder tagna före och efter myosinaktivitet (figur 2), liksom motsvarande PIV-flödesfält för varierande tider under aktivitet (figur 3). För att avgöra om rörelsen är ballistisk, diffusiv, subdiffusiv etc. utvärderas den karakteristiska dekorrelationstiden τ (q) bestämd från DDM som en funktion av vågvektor (dvs ömsesidigt utrymme). Se som beskrivits i detalj tidigare 17,26,49. Figur 4 visar också hur man använder DDM för att karakterisera dessa kompositer. Power-law skalning τ(q)~1/vq β, med β = 1, indikerar ballistisk rörelse med hastighet v. Som referens representerar β = 2 diffusiv dynamik med v som diffusionskoefficient. Alla aktiva kompositer uppvisar ballistisk skalning (figur 4A) med hastigheter som är inställda av koncentrationerna av aktin och myosin (figur 4B), och som kan variera i tid under aktivitet, antingen accelererande eller retarderande (figur 4C,D).

Nätverksomstrukturering och klustring, synlig i figur 2 och tydligare för högre aktin- och myosinkoncentrationer, kan karakteriseras med hjälp av SIA, som visas i figur 5 och beskrivits tidigare 17,48,50. Kortfattat kan en korrelationslängd ξ, som är ett mått på den karakteristiska storleken på funktioner i en bild, bestämmas genom att anpassa varje rumslig intensitet autokorrelationskurva g (r) till en exponentiell funktion av avståndet r mellan pixlar. Större g(r)-toppar som kvarstår längre sträckor indikerar större strukturella egenskaper (dvs. buntning, klustring av de enskilda filamenten). Som visas i figur 5 återspeglas signifikant omstrukturering och aggregering för högre aktinfraktioner och myosinkoncentrationer i ökningen av ξ över tiden.

De viskoelastiska egenskaperna och det olinjära mekaniska svaret hos de aktiva kompositerna kan också mätas med hjälp av optisk pincettmikroreologi (OTM). Protokoll och representativa resultat för dessa experiment ligger dock utanför ramen för detta arbete. Intresserade läsare hänvisas till tidigare verk48,56 som grundligt beskriver hur man utför OTM-mätningar och de förväntade resultaten.

Med hjälp av samma program med experimentella och analysverktyg som beskrivs ovan beskriver följande avsnitt hur dynamiken och strukturen förändras när kinesinmotorer och biotin-NA-tvärbindare införlivas i kompositerna (figur 6, figur 7 och figur 8). Figur 6 visar representativa konfokala bilder av kompositer som drivs av antingen endast kinesin (K) eller kinesin och myosin (K+M), med och utan passiv tvärbindning (XL) av aktinfilament eller mikrotubuli.

Att införliva kinesin i kompositer resulterar initialt i liknande dynamik och omstrukturering som myosindrivna kompositer som ses i den övre raden i figur 7 (klass 1). Dynamiken övergår dock vanligtvis till storskaligt anisotropt flöde (figur 7 mellersta raden, klass 2), acceleration och retardation (figur 7 nedre raden, klass 3). Dessa egenskaper kombineras med mesoskala klustring och aggregering efter 5-30 min (figur 6 och figur 8B). PIV-genererade flödesfält och tidsmässiga färgkartor som visas i figur 7 visar exempel på isotrop omstrukturering (klass 1, övre panelen), riktat flöde (klass 2, mittpaneler) och dubbelriktad acceleration (klass 3, nedre paneler).

Aktinets och mikrotubulins hastigheter vid olika tidpunkter under aktiviteten, bestämda via kurvor för τ(q), illustrerar acceleration följt av retardation (figur 8), som är beroende av tvärbindning. Som också visas i figur 8, när båda motorproteinerna införlivas, är dynamiken faktiskt långsammare än kinesinkompositer, och det finns fördröjd början av mesoskalaflödet. Myosin stöder också mer homogen interpenetration av aktin- och mikrotubulinätverk under hela aktivitetsperioden, liksom mindre aggregering och omstrukturering. Dessa effekter kan ses på bilderna i figur 6 och kvantifieras av de tidsvarierande korrelationslängder som beräknas via SIA, som i allmänhet är mindre i närvaro av myosin (figur 8B).

Figure 1
Figur 1. Design och karakterisering av aktiva aktin-mikrotubulikompositer med flera kraftgenererande motorer och passiva tvärbindare. (A) Aktinmonomerer och tubulindimerer sampolymeriseras vid molära koncentrationer c Aoch c T på 0,73-11,6 μM och molära fraktioner av aktin Φ A = c A / (c A + c T) = 0, 0,25, 0,5, 0,75 och 1, för att bilda samtrasslade nätverk av aktinfilament (grön) och mikrotubuli (röd). Passiv tvärbindning uppnås med användning av NA för att länka biotinylerade aktinfilament (Actin XL) eller mikrotubuli (MT XL) vid tvärbindare: proteinmolära förhållanden av R A = 0,01-0,08 och RMT = 0,001-0,01 för aktin respektive mikrotubuli. Myosin-II minifilament (lila) och kinesinkluster (orange), vid koncentrationer av c M = 0,12 - 0,48 μM och cK = 0,2 - 0,7 μM, tryck och dra i filamenten för att driva kompositerna ur stabilt tillstånd. (B) Schematisk formuleringsutrymme. Myosin II minifilament (M), kinesinkluster (K) eller båda motorerna (K + M) ingår i kompositer utan passiva tvärbindare (No XL), aktin-aktin-tvärbindningar (Actin XL) och mikrotubuli-mikrotubuli-tvärbindningar (MT XL). Alla tecknade serier är inte ritade i skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Tvåfärgad konfokal avbildning av myosindrivna cytoskelettkompositer med varierande myosinkoncentrationer cM och molära aktinfraktioner ΦA. (A) 256 x 128 kvadratpixlar (212 x 106 μm2) tvåfärgade konfokalmikroskopibilder visar hur kompositer av aktinfilament (gröna) och mikrotubuli (röda) omarrangeras via myosinmotorisk aktivitet. Inga kinesinmotorer eller passiva tvärbindare finns. I varje panel visas bilder tagna i början (vänster, före) och slutet (höger, efter) av 45 min myosinaktivering (via belysning med 488 nm ljus för att inaktivera blebbistatin). Paneler beställs genom att öka molär koncentration av myosin (cM), gå från vänster till höger och öka molär fraktion av aktin (ΦA), från topp till botten. Färgerna som beskriver varje panel matchar färgkodningen som används i bild 4 och bild 5. Skalstänger är 50 μM. För att på bästa sätt fånga dynamik och struktur för analys använder vi bildhastigheter på 1-5 fps, ROI med 50-250 μm sidor och tidsserielängder på 5-45 min, beroende på graden av sammandragning och omläggning. Paneler där före- och efterbilderna ser lika ut indikerar minimal omstrukturering, vilket ses i de rosa, magenta och cyanpanelerna. Småskalig klustring, som framgår av ökad heterogenitet och närvaron av ljusa punkterade funktioner, kan ses i de orange, gröna och röda panelerna. Storskalig sammandragning, som ses som ett jämnt krympande nätverk, är tydligt i de blå och lila panelerna. Denna siffra har ändrats från referens17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Partikelbildsvelocimetri (PIV) visar att aktomyosinaktivitet utlöser koordinerad kontraktil dynamik av aktin och mikrotubuli i samintrasslade kompositer. PIV-flödesfält för aktin (övre raden) och mikrotubuli (nedre raden) i en myosindriven komposit med (ΦA, cM) = (0,5, 0,24) vid ökande tider under en 6 minuters tidsserie. Flödesfält genererades med Fiji/ImageJ PIV-plugin med en fördröjningstid på 20 s och 2 pixlar x 2 pixel binning. Både aktin och mikrotubuli visar konsekvent rörelse riktad mot mittområdet av synfältet under hela filmens varaktighet. Skalstreck i alla bilder är 50 μm. Olika pilfärger motsvarar olika hastigheter som anges i färgskalan till höger om vektorfält. Denna siffra har ändrats från referens26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Tidsupplöst differentiell dynamisk mikroskopi (DDM) mäter hastigheten och typen av rörelse av aktin och mikrotubuli i aktiva kompositer. (A) DDM utförs på mikrotubuli (övre, öppna symboler) och aktin (botten, fyllda symboler) kanaler i tidsserier för att bestämma karakteristiska sönderfallstider τ vs vågnummer q för både aktin (fyllda symboler) och mikrotubuli (öppna symboler) som beskrivits tidigare17,26. Alla kurvor följer τ ~ q-1-skalning, vilket indikerar ballistisk rörelse, med hastigheter v som bestäms via passningar till τ (q) = (vq) -1. Snabbare hastigheter motsvarar mindre τ(q)-värden för en given q. Symbolfärger och former motsvarar (ΦA, cM) kombinationer som visas i B. (B) Kontraktionshastigheter v bestäms via passningar till τ(q)-kurvor som visas i A, som beräknas i genomsnitt över alla fördröjningstider under varaktigheten av varje 45 minuters tidsserie. (C) Tidsupplöst DDM (trDDM) kvantifierar hur dynamiken varierar över tid genom att utvärdera τ(q) för aktin (fyllda symboler, vänster) och mikrotubuli (öppna symboler, höger) för på varandra följande 6 minuters intervall (betecknat med olika nyanser av samma färg) under aktiveringstiden på 45 minuter. trDDM utförs för varje (ΦA, cM) kombination (betecknad med olika symboler och färger) enligt beskrivningen i förklaringen längst ner till höger. τ(q)-kurvor som visas i C följer liknande skalning och trender som de i A men visar också tidsberoende för vissa (Φ A, cM) kompositioner, framför allt för ΦA= 0,75. (D) Kontraktionshastigheter för aktinfilament (slutna symboler) och mikrotubuli (öppna symboler) bestäms från passningar till motsvarande τ(q)-kurvor. Felstaplar i alla diagram representerar standardfelet för värden över tre till fem repliker. Denna siffra har ändrats från referens17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Spatial image autocorrelation (SIA) analys kvantifierar den motordrivna omstruktureringen av aktiva cytoskeletala kompositer. (A) Autokorrelation g(r) för mikrotubuli i början (vänster, t = 0 min, mörka nyanser) och slutet (höger, t = 42 min, ljusa nyanser) av experimentet för (ΦA, cM) formuleringar som anges i förklaringen. Infälld: exempel på data till Equation 2 vid initiala och sista tiden för (ΦA, cM) = (0,75, 0,12). (B) Genomsnittliga korrelationslängder ξ för aktin (slutna symboler) och mikrotubuli (öppna symboler) för varje (Φ A, cM) bestämda via exponentiella passningar av varje g (r) kurva, som visas i insatsen i A. Data är indelade i de som uppvisar minimal (vänster) kontra betydande (höger) omstrukturering. Felstaplar i A och B representerar standardfelet i tre till fem repliker. Denna siffra har ändrats från referens17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Införliva kinesinmotorer och passiva tvärbindare i aktiva kompositer för att öka programmerbarheten och utöka fasutrymmet för dynamik och struktur. (A) Tvåfärgade konfokala bilder av aktin (grönt) och mikrotubuli (rött) i aktiva kompositer visar komplex formuleringsberoende omstrukturering över tid (listad i min). De fem bilderna i varje rad motsvarar fem bildrutor i en 2000-ramtidsserie som förvärvats för en komposit som drivs av kinesin (K, raderna 1, 3, 5) eller kinesin och myosin (K+M, raderna 2, 4, 6), och inkluderar antingen inga passiva tvärbindare (Ingen XL, raderna 1, 2), aktin-aktin-tvärbindningar (Actin XL, raderna 3, 4) eller mikrotubuli-mikrotubuli-tvärbindningar (MT XL, raderna 5, 6). Skalstrecken är alla 50 μm. Konturfärgerna matchar färgschemat i bild 8. (B) Separata aktin- och mikrotubulifluorescenskanaler för kinesinkompositerna visar varierade strukturer med både aktin-MT-samlokalisering och mikrofasseparation. Bilderna som visas är för kompositer med c A = 2,32 μM, c T = 3,48 μM, c K = 0,35 μM, c M = 0,47 μM (raderna 2, 4, 6), R A = 0,02 (raderna 3, 4) och RMT = 0,005 (raderna 5, 6). Alla kompositer börjar med jämnt fördelade interpenetrerande nätverk av aktin och mikrotubuli (kolumn 1). Kinesindrivna kompositer utan tvärbindare (rad 1) bildar löst anslutna amorfa kluster som är MT-rika. Actin samlokaliseras inledningsvis i mitten av dessa aggregat men pressas sedan ut ur de MT-rika regionerna som fortsätter att dra ihop sig och kopplas bort från varandra. Actin-aktin-tvärbindning (rad 3) hindrar denna aktin-MT-separation i mikroskala, och istället är MT-rika aggregat anslutna via långa aktinsträngar. Actin-tvärbindning möjliggör också långsam upptagning av aktin i de MT-rika regionerna, så att kompositen blir ett anslutet nätverk av samlokaliserade aktin- och MT-kluster. Mikrotubuli-tvärbindning (rad 5) leder till amorf klustring av MTs som samlas över tid, vilket resulterar i större fasseparation av aktin och MTs. Att lägga till myosin (raderna 2, 4, 6) minskar kinesindriven avblandning och omstrukturering. Utan tvärbindare (rad 2) visar kompositer liten omläggning under timmarna. Tvärbindning ökar omstrukturering och samlokalisering av aktin och mikrotubuli (raderna 4, 6). Specifikt, när mikrotubuli är tvärbundna (rad 6), finns det betydande interpenetration och omorganisation i webbliknande nätverk av fibrer. Denna siffra har ändrats från referens50. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7. PIV visar att aktiva kompositer uppvisar tre klasser av spatiotemporalt distinkta flödesfält. (A) PIV-flödesfält för de första (t i) och sista (tf) bildrutorna i tre representativa tidsserier, som visar de olika dynamiska klasser som kompositer som visas i figur 6 uppvisar. PIV-flödesfält för mikrotubuli (överst) och aktin (nederst) för klass 1 (topp, lila), klass 2 (mitten, orange) och klass 3 (nederst, magenta) exempelvideor, med pilfärger som motsvarar den universella hastighetsskalan längst ner och gråskalefärgkartan som visar den rumsliga hastighetsfördelningen, normaliserad separat för varje flödesfält enligt skalan som visas längst ner. Skalstrecken är alla 50 μM. (B) Vinkelfördelningar av hastighetsvektorer från A (i radianenheter) med listade initiala och slutliga standardavvikelser σ i och σf. (C) Tidsmässiga färgkartor för de videor som analyseras i A och B visar ram-till-bild-positionen för varje pixel i förhållande till dess startpunkt. Klass 1-kartor visar småskalig slumpmässig rörelse; Klass 2-kartor visar snabb enkelriktad rörelse med minimal rumslig eller tidsmässig variation; Klass 3-kartor uppvisar funktioner i både klass 1 och 2. Denna siffra har ändrats från referens50. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8. DDM och SIA mäter den tidsvarierande dynamiken och strukturen hos tvåmotoriga aktin-mikrotubulikompositer. (A) Hastigheter för kompositer som beskrivs i figur 6 och figur 7, uppmätta via DDM, visar acceleration och retardation av kompositer, programmerade genom tvärbindning och myosinaktivitet. Hastigheter av mikrotubuli (MT, slutna cirklar) och aktin (A, öppna cirklar) plottas som en funktion av aktivitetstiden i kompositer utan tvärbindning (topp, blå), aktintvärbindning (mitten, grön), mikrotubulitvärbindning (botten, röd), utan myosin (K, mörkare nyanser) och med myosin (K + M, ljusare nyanser). För klass 3-fall, som har två hastigheter, indikeras den långsammare hastigheten med en stjärna. Datapunkter omgivna av streckade svarta cirklar motsvarar maximal hastighet vmaxför varje formulering. Felstaplar (de flesta för små för att se) är standardfelet över effektlagspassningarna för motsvarande τ(q). (B) Strukturella korrelationslängder ξ, bestämda via SIA, kontra aktivitetstid, för samma uppsättning tidsserier utvärderade i A. Varje datapunkt är ett medelvärde av de korrelationslängder som fastställts för den första och sista bildrutan i motsvarande tidsserie. I allmänhet ökar ξ i tid för både aktin och mikrotubuli i alla kompositsystem, och kompositer som drivs enbart av kinesin har större korrelationslängder än de där myosin också är närvarande. Datapunkter i A och B som motsvarar de tre tidsserierna som analyseras i figur 7 är cirklade i motsvarande klassfärg (1 = lila, 2 = orange, 3 = magenta). Denna siffra har ändrats från referens50. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Ett viktigt framsteg för det rekonstituerade systemet som beskrivs ovan är dess modularitet och tunabilitet, så användarna uppmuntras att modifiera koncentrationerna av proteiner, motorer, tvärbindare etc. för att passa deras önskade resultat, oavsett om det är att emulera en viss cellulär process eller konstruera ett material med specifik funktionalitet eller mekaniska egenskaper. Begränsningar av koncentrationsintervallet för aktin och tubulin ställs in vid den nedre gränsen av den kritiska koncentration som behövs för att polymerisera aktin (~ 0,2 μM) 57,58,59 och tubulin (~ 3 - 4 μM) 60, och vid den övre gränsen genom övergången till nematisk inriktning av aktinfilament (~ 90 μM) 61,62 eller mikrotubuli (~ 35 μM) 63 . Aktinmonomerer och tubulindimerer bör polymeriseras till filament tillsammans, snarare än att blandas ihop efter polymerisation, för att säkerställa att de bildar homogent interpenetrerande perkolerade nätverk som synergistiskt stöder varandra. Den nya dynamiken som kompositerna uppvisar är beroende av denna interaktion. Även om det i allmänhet är viktigt att följa alla steg som beskrivs i protokollet för att framgångsrikt reproducera de visade resultaten, är vissa steg mer krävande, medan andra har utrymme att ändra och justera för att passa specifika behov och tillgängliga resurser.

Ett viktigt steg för att säkerställa reproducerbara resultat är till exempel att förbereda och lagra reagenserna på rätt sätt i enlighet med riktlinjerna i materialförteckningen. Cytoskelettproteiner (aktin, tubulin, myosin, kinesin) är labila och bör alikvoteras, blixtfrysas med flytande kväve och förvaras vid -80 °C i alikvoter för engångsbruk. När alikvoterna har avlägsnats från -80 °C bör de förvaras på is. Cytoskelettproteiner behåller inte på ett tillförlitligt sätt funktionen efter ytterligare frys-tina cykler.

Mikrotubuli är känsligare för depolymerisation och denaturering än aktin. När tubulin har avlägsnats från -80 °C ska det förvaras på is före polymerisationen och användas inom 12 timmar. När de har polymeriserats bör mikrotubuli hållas vid rumstemperatur. Det är också viktigt att stabilisera mikrotubuli med taxol för att förhindra depolymerisation. Falloidinstabilisering av aktinfilament är också viktigt för att undertrycka det ATP-konsumerande aktinlöpbandet som konkurrerar med myosin- och kinesinaktivitet.

Ultracentrifugering av myosinmotorer är ett annat kritiskt steg, eftersom det tar bort inaktiva myosin döda huvuden. Att inte ta bort de enzymatiskt inaktiva monomererna resulterar i passiv tvärbindning av aktinnätverket och förlust av aktivitet. För att förlänga ATPas-aktiviteten hos motorer kan ett ATP-regenereringssystem såsom kreatinfosfat och kreatinfosfokinas64 införlivas.

Slutligen kräver upprätthållande av kompositaktivitet inhibering av adsorption av filament och motorer till provkammarens väggar, vilket kan uppnås genom passivering av mikroskopskydden och glidbanorna. Motorproteiner är särskilt benägna att adsorption, vilket resulterar i att kompositen dras till ytan av provkammaren, rör sig ut ur synfältet, kollapsar till 2D och inte längre genomgår aktivitet. Silanisering av täckglas och glidbanor är ett effektivt sätt att passivera ytorna och förhindra adsorption (se steg 1). En alternativ passiveringsmetod som används effektivt i in vitro-cytoskelettexperiment är att belägga ytan med ett lipid-dubbelskikt, liknande cellmembranet18. Denna metod är fördelaktig om man vill binda proteiner till ytan eller införa andra specifika protein-ytinteraktioner, eftersom dubbelskiktet kan funktionaliseras. För optiska pincettexperiment är passivering av mikrosfärerna också kritisk och kan uppnås genom beläggning av karboxylerade mikrosfärer med BSA eller PEG via karbodiimidkorsbindningskemi48.

Det finns några aspekter av de presenterade protokollen som forskare kan överväga att ändra för att passa deras behov. För det första kan forskare välja att ersätta icke-infödda biotin-NA-tvärbindare med biologiska tvärbindare, såsom alfa-aktinin eller MAP65 som tvärbinder aktin respektive mikrotubuli, 28,65,66. Användningen av icke-inbyggda tvärbindare i kompositerna som beskrivs här motiveras av deras förbättrade reproducerbarhet, stabilitet och tunabilitet jämfört med inbyggda tvärbindare. På grund av den starka biotin-NA-bindningen kan tvärbindare antas vara permanenta, snarare än de flesta inbyggda tvärbindare som tillfälligt binder med omfattande omsättningshastigheter. Dynamiken i övergående tvärbindning komplicerar att analysera bidragen från tvärbindare och motorer till dynamiken. Dessutom kan biotin-NA-länkar användas mångsidigt för att tvärbinda både aktin och mikrotubuli, liksom tvärbindningsaktin till mikrotubuli. På detta sätt kan en entydig jämförelse mellan tvärbindningsmotiv göras, vilket håller alla andra variabler (t.ex. tvärbindningsstorlek, bindningsaffinitet, stökiometri etc.) fasta. Slutligen är de reagenser som behövs för att införliva biotin-NA-länkar allmänt kommersiellt tillgängliga, väl karakteriserade och används ofta i många biofysiklaboratorier. En av de viktigaste styrkorna hos in vitro-plattformen som beskrivs här är dock dess modularitet, så forskare bör sömlöst kunna ersätta biotin-NA-länkar med inbyggda länkar om de väljer.

För det andra, i det aktuella protokollet, polymeriseras aktinmonomerer och tubulindimerer i filament tillsammans i ett centrifugrör innan de läggs till provkammaren. Att strömma lösningen av intrasslade trådformiga proteiner in i provkammaren kan orsaka flödesinriktning, särskilt av mikrotubuli, vilket bryter den önskade isotropin och homogeniteten hos kompositerna. Faktum är att ett stort framsteg i tidigare arbete med steady-state aktin-mikrotubulikompositer var förmågan att sampolymerisera aktin och mikrotubuli in situ (i provkammaren) för att säkerställa bildandet av isotropa interpenetrerande nätverk av aktin och mikrotubuli15,16,27. Att utvidga detta tillvägagångssätt till aktiva kompositer skulle dock kräva att motorerna tillsattes till provet före aktin- och tubulinpolymerisation och att hela provet inkuberades tillsammans vid 37 °C före experiment. Tester av denna variation av protokollet har resulterat i minskad aktinpolymerisation och ingen urskiljbar motorisk aktivitet, sannolikt på grund av konkurrerande ATPas-aktivitet och den långvariga 37 °C-inkubationen av motorerna. Lyckligtvis finns det ingen märkbar flödesjustering av kompositer när man följer de aktuella protokollen, vilket kan ses i figur 2, figur 3 och figur 6. Ändå uppmuntras forskare att utforma protokoll som möjliggör in situ-bildning av aktiva kompositer.

En annan punkt att överväga är fluorescensmärkningsschemat, vilket innebär att man märker alla aktinfilament och mikrotubuli i nätverket glest märkt. Denna märkningsmetod optimerades för att direkt visualisera nätverkets struktur snarare än att dra slutsatser om struktur och dynamik via spårfilament eller mikrosfärer. Avvägningen är dock att enskilda filament inte är starkt märkta och upplösbara. Ett tillvägagångssätt som forskare kan ta för att både lösa enstaka filament och visualisera nätverksstruktur är att dopa i förformade filament märkta med en annan fluorofor, så att både det omgivande nätverket och enskilda filament kan avbildas samtidigt. Men när man använder mer än två fluoroforer och excitations- / emissionskanaler är det ofta svårt att eliminera genomblödning mellan kanaler, så man måste vara försiktig när man väljer fluoroforer, filter och laserintensiteter.

En relaterad begränsning är oförmågan att visualisera myosin- eller kinesinmotorerna i kompositerna. De fluorescerande märkta aktinmonomererna och tubulindimererna som används är kommersiellt tillgängliga, medan visualisering av myosin eller kinesin i kompositer kräver intern märkning. Forskare uppmuntras att ta nästa steg för att märka motorer, som tidigare gjorts18,67, för att entydigt kunna koppla motorisk aktivitet och bindning till den dynamik och de strukturer som våra kompositer uppvisar.

Slutligen är det viktigt att notera att i det nuvarande protokollet kontrolleras inte kinesinaktivitetens början och varaktighet. Eftersom myosinaktiviteten styrs med hjälp av fotodeaktivering av blebbistatin, som beskrivits ovan, för att bygga in liknande ljusaktivering av kinesin, kan man införliva ljusaktiverad ATP.

För att bygga upp komplexiteten i de konstruktioner som beskrivs här, för att bättre efterlikna cellulära förhållanden och bredda det dynamiska struktur-funktionsparameterutrymmet, kommer framtida arbete att fokusera på att införliva mellanliggande filament, såsom vimentin68,69, liksom andra motorer som dynein13,70. Gelsolin kommer också att införlivas i olika koncentrationer för att kontrollera aktinlängd14, liksom tau-protein för att kontrollera mikrotubulistyvhet.

Sammanfattningsvis beskriver de presenterade protokollen hur man designar, skapar och karakteriserar dynamiken, strukturen och mekaniken hos cytoskelettinspirerade aktiva substanssystem, som innehåller två separata aktiva kraftgenererande komponenter som verkar på olika substrat i ett enda system. Denna avstämbara och modulära plattform ger rekonstitutionsinsatser ett viktigt steg närmare att efterlikna den cellulära cytoskeletten och erbjuder den unika förmågan att programmera dess egenskaper över ett brett fasutrymme genom att självständigt införliva, ta bort och ställa in de olika komponenterna. Dessutom är alla komponenter i detta mångsidiga system kommersiellt tillgängliga (se materialtabell), förutom kinesindimererna som renas i Ross Lab, som beskrivits tidigare50, och tillgängliga på begäran. Slutligen är all analyskod fritt tillgänglig via GitHub49 och är baserad på gratis programmeringsspråk och programvara (Python och Fiji). Den transparenta spridningen av protokoll för att utforma dessa system kommer förhoppningsvis att göra denna plattform mer tillgänglig för en mångsidig grupp användare med olika expertis, bakgrunder, institutionella tillhörigheter och forskningsmål.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja

Acknowledgments

Vi erkänner Maya Hendija och Dr. Jonathan Michel för hjälp med dataanalys, och Dr. Janet Sheung, Dr. Moumita Das och Dr. Michael Rust för hjälpsamma diskussioner och vägledning. Denna forskning stöddes av ett William M. Keck Foundation Research Grant och NSF DMREF Award (DMR 2119663) som tilldelades RMRA och JLR och National Institutes of Health R15 Grants (R15GM123420, 2R15GM123420-02) som tilldelades RMR-A och RJM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin
 Abbreviation used in paper: blebbistatin		 Sigma Aldrich B0560 Stock Concentration: 200 μM in DMSO
Storage: dessicated, in DMSO, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: dissolve 1 mg of powder to 200 μM in DMSO
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: limited shelf-life, typically stops functioning reliably after 3-4 months. purchase and prepare new solution every 3 months. 
1:20 488-tubulin:tubulin mixture
 Abbreviation used in paper: 5-488-tubulin		 NA NA Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and 488-tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
1:20 R-tubulin:tubulin mixture
 Abbreviation used in paper: 5-R-tubulin		 NA NA Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and rhodamine tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
actin (biotin): skeletal muscle
 Abbreviation used in paper: biotin-actin		 Cytoskeleton AB07 Stock Concentration: 1 mg/ml in G-buffer
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: (1) immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM, (2) once removed from -80ºC, store  aliquot on ice at 4ºC for up to 1 week
actin (rhodamine): rabbit skeletal muscle
 Abbreviation used in paper: R-actin		 Cytoskeleton AR05 Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store  aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week
adenosine triphosphate
 Abbreviation used in paper: ATP		 Thermo Fisher Scientific A1048 Stock Concentration: 100 mM
Storage: in solution (pH 7), -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconsitute in DI H20, bring pH to 7 with NaOH
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: routinely check pH and adjust as needed, hydrolyzes over time, replace every ~6-12 months
AlexaFluor488 Phalloidin
 Abbreviation used in paper: 488-phalloidin		 Thermo Fisher Scientific A12379 Stock Concentration: 100 μM DMSO
Storage: protected from light, dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 20 μM in PEM (1 μL in 4 μL PEM)
AlexaFluor488–labeled actin
 Abbreviation used in paper: 488-actin		 Thermo Fisher Scientific A12373 Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: this item has been discontinued
Basic Plasma Cleaner
 Abbreviation used in paper: plasma cleaner		 Harrick Plasma PDC-32G
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
 Abbreviation used in paper: transparent film		 Thermo Fisher Scientific 13-374-5
D-(+)-Glucose
 Abbreviation used in paper: 		 Thermo Fisher Scientific A1682836 Stock Concentration: 100x
Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 4.5 mg/ml in DI H20
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should 45 μg/mL 
D-Biotin
 Abbreviation used in paper: biotin		 Fisher Scientific BP232-1 Stock Concentration: 1.02 mM in PEM
Storage: dessicated, 4ºC
deionized nanopure water
 Abbreviation used in paper: DI
Dimethyldichlorosilane
 Abbreviation used in paper: silane		 Thermo Fisher Scientific D/3820/PB05 Stock Concentration: 2% dissolved in Toulene
Dithiothreitol
 Abbreviation used in paper: DTT		 Thermo Fisher Scientific R0861 Stock Concentration: 1 M in DMSO
Storage: dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: dilute to 2 mM in PEM immediately before each experiment
DMSO Anhydrous
 Abbreviation used in paper: DMSO		 Thermo Fisher Scientific D12345
F-Buffer
 Abbreviation used in paper: F-buffer		 NA NA Stock Concentration: 10x
Storage: dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: 10 mM Imidazole (pH 7.0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.2 mM ATP
G-Buffer
 Abbreviation used in paper: G-buffer		 NA NA Stock Concentration: 10x
Storage: dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: 2.0 mM Tris (pH 8), 0.2 mM ATP, 0.5 mM DTT, 0.1 mM CaCl2. Store at -20°C.
glass microscope slide
 Abbreviation used in paper: slide		 Thermo Fisher Scientific 22-310397
Glucose oxidase + catalase + β-mercaptoethanol
 Abbreviation used in paper: GOC		 Sigma Aldrich G2133-250KU, C1345, 63689  Stock Concentration: 100x
Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC
Stock and Experiment Recipes: For 100x: 4.3 mg/ml glucose oxidase, 0.7 mg/ml catalase, 0.5% v/v  β-mercaptoethanol in DI H20
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should be: 0.005% β-mercaptoethanol, 43 μg/mL glucose oxidase, 7 μg/mL catalase
glu-GOC oxygen scavenging system
 Abbreviation used in paper: glu-GOC		 NA NA Stock Concentration: 100x
Storage: prepare fresh each time
Stock and Experiment Recipes: mix equal parts Glu and GOC and add at 1/100 final sample volume immediately before imaging
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: prepare from Glu and GOC immediately before imaging
Guanosine triphosphate
 Abbreviation used in paper: GTP		 Thermo Fisher Scientific R0461 Stock Concentration: 100 mM
Storage: 100 μL aliquots at -20ºC
Instant Mix 1-minute epoxy
 Abbreviation used in paper: epoxy		 Loctite 1366072 
Kinesin-1 401 BIO 6x HIS
 Abbreviation used in paper: kinesin		 Prepared in JL Ross Lab at Syracuse University NA Stock Concentration: 8.87 μM in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: biotinylated dimers form kinesin clusters, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC
NeutrAvidin
 Abbreviation used in paper: NA		 Thermo Fisher Scientific 31000 Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM
No 1. glass coverslips (24 mm x 24 mm)
 Abbreviation used in paper: coverslip		 Thermo Fisher Scientific 12-548-CP
Paclitaxel 
 Abbreviation used in paper: Taxol		 Thermo Fisher Scientific P3456 Stock Concentration: 2 mM in DMSO
Storage: protected from light, dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mM with DMSO
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 200 μM in DMSO (0.4 μL in 3.6 μL DMSO)
PEM-100
 Abbreviation used in paper: PEM		 NA NA Stock Concentration: 1x
Storage: room temperature (RT)
Stock and Experiment Recipes: 100 mM K-PIPES (pH 6.8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: use KOH to adjust pH to 6.8, recheck pH often and adjust accordingly
phalloidin
Abbreviation used in paper: phalloidin		 Thermo Fisher Scientific P3457 Stock Concentration: 100 μM in DMSO
Storage: protected from light, dessicated, -20ºC, adhere closely to storage/handling conditions
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: susceptible to impurities in its preparation and denaturing, identifiable as large amorphous aggregates of actin in samples
porcine brain tubulin
 Abbreviation used in paper: tubulin		 Cytoskeleton T240 Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC
Potassium Chloride
 Abbreviation used in paper: KCl		 Thermo Fisher Scientific AM9640G Stock Concentration: 4 M
Storage: RT
Rabbit skeletal actin
 Abbreviation used in paper: actin		 Cytoskeleton AKL99 Stock Concentration: 2 mg/ml in G-buffer
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store  aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week
Rabbit skeletal myosin II
 Abbreviation used in paper: myosin		 Cytoskeleton MY02 Stock Concentration: 10 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 10 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: monomers form minifilaments at low KCl, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC
Tubulin (biotin): porcine brain
 Abbreviation used in paper: biotin-tubulin		 Cytoskeleton T333P Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM
Tubulin (fluorescent HiLyte 488): porcine brain
 Abbreviation used in paper: 488-tubulin		 Cytoskeleton TL488M Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
tubulin (rhodamine): porcine brain
 Abbreviation used in paper: R-tubulin		 Cytoskeleton TL590M Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
Tween 20
 Abbreviation used in paper: Tween20		 Thermo Fisher Scientific J20605.AP Stock Concentration: 1% v/v in DI H20
Storage: RT
ultracentrifuge grade microtubes
 Abbreviation used in paper: Beckman-Coulter Optima Max XP 		 Beckman Coultier 343776 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: 8x34 mm PC
UV light curing glue
 Abbreviation used in paper: UV glue		 Pharda SKG-2869

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  2. Koenderink, G. H., Paluch, E. K. Architecture shapes contractility in actomyosin networks. Current Opinion in Cell Biology. 50, 79-85 (2018).
  3. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  4. Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).
  5. Wen, Q., Janmey, P. A. Polymer physics of the cytoskeleton. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 15 (5), 177-182 (2011).
  6. Xiao, Q., Hu, X., Wei, Z., Tam, K. Y. Cytoskeleton molecular motors: structures and their functions in neuron. International Journal of Biological Sciences. 12 (9), 1083-1092 (2016).
  7. Ajeti, V. et al. Wound healing coordinates actin architectures to regulate mechanical work. Nature Physics. 15 (7), 696-705 (2019).
  8. Jung, W. et al. Dynamic motions of molecular motors in the actin cytoskeleton. Cytoskeleton. 76 (11-12), 517-531 (2019).
  9. Pollard, T. D., O'Shaughnessy, B. Molecular mechanism of cytokinesis. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 661-689 (2019).
  10. Huber, F., Boire, A., López, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Current Opinion in Cell Biology. 32, 39-47 (2015).
  11. Rivero, F. et al. The role of the cortical cytoskeleton: F-actin crosslinking proteins protect against osmotic stress, ensure cell size, cell shape and motility, and contribute to phagocytosis and development. Journal of Cell Science. 109 (11), 2679-2691 (1996).
  12. Duclos, G. et al. Topological structure and dynamics of three-dimensional active nematics. Science. 367 (6482), 1120-1124 (2020).
  13. Baclayon, M. et al. Optical tweezers-based measurements of forces and dynamics at microtubule ends. Optical Tweezers. 1486, 411-435 (2017).
  14. Gurmessa, B., Fitzpatrick, R., Falzone, T. T., Robertson-Anderson, R. M. Entanglement density tunes microscale nonlinear response of entangled actin. Macromolecules. 49 (10), 3948-3955 (2016).
  15. Francis, M. L. et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  16. Ricketts, S. N. et al. Varying crosslinking motifs drive the mesoscale mechanics of actin-microtubule composites. Scientific Reports. 9 (1), 12831 (2019).
  17. Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Soares e Silva, M. et al. Active multistage coarsening of actin networks driven by myosin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9408-9413 (2011).
  20. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Roichman, Y. Dynamics in steady state in vitro acto-myosin networks. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (16), 163002 (2017).
  21. Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127 (2013).
  22. Fürthauer, S. et al. Self-straining of actively crosslinked microtubule networks. Nature Physics. 15 (12), 1295-1300 (2019).
  23. Lemma, L. M. et al. Multiscale microtubule dynamics in active nematics. Physical Review Letters. 127 (14), 148001 (2021).
  24. Fan, Y., Wu, K.-T., Aghvami, S. A., Fraden, S., Breuer, K. S. Effects of confinement on the dynamics and correlation scales in kinesin-microtubule active fluids. Physical Review E. 104 (3), 034601 (2021).
  25. Triclin, S. et al. Self-repair protects microtubules from destruction by molecular motors. Nature Materials. 20 (6), 883-891 (2021).
  26. Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).
  27. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical Journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  28. Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).
  29. Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  30. Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).
  31. Yadav, V. et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
  32. Ennomani, H. et al. Architecture and connectivity govern actin network contractility. Current Biology. 26 (5), 616-626 (2016).
  33. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  34. Alvarado, J., Cipelletti, L., Koenderink, G. H. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).
  35. Jung, W., Murrell, M. P., Kim, T. F-actin cross-linking enhances the stability of force generation in disordered actomyosin networks. Computational Particle Mechanics. 2 (4), 317-327 (2015).
  36. Lenz, M., Thoresen, T., Gardel, M. L., Dinner, A. R. Contractile units in disordered actomyosin bundles arise from f-actin buckling. Physical Review Letters. 108 (23), 238107 (2012).
  37. Memarian, F.L. et al. Active nematic order and dynamic lane formation of microtubules driven by membrane-bound diffusing motors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (52), e2117107118 (2021).
  38. Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nature Reviews Materials. 2 (9), 17048 (2017).
  39. Foster, P. J., Fürthauer, S., Shelley, M. J., Needleman, D. J. Active contraction of microtubule networks. eLife. 4, e10837 (2015).
  40. Thijssen, K. et al. Submersed micropatterned structures control active nematic flow, topology, and concentration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (38), e2106038118 (2021).
  41. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  42. Colen, J. et al. Machine learning active-nematic hydrodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (10), e2016708118 (2021).
  43. Mitchell, K. A., Tan, A. J., Arteaga, J., Hirst, L. S. Fractal generation in a two-dimensional active-nematic fluid. Chaos: An Interdisciplinary Journal of Nonlinear Science. 31 (7), 073125 (2021).
  44. Pandolfi, R. J., Edwards, L., Johnston, D., Becich, P., Hirst, L. S. Designing highly tunable semiflexible filament networks. Physical Review E. 89 (6), 062602 (2014).
  45. Tan, A. J. et al. Topological chaos in active nematics. Nature Physics. 15 (10), 1033-1039 (2019).
  46. Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., Nédélec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e14 (2018).
  47. Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  48. Sheung, J. Y. et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  49. McGorty, R. PyDDM v0.2.0. Zenodo. (2022).
  50. Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv. (2021).
  51. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).
  52. McGorty, R. Image-Correlation. at <https://github.com/rmcgorty/Image-Correlation>. (2020).
  53. Robertson, C. Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801 (2012).
  54. McGorty, R. Differential Dynamic Microscopy - Python. at <https://github.com/rmcgorty/Differential-Dynamic-Microscopy---Python>. (2021).
  55. Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).
  56. Robertson-Anderson, R. M. Optical tweezers microrheology: from the basics to advanced techniques and applications. ACS Macro Letters. 7 (8), 968-975 (2018).
  57. Pollard, T. D. Polymerization of ADP-actin. Journal of Cell Biology. 99 (3), 769-777 (1984).
  58. Coué, M., Brenner, S. L., Spector, I., Korn, E. D. Inhibition of actin polymerization by latrunculin A. FEBS Letters. 213 (2), 316-318 (1987).
  59. Pollard, T. D. Actin and actin-binding proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (8), a018226 (2016).
  60. Kumar, N. Taxol-induced polymerization of purified tubulin. Mechanism of action. Journal of Biological Chemistry. 256 (20), 10435-10441 (1981).
  61. Käs, J. et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophysical Journal. 70 (2), 609-625 (1996).
  62. Viamontes, J., Narayanan, S., Sandy, A. R., Tang, J. X. Orientational order parameter of the nematic liquid crystalline phase of F -actin. Physical Review E. 73 (6), 061901 (2006).
  63. Hitt, A. L., Cross, A. R., Williams, R. C. Microtubule solutions display nematic liquid crystalline structure. Journal of Biological Chemistry. 265 (3), 1639-1647 (1990).
  64. Andexer, J. N., Richter, M. Emerging enzymes for ATP regeneration in biocatalytic processes. ChemBioChem. 16 (3), 380-386 (2015).
  65. Farhadi, L. et al. Actin and microtubule crosslinkers tune mobility and control co-localization in a composite cytoskeletal network. Soft Matter. 16 (31), 7191-7201 (2020).
  66. Falzone, T. T., Lenz, M., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Assembly kinetics determine the architecture of α-actinin crosslinked F-actin networks. Nature Communications. 3 (1), 861 (2012).
  67. Thoresen, T., Lenz, M., Gardel, M. L. Reconstitution of contractile actomyosin bundles. Biophysical Journal. 100 (11), 2698-2705 (2011).
  68. Sanghvi-Shah, R., Weber, G. F. Intermediate filaments at the junction of mechanotransduction, migration, and development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 81 (2017).
  69. Shen, Y. et al. Effects of vimentin intermediate filaments on the structure and dynamics of in vitro multicomponent interpenetrating cytoskeletal networks. Physical Review Letters. 127 (10), 108101 (2021).
  70. Laan, L., Roth, S., Dogterom, M. End-on microtubule-dynein interactions and pulling-based positioning of microtubule organizing centers. Cell Cycle. 11 (20), 3750-3757 (2012).

Tags

Biologi Utgåva 186 cytoskelett aktiv substans aktin mikrotubuli myosin kinesin kompositer biopolymerer in vitro-beredning fluorescenskonfokalmikroskopi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics
Posted by JoVE Editors on 10/11/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics. The Authors section was updated.

Mehrzad Sasanpour1
Daisy H. Achiriloaie1,2
Gloria Lee1
Gregor Leech1
Christopher Currie1
K. Alice Lindsay3
Jennifer L. Ross3
Ryan J. McGorty1
Rae M. Robertson-Anderson1
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College
3Department of Physics, Syracuse University

to:

Mehrzad Sasanpour1
Daisy H. Achiriloaie1,2
Gloria Lee1
Gregor Leech1
Maya Hendija1
K. Alice Lindsay3
Jennifer L. Ross3
Ryan J. McGorty1
Rae M. Robertson-Anderson1
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College
3Department of Physics, Syracuse University

Rekonstituera och karakterisera aktin-mikrotubulikompositer med avstämbar motordriven dynamik och mekanik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sasanpour, M., Achiriloaie, D. H.,… More

Sasanpour, M., Achiriloaie, D. H., Lee, G., Leech, G., Hendija, M., Lindsay, K. A., Ross, J. L., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics. J. Vis. Exp. (186), e64228, doi:10.3791/64228 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter