Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rekonstitution af actinbaseret bevægelighed med kommercielt tilgængelige proteiner

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64261
Automatic Translation
1, 1
1Laboratoire de physique de l’Ecole Normale Supérieure, ENS, Université PSL, CNRS, Sorbonne Université, Université Paris Cité

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man producerer actinkometer på overfladen af perler ved hjælp af kommercielt tilgængelige proteiningredienser. Sådanne systemer efterligner de fremspringende strukturer, der findes i celler, og kan bruges til at undersøge fysiologiske mekanismer for kraftproduktion på en forenklet måde.

Abstract

Mange cellebevægelser og formændringer og visse typer intracellulær bakteriel og organelmotilitet drives af biopolymer actin, der danner et dynamisk netværk på overfladen af cellen, organellen eller bakterien. Det biokemiske og mekaniske grundlag for kraftproduktion under denne proces kan studeres ved at reproducere actinbaseret bevægelse på en acellulær måde på inerte overflader såsom perler, der funktionaliseres og inkuberes med et kontrolleret sæt komponenter. Under de rette forhold samles et elastisk actinnetværk ved perleoverfladen og bryder op på grund af den stress, der genereres af netværksvækst, og danner en "actinkomet", der driver perlen fremad. Sådanne eksperimenter kræver imidlertid oprensning af et væld af forskellige actinbindende proteiner, hvilket ofte sætter dem uden for ikke-specialisters rækkevidde. Denne artikel beskriver en protokol til reproducerbar opnåelse af actinkometer og motilitet af perler ved hjælp af kommercielt tilgængelige reagenser. Perlebelægning, perlestørrelse og bevægelighedsblanding kan ændres for at observere effekten på perlehastighed, baner og andre parametre. Dette assay kan bruges til at teste de biokemiske aktiviteter af forskellige actinbindende proteiner og til at udføre kvantitative fysiske målinger, der kaster lys over aktive stofegenskaber af actinnetværk. Dette vil være et nyttigt værktøj for samfundet, der muliggør undersøgelse af in vitro actinbaseret motilitet uden ekspertviden inden for actinbindende proteinrensning.

Introduction

Actinpolymerisation i celler styres rumligt og tidsmæssigt ved stram regulering af actinfilamentkernering nedstrøms for cellesignalering1. Nukleation sker via dannelsen af en actin trimer, og derefter polymeriserer begge ender af den spirende filament spontant, selvom den ene ende er mere dynamisk (den piggede ende) end den anden (den spidse ende)2. Når kimdannelse og pigtrådspolymerisation er rettet mod en overflade, producerer de tilstrækkelig kraft (i pico-til-nano Newton-området) til at skubbe cellemembranen ud til bevægelse og til at flytte objekter i mikronstørrelse inde i cellen med ATP-hydrolyse som energikilde3. Nogle eksempler inkluderer Listeria monocytogenes bakterier, der bruger actinkometer til at sprede sig fra celle til celle, og mitokondrier, hvor actinkometbaseret bevægelse er vigtig for randomiseret arv under mitose 4,5. Actinkometer på endosomer og andre intracellulære vesikler er impliceret i løsrivelse fra donormembraner 6,7,8.

Med den metode, der præsenteres her, omgås signalaspekterne af cellulær actinpolymerisation, og actinpolymerisation fremstilles på mikrometriske polystyrenperler ved at belægge dem med aktivatorer af forgrenet actinkernedannelse, specifikt det aktive domæne af det humane WASP-protein, VCA (også kaldet WA eller WCA)1. De belagte perler inkuberes derefter i en blanding indeholdende de ingredienser, der er nødvendige for actinpolymerisation, herunder hovedactinpolymerisationsnukleatoren i celler, Arp2/3-komplekset, som aktiveres af VCA ved perleoverfladen for at danne nye filamenter som grene fra siderne af datterfilamenter1. Actin polymeriserer oprindeligt ensartet omkring perlen, men bryder derefter spontant symmetrien for at skabe en actinkomet, der skubber perlen fremad og derved genskaber cellelignende fremspringende netværk og kometer på en kontrolleret måde. Lignende tilgange med perler og andre belagte overflader er tidligere blevet brugt af os og andre til at studere biokemi og biofysik af actinpolymerisation 9,10,11,12, men omfattende ekspertise inden for actinbindende proteiner var påkrævet for disse eksperimenter. Protokollen, der præsenteres her, beskriver, hvordan man robust skaber actinkometer og bevægelighed udelukkende med kommercielt tilgængelige (eller snart tilgængelige) reagenser, hvilket gør denne tilgang tilgængelig for alle, herunder i en uddannelsesmæssig ramme til undervisning i biofysiske begreber. Nøglefunktioner inkluderer vigtigheden af skånsom og pålidelig pipettering, brugen af profilinkomplekset monomer som actinkilde og væsentligheden ved at bruge en meget aktiv Apr2/3 kompleks aktivator som et perlebelægningsreagens.

Protocol

1. Forberedelse af buffere

BEMÆRK: Brug ultrapure H2O til alle buffere. Det behøver ikke at være sterilt. Alle de opløsninger, der er beskrevet i trin 1.1-1.4, filtreres med et sprøjtefilter på 0,2 μm, aliquot i portioner på 500 μL-2 ml pr. rør afhængigt af brug, og opbevares ved -20 °C.

  1. Forbered 10% BSA ved at veje 2 g BSA i et 50 ml konisk rør og fyld til 20 ml mærket med H2O. Bland, indtil BSA er opløst (ca. 30 min), og fyld derefter volumenet op til 20 ml.
    BEMÆRK: Brug BSA af høj kvalitet (se Materialetabel). 10% BSA-opløsningen anvendes i både perleforberedelse og motilitetsblandingen.
  2. Til forberedelse af perler fremstilles Xb-buffer (10 mM HEPES, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl 2 og 0,1 mM CaCl 2, pH 7,5) som en 10x opløsning og fortyndes før brug (100 μL 10x Xb-stamopløsning + 900 μL H2 O). Der fremstilles Xb/1% BSA ved at blande 100 μL 10x Xb stamopløsning + 100 μL 10% BSA + 800 μL H2O.
  3. Forbered G-buffer (2 mM Tris, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM DTT,2 mM ATP), som er den buffer, der bruges til at fortynde monomerisk actin (G-actin). Juster til pH 7, ikke pH 8 som traditionelt anvendt (se diskussion).
  4. Klargør bevægelighedsbufferen MB13 (10 mM HEPES, 1,5 mM ATP, 3 mM DTT, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1 % BSA, pH 7,5). For nogle applikationer er 10x MB13 nyttig. Forbered dog 10x MB13 uden BSA, da det fører til problemer under pH-justering. Der tilsættes BSA fra 10 % stamopløsning (fremstillet i trin 1.1), når der rekonstitueres 1x MB13 fra 10x MB13.

2. Fremstilling af proteinopløsninger

BEMÆRK: Brug ultrapure H2O til alle resuspensioner. Det behøver ikke at være sterilt. Håndter alle proteiner på is og aliquot i forkølede rør. Manipuler forsigtigt for ikke at producere bobler og aldrig hvirvelproteinopløsninger. For bestande, der skal opbevares ved -80 °C, er det ikke nødvendigt at lynfryse i flydende nitrogen. Tilpas aliquotstørrelsen for at undgå mere end ca. fem fryse-optøningscyklusser, da dette ikke ser ud til at påvirke aktiviteten af nogen af proteinerne. Arbejdsalikvoter kan opbevares ved -20 °C i et par uger.

  1. Forbered G-actin (kanin skeletmuskulatur) opløsning som beskrevet nedenfor.
    1. Pulscentrifuge-actinpulver (se materialetabel) ved 4 °C for at samle det faste stof i bunden af røret.
    2. Tilsæt H2O i henhold til producentens anvisninger (1 mg protein i 100 μL koldt H2 O for umærketactin, 100 μg protein i 100 μL koldt H2 O for ATTO-mærket actin).
    3. Lad det sidde på is i mindst 15 min. Bland forsigtigt ved at pipettere op og ned, lad det sidde på is mindst yderligere 15 min, og bland igen. Pulscentrifuge ved 4 °C for at opsamle opløsningen i bunden af røret og remixe.
    4. Forbered 10-50 μL aliquots af umærket actin afhængigt af brug og 20 μL aliquots af ATTO-mærket actin. Aliquoterne opbevares ved -80 °C.
    5. For at depolymerisere actinoligomerer, der dannes under frysetørring og frysning, fortyndes en aliquot af resuspenderet actin ~ 8 gange i G-buffer spidset med yderligere ATP og DTT (for eksempel til 20μL resuspenderet actinopløsning fra trin 2.1.4, tilsæt 134 μL G-buffer, 0,32 μL 0,2 mM ATP og 0,16 μL 1 M DTT). Til fluorescerende mærkning tilsættes ca. 10% mærket actin; tilsæt f.eks. 5 μL ATTO-mærket actin til 40 μL fortyndet umærket actin. Lad det depolymerisere på is med lejlighedsvis blanding (pipettering) mindst et par dage til en uge, før du måler proteinkoncentrationen ved Bradford-assay som beskrevet i trin 3.
      BEMÆRK: Opbevar fortyndet umærket og fluorescerende actin på is i et koldt rum eller køleskab; Frys aldrig eller lad det varme. Præparatet vil fortsætte med at depolymerisere over tid, og når det håndteres korrekt, kan det bruges i mindst 6 måneder.
  2. Resuspend Arp2/3-kompleks (svinehjerne) (se materialetabel) efter producentens anvisninger (20 μg protein i 20 μL koldtH2O) med sekvensen af pulscentrifugering, blanding osv. på is som beskrevet for actin i trin 2.1. Kombiner proteinopløsningerne fra resuspending to rør pulver for at få et større lager til reproducerbare eksperimenter. Der fremstilles 2 μL aliquoter, og de opbevares ved -80 °C.
  3. Resuspenderet profilin (humant rekombinant) (se materialetabel) i en 4x højere koncentration end angivet i fabrikantens anvisninger (100 μg protein i 25 μL koldt H2O) medsekvensen af pulscentrifugering, blanding osv. på is som for actin i trin 2.1. Kombiner proteinopløsningerne fra at resupere to rør pulver, før du bestemmer proteinkoncentrationen for at have et større lager til reproducerbare eksperimenter.
    BEMÆRK: Opbevares på is i et koldt rum eller køleskab; Frys aldrig eller lad det varme. Når det håndteres korrekt, er resuspenderet profilin godt i mindst 6 måneder til 1 år.
  4. Resuspenderingsprotein (α1β2, humant rekombinant) (se materialetabel) efter producentens anvisninger (50 μg protein i 50 μL koldt H2O) med sekvensenaf pulscentrifugering, blanding osv. på is som beskrevet for actin i trin 2.1. Afkøl 50 μL glycerol på is og tilsæt 50 μL resuspenderet capping protein til det; Bland forsigtigt. Opbevares ved -20 °C.
    BEMÆRK: Opløsningen fryser ikke, og aktiviteten er robust, så opløsningen kan opbevares som en enkelt aliquot i måneder eller endda år, hvis den håndteres omhyggeligt. Rekombinant capping-protein til mus, det mest almindeligt anvendte tidligere i in vitro-forsøg 13, vil snart være kommercielt tilgængeligt.
  5. Resuspend gelsolin (humant rekombinant, his-mærket) (se materialetabel) efter fabrikantens anvisninger (20 μg protein i 20 μL koldt H2O) med sekvensen af pulscentrifugering, blanding osv. på is som beskrevet for actin i trin 2.1. Ca. 2 μL gelsolin anvendes pr. Forsøgsdag; Tilbered derfor store alikvoter (5-10 μL) og opbevar ved -80 °C.
    BEMÆRK: Protokollen med gelsolin leveres som et alternativ. Brug af capping protein i stedet for gelsolin anbefales, enten købt eller oprenset som i13.
  6. Resuspend VCA (human WASP-VCA, GST-tagged) (se Materialetabel) i 2x højere koncentration end angivet i producentens anvisninger (500 μg protein i 250 μL koldt H2O) med sekvensen af pulscentrifugering, blanding osv. på is som for actin i trin 2.1. Lav 10 μL alikvoter og opbevar ved -80 °C.
    BEMÆRK: Når SpVCA (human pVCA, streptavidin og His-tagged) er kommercialiseret, eller hvis proteinrensning14 er mulig, anbefales brugen af SpVCA i stedet for VCA. VCA giver ikke reproducerbart kometer under de betingelser, der er beskrevet her.

3. Måling af proteinkoncentrationer

  1. Konstruer en Bradford-standardkurve lavet af to overlappende serielle fortyndinger af BSA.
    BEMÆRK: Standardkurven skal kun konstrueres hvert par måneder (eller endnu sjældnere), så længe spektrofotometeret ikke ændres.
    1. I række 1 i et mikrorørstativ anbringes rør til BSA-fortyndingsserie #1: fire 2 ml rør efterfulgt af fire 1,5 ml rør. I række 3 på stativet skal du placere rør til BSA-fortyndingsserie #2 som til serie #1. I række 5 i stativet anbringes et 2 ml rør for hver prøve, der skal måles, sammen med to 1,5 ml rør. Tilføj et enkelt 1,5 ml rør i række 5 til emnet.
    2. Mål Bradford Reagens (se Materialetabel) i 1,5 ml rørene.
      1. Fyld et 15 ml konisk rør til toppen med Bradford Reagens for lettere pipettering (overskydende returneres til lagerflasken i køleskabet) på is. Tag 200 μL Bradford Reagens op, og skub det ud i det koniske rør for at fugte pipettespidsen. Da opløsningen er tyktflydende, pipetteres langsomt for at lade opløsningen komme ind og ud af spidsen helt uden at lave bobler.
      2. Med den "forvåde" spids ledes langsomt 200 μL Bradford Reagens ind i hvert af de 1,5 ml rør i stativet (fire for hver BSA-fortynding, et for blindprøven og to for hver prøve, der skal måles). Gør dette først for at lade Bradford Reagens varme grundigt op til stuetemperatur, før det blandes med proteinopløsninger. Returner det resterende indhold af det 15 ml koniske rør til flasken.
    3. Mål H 2 O i2ml rørene. I række 1 på stativet tilsættes 1.990 μL H2O, detførste rør, og 900 μL til de tre andre rør. For række 3 tilsættes 1.992,5 μL til det første rør og 900 μL til de tre andre rør. Der tilsættes 2.000 μLH2O, til hvert af prøverørene i række 5.
      BEMÆRK: For alle volumener større end 1.000 μL skal du bruge en 1.000 μL pipette, men administrere den fulde mængde ved at pipettere to gange. Det er vigtigt at gøre alt klar, inden de efterfølgende trin påbegyndes, for at undgå at efterlade proteiner stærkt fortyndet i H2O i lange perioder.
    4. For at forberede BSA-fortyndingsserie #1 blandes 10 μL kalibreret 2 mg/ml BSA (se materialetabel) i røret med 1.990 μLH2O, så der dannes en opløsning på 10 μg/ml. Herfra fremstilles tre serielle fortyndinger (5 μg / ml, 2,5 μg / ml og 1,25 μg / ml BSA) ved at overføre 900 μL af hver opløsning til det næste rør (indeholdende 900 μL H2O).
    5. For at forberede BSA-fortyndingsserie #2 blandes 7,5 μL kalibreret 2 mg/ml BSA i røret med 1.992,5 μLH2O, så der dannes en 7,5 μg/ml opløsning. Herfra fremstilles tre serielle fortyndinger (3,75 μg/ml, 1,875 μg/ml og 0,9375 μg/ml BSA) ved at overføre 900 μL af hver opløsning til det næste rør (indeholdende 900 μL H2O).
    6. Bland og læs absorbans for at generere standardkurven. Tilsæt 800 μL H2O til Bradford-reagensrøret til emnet, og start timeren. Så effektivt som muligt uden at lave bobler blandes 800 μL af hver BSA-standard med 200 μL Bradford-reagens i de forberedte rør. Når alle standarderne er blevet blandet med Bradford-reagens (< 5 minutter), hældes hver standard i en engangskuvette og aflæses absorbansen ved 600 nm i spektrofotometeret efter blankning af maskinen.
      BEMÆRK: Den samme kuvette kan bruges til at læse hele serien, hvis den mindst koncentrerede standard læses først, og kuvetten er godt tømt mellem læsningerne. Gentag standardkurven, indtil den lineære tilpasning har en R-værdi på mindst 0,99. Først efter pipettering og blid blanding er mestret, fortsæt med at læse prøver.
  2. Mål koncentrationer af actin og actinbindende proteiner
    1. I 2 ml rør indeholdende 2.000 μL H 2 O (fremstillet i trin 3.1.3) blandes forsigtigt i følgende:2μL hver af Arp2/3 kompleks og profilin, 4 μL mærket G-actin, 5 μL hver af gelsolin og VCA og 8 μL capping protein (human rekombinant). Der tages straks 800 μL af opløsningen og blandes med det allerede tilberedte Bradford-reagens, og gentag derefter for at have to aflæsninger inden for 5%-10 % af hinanden for hver prøve. En større forskel indikerer et problem med gensuspension eller håndtering. Læs inden for få minutter efter blanding med Bradford reagens.
      BEMÆRK: Hvis der anvendes en standardkurve fra en anden dag, skal der kun fremstilles blindprøven fra trin 3.1.6 ud over prøverne.
  3. Koncentrationerne af actin- og actinbindende proteiner beregnes ved hjælp af standardkurven og fortyndingsfaktoren. Gentag målingen for hver ny gensuspension. Molekylvægte til konvertering af mg / ml-aflæsninger opnået via Bradford-assay til μM er: actin 43 kD, Arp2/3-kompleks 224 kD, profilin 15 kD, gelsolin 95 kD, cappingprotein 68 kD (human rekombinant) eller 63,5 kD (muserekombinant), VCA 43 kD og SpVCA 54 kD (monomer molekylvægt).

4. Belægning af perler

  1. Centrifugen nedkøles til 4 °C, og den omrørende tørre blok (se materialetabellen) indstilles til 18 °C.
  2. Perlerne vaskes: pipetter 50 μL Xb-buffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, tilsæt 9 μL perleophæng med en diameter på 4,5 μm eller 2 μL perleophæng med en diameter på 1 μm (2,5 % w/v suspension) (se materialetabel). Prøverne blandes grundigt, og prøverne centrifugeres ved 20 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    BEMÆRK: Det samlede perleoverfladeareal i begge perlestørrelser er 3 cm2:
    Equation 1
    afledt ved at beregne antallet af perler og derefter deres samlede overflade ved hjælp af klassiske ligninger for kuglernes volumen og overfladeareal. Andre størrelser af perler kan bruges, hvis mængderne justeres for at holde det samlede overfladeareal konstant på 3 cm2.
  3. Overtræk perlerne: Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre perlerne, og suspender perlepillen i 40 μL 2 μM SpVCA (eller 7 μM VCA) i Xb-buffer ved blid pipettering. Agitat ved 18 °C, 1.000 omdr./min. i 20 min.
  4. Overtrukne perler vaskes: Centrifuger blandingen (20.000 x g i 10 minutter ved 4 °C) og fjern forsigtigt supernatanten. Perlerne suspenderes i 50 μL kold Xb/1% BSA og centrifugeres ved 20.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten, og gentag vasketrin 1x.
  5. Den overtrukne perlepille gensuspenderes fra trin 4,4 i 120 μL kold Xb/1% BSA for begge størrelser perler, således at mængden af perleoverfladeareal/μL perleopløsning er den samme. Opbevares på is i køleskab eller kølerum. Belagte perler vil fortsætte med at fungere normalt i mindst flere uger.

5. Forberedelse af bevægelighedsblandingen og dias til observation

BEMÆRK: Det samlede volumen af bevægelighedsblandingen er 8,4 μL for at give mulighed for ca. 25 μm afstand mellem glideren og 18 mm x 18 mm dækslip, så perler i alle størrelser (op til 10 μm diameter) ikke presses. Den grundlæggende bevægelighedsblanding er ca. 5 μM G-actin (10% mærket fluorescerende actin) med 5 μM profilin, 50 nM Arp2/3 kompleks og 25 nM capping protein (eller 240 nM gelsolin).

  1. Forbered motilitetsreaktionsblandingen. Nøjagtige mængder actin (og derfor profilin) afhænger af koncentrationen beregnet i trin 3.3, men en repræsentativ reaktion er som følger. Bland på is i denne rækkefølge: 3,2 μL MB13, 1,5 μL profilin ved 30 μM fortyndet i MB13, 1 μL cappingprotein ved 0,21 μM fortyndet i MB13 eller gelsolin fortyndet til 2 μM i MB13, 1 μL Arp2/3-kompleks ved 0,47 μM fortyndet i MB13, 0,2 μL perlesuspension (hvirvel lige før brug), og 1,5 μL actin ved 30 μM i G-buffer. Bland godt, men hurtigt, og start timeren.
  2. Få øje på hele bevægelighedsreaktionsblandingen på et dias. Dæk med en 18 mm x 18 mm dækslip, og forsegl dækslippen med smeltet VALAP med en lille pensel. VALAP er en blanding af lanolin, paraffin og vaselin (se Materialetabel) 1:1:1 efter vægt, smeltet og rørt sammen.

6. Observation af mikroskopi

  1. Overhold straks motilitetsreaktioner ved hjælp af et 100x mål på enten et opretstående eller et omvendt mikroskop (se Materialetabel), udstyret med fasekontrast og / eller epifluorescensmikroskopi (GFP-terning, se Materialetabel). Observationer udføres ved stuetemperatur (23-25 °C).
    1. For at opnå gennemsnitlige forskydningshastigheder for en hel population af perler skal du registrere fasekontrast eller fluorescerende stillbilleder over tid ved at scanne hele diaset. Mål kometlængde i hånden og plot versus tid. Hældningen af den lineære pasform er den gennemsnitlige væksthastighed.
    2. For at evaluere hastigheden af individuelle perler skal du indsamle time-lapse-film i fasekontrastmikroskopi. Afhængigt af perlehastigheden og den krævede opløsning skal du tage rammer hver 1-10 s. Brug sporingsværktøjet i ethvert billedbehandlingsprogram til at opnå perlehastigheder og baner.

Representative Results

Et af nøgleaspekterne ved reproducerbar oprettelse af actinkometer på perler er skånsom og præcis pipettering af sarte actinbindende proteiner. Generering af en Bradford-standardkurve er en god måde at evaluere pipetteringsevner på. Figur 1A, B viser rørene til standardkurven og et eksempel på, hvordan de to serielle fortyndinger af BSA ser ud, når de er blandet med Bradford-reagens. Bemærk den graduerede blå nuance (højere proteinkoncentration giver en blåere opløsning). Når de aflæses i spektrofotometeret og plottet, giver disse opløsninger en standardkurve som vist i figur 1C. For at øve omhyggelig pipettering skal analysen gentages, indtil den lineære korrelationsfaktor er 0,999, som vist.

Når koncentrationerne af kommercielle resuspenderede proteiner er blevet omhyggeligt evalueret via Bradford-analysen, fremstilles og blandes coatede perler og motilitetsblanding sammen. Figur 2A viser repræsentative billeder af de forskellige stadier af kometdannelse: actinskyer dannes inden for få minutter efter blanding af SpVCA-belagte perler og bevægelighedsmedium; Skypolarisering sker ved ~5 min og kometproduktion ved 15-20 min. Actinkometer, der er synlige med både epifluorescens og fasekontrastmikroskopi (figur 2A), fortsætter med at forlænge i mange timer, men en ensartet hastighed opretholdes ikke, så perlemotilitet vurderes normalt inden for 1 time. På den anden side tager det 30 minutter med VCA-belagte perler at opnå lyse actinskyer (figur 2B), og der dannes ingen kometer, selvom symmetrien begynder at bryde ved 1-2 timer (pil i figur 2B) og skyer viser polarisering efter inkubation natten over.

Figur 3 viser et eksempel på evaluering af perlehastighed i nærværelse af capping protein. Da alle perler bryder symmetri på omtrent samme tid, udføres "pseudo-time-lapse" -optagelser, hvor diaset scannes, og billeder af hele bestanden af kometer tages over tid (figur 3A). Kometer depolymeriserer ikke; derfor kan stigningen i kometlængder målt over tid bruges til at beregne forskydningshastighed (figur 3B). Gelsolin kan bruges i stedet for capping protein til kometdannelse, hvis der tilsættes 10x mere gelsolin for at kompensere for dets reducerede capping-aktivitet. Kometer dannet i nærværelse af gelsolin er kvalitativt de samme og bevæger sig med omtrent samme hastigheder som perler med capping protein (figur 3C). Capping-aktivitet er nøglen til at koncentrere polymerisation på overfladen af perlen, og når hverken capping protein eller gelsolin er inkluderet i motilitetsblandingen, polariserer actinskyer aldrig for at danne kometer, selvom lyse actinskyer dannes omkring perlerne (figur 3D). Kometer på perler kan bruges til at måle actinbaseret kraftproduktion i forskellige biokemiske sammenhænge ved at ændre motilitetsblandingen og observere resultatet på motilitet ved hjælp af forskellige mikromanipulationsteknikker, for eksempel15.

Figure 1
Figur 1: Bradford standardkurve. (A) Billede af, hvordan man opsætter rørene til fremstilling af Bradford-standardkurven. Prøverør vises ikke. (B) Billede af de to overlappende BSA-seriefortyndinger, der engang blev blandet med Bradford-reagens. C) Absorbanserne ved 600 nm af de i (B) anførte opløsninger måles i spektrofotometeret og afbildes som funktion af proteinkoncentrationerne i BSA-opløsningerne. Den lineære pasform bruges til at beregne prøvekoncentrationen. Korrelationsfaktoren, R, for den lineære pasform er 0,999. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kometdannelse på SpVCA-belagte perler i modsætning til VCA-belagte perler. (A) Repræsentative SpVCA-belagte perler (forskellige perler på hvert billede) vist over tid. Tid fra blandingstidspunktet er angivet. Actinskyer dannes straks, og skypolarisering giver kometer, som fortsætter med at forlænge i timevis. (B) Repræsentative VCA-belagte perler (forskellige perler på hvert billede) vist over tid. Mere end 1 time er nødvendig for at se begyndelsen af actin sky polarisering (pil) og selv lange inkubationer producerer ikke kometer. Alle billeder er af perler med en diameter på 4,5 μm, epifluorescensbilleddannelse af fluorescerende actin parret med fasekontrastvisualisering for tidspunkterne på 15 og 20 minutter i (A), skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kometer og perlehastighedsanalyse . (A) og (C) I nærværelse af enten capping protein (CP) eller gelsolin polariserer actinskyer for at danne kometer i de første 20 minutter af reaktionen, og kometer forlænges over tid. Tid fra blanding angivet for hvert billede; Hvert billede er en anden perle. Der er en vis variation mellem perler og tilberedning, men i gennemsnit bevæger perler sig ved mikron/submikron pr. min. hastigheder (0,2-1 μm/min) under de standardbetingelser, der er beskrevet her. (B) Repræsentativ graf, der viser evaluering af kometlængden (hele bestanden af perler) over tid. Hældningen af den lineære korrelation svarer til den gennemsnitlige forskydningshastighed, i dette tilfælde 0,24 μm/min. (D) I fravær af capping-aktivitet (ingen capping-protein eller gelsolin) dannes actinskyer omkring perler, men kometer dannes ikke. Alle billeder er af perler med en diameter på 4,5 μm, epifluorescensbilleddannelse af fluorescerende actin, skalastænger = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Protokollen, der er beskrevet her, beskriver, hvordan man opnår actinnetværksvækst på perleoverflader, kometdannelse og perlemotilitet ved hjælp af kommercielt tilgængelige proteiner. Imidlertid observeres kometer undertiden ikke reproducerbart eller er inhomogene mellem diaset og dækslip. Den følgende diskussion understreger nogle nøglepunkter i protokollen og foreslår nogle parametre, der kan justeres. En faktor, man skal huske på, er, at kometdannelse og perlehastighed påvirkes af temperaturen, hvor temperaturer meget over 25 °C eller meget under 23 °C påvirker kometdannelsen negativt og giver uoprettelige data. Brug af et temperaturstyret mikroskop eller et mikroskop i et klimakontrolleret rum anbefales kraftigt. Selvom fluorescerende mærket actin ofte er inkluderet i motilitetsblandingen for at observere kometer ved fluorescensmikroskopi, når kometer er mere end en perlediameter i længden, er de også synlige ved fasekontrastmikroskopi som en mørk udstrygning ved siden af perlen. Fasekontrastvisualisering er mere passende til time-lapse-billeddannelse, da en vis fototoksicitet er forbundet med fluorescensbilleddannelse, selv via roterende disk. Fordi perler sætter sig over tid, producerer et omvendt mikroskop mindre vandret perledrift end en opretstående og er mere passende til film. Brugen af smeltet VALAP til at forsegle dias er vigtig, da stoffer som neglelak forstyrrer kometdannelsen. Store mængder VALAP kan fremstilles i et bægerglas og derefter skovles ud for at genopfylde mindre bægerglas, der er mere modtagelige for hurtig smeltning. VALAP er god i årevis ved stuetemperatur.

Et andet vigtigt teknisk aspekt er omhyggelig forberedelse af buffer og motilitetsblanding. Der skal udvises forsigtighed ved tilberedning af MB13, især ved pH-justeringstrinnet. PH-værdien i MB13 bør justeres hurtigt til neutral med NaOH for at undgå ATP-hydrolyse, men ikke for hurtigt, da EGTA opløses, når pH-værdien nærmer sig neutral. EGTA er en vigtig ingrediens, fordi det komplekser calcium bundet til actin, hvilket giver i motilitetsblandingen den mere aktive magnesiumform16. MB13 forberedt for hurtigt eller for langsomt giver suboptimal kometdannelse eller endda slet ingen. Et yderligere nøglepunkt er at holde nøje styr på KCl-koncentrationen i motilitetsblandingen, når man leger med forholdene. For eksempel, når der anvendes 1x MB13 i reaktionsblandingen og fortynding af profilin, capping protein og Arp2/3-komplekset i MB13, er den endelige KCl-koncentration i motilitetsreaktionen ca. 40-50 mM på grund af fortynding med G-buffer. Denne koncentration giver de bedste resultater i kometanalysen, og mere end 60 mM KCl nedsætter Arp2/3 kompleks nukleeringsaktivitet.

På proteinsiden af tingene er et kritisk teknisk aspekt ved opnåelse af actinkometer korrekt håndtering af kommercielle actinbindende proteiner, især præcis pipettering af mikrolitermængder. Lineariteten af Bradford-standardkurven er en god test af pipettering, og kurven kan derefter bruges til rutinemæssige målinger af proteinkoncentrationer. Når der anvendes resuspenderede kommercielle proteiner til kometproceduren, er det faktisk vigtigt altid at verificere proteinkoncentrationer, da batchvariation og brugerfejl under resuspension kan føre til forskelle mellem reelle og forventede koncentrationer. Nogle gange kan små forskelle i proteinkoncentrationer føre til fuldstændig fravær af kometer.

Et andet vigtigt aspekt af metoden, der præsenteres her, er brugen af profilinkomplekset G-actin som brændstof til polymerisation. Historisk set anvendte in vitro-systemer præpolymeriseret filamentøs actin (F-actin) som actinkilde: depolymerisering i bulkfodret polymerisation på overfladen10,17. Dette havde fordelen ved at kontrollere G-actin-niveauer, men tilføjede et lag af kompleksitet, der krævede yderligere komponenter for at katalysere depolymerisering. Da omsætning af actin-netværket ikke er nødvendig for kraftproduktion og motilitet, som drives af kimdannelse og polymerisation på overfladen af perlen, mens actin-depolymeriseringsfaktorer som ADF / cofilin virker på de gamle netværk langt fra overfladen18, udføres det meste in vitro-rekonstitution af actinbaseret motilitet nu uden omsætning for enkelhed. Der er dog nogle ulemper ved at bruge G-actin. For det første er oligomerer til stede, når man bruger kommerciel actin, som er blevet lyofiliseret. Depolymeriseringstrinnene beskrevet her er meget vigtige for at opnå reproducerbare resultater. Selvom G-buffer traditionelt er justeret til pH 8, synes lavere pH (f.eks. pH 7) at fungere bedre i de assays, der er beskrevet i denne artikel, muligvis fordi lav pH forbedrer depolymerisering19. En anden ulempe ved at bruge G-actin er, at når den først er placeret under saltforhold, der er tilladelige for polymerisation, forekommer spontan kimdannelse, og F-actin dannes i bulk såvel som på perleoverfladen. Kompleksdannelse af G-actin med profilin undertrykker spontan kimdannelse i bulk og spids endepolymerisation og derved fokuserer både kimdannelse og pigtrådspolymerisation på overfladen20. Profilin-G-actin er fysiologisk relevant, da meget af actinet i cellen er til stede i denne form21. Her bruges et 1:1-forhold mellem profilin:actin; imidlertid hæmmer højere forhold (for eksempel 3: 1) mere grundigt polymerisation i bulk, selvom højere forhold også hæmmer Arp2/3-komplekset og pigtrådsforlængelsen til en vis grad22,23.

Capping-aktivitet er også nøglen til kometdannelse, da det sikrer indsættelse af nyt actin på overfladen via kimdannelsescyklusser ved overfladeaktiveret Arp2/3-kompleks24,25. Uden at dække bryder actinskyer ikke symmetri for at danne kometer, fordi polymerisation ved overfladen ikke opbygger nok spænding til at bryde skyen op26. Tidligere har vi brugt hjemmerenset rekombinant musehætteprotein13, men test udført til denne artikel indikerer, at kommercielt tilgængeligt rekombinant humant cappingprotein er lige så effektivt, som det er kommercielt tilgængeligt gelsolin, selvom der skal anvendes 10x mere gelsolin, og til visse anvendelser er det muligvis ikke hensigtsmæssigt, da det har actin-afskæringsaktivitet samt capping27.

Endelig ligger robustheden af denne metode i brugen af en meget aktiv Arp2/3 kompleks aktivator, streptavidin-pVCA (SpVCA)28. SpVCA inkluderer profilin-G-actin-bindingsdomænet for WASP (p-domænet) ud over Arp2/3-kompleksbindingsdomænet, da dette viser sig at være mest effektivt under profilin-G-actin-forhold29. Endnu vigtigere er det, at brugen af streptavidin-mærket, der oprindeligt blev introduceret for at tillade overfladefunktionalisering via biotin-streptavidin-linket, har den yderligere virkning at øge Arp2/3-kompleksaktiveringen, formodentlig på grund af det faktum, at streptavidin er en tetramer og dermed klynger aktivatoren, kendt for at øge Arp2/3 kompleks aktivitet30 . Kommercielt produceret SpVCA er i øjeblikket under udvikling og vil snart kunne købes. Det skal endvidere bemærkes, at selvom 40 μL 2 μM SpVCA rutinemæssigt bruges til at belægge 3 cm2 perleoverflade, fungerer andre belægningskoncentrationer (højere og lavere) også, og at lege med disse forhold giver forskellige kometvæksthastigheder og morfologier. Når der ikke dannes kometer, eller kometstørrelsen ikke er homogen på rutsjebanen, bør der testes forskellige belægningsforhold samt forskellige KCl- og profilinkoncentrationer i motilitetsblandingen. Koncentrationerne af actin, Arp2/3-kompleks og capping-protein i motilitetsblandingen kan også ændres for at optimere kometdannelsen, men i vores hænder giver ændring af disse proportioner ofte forvirrende resultater.

Afslutningsvis producerer de her beskrevne metoder actinsamling på perleoverflader og bevægelighed, men enhver overflade, der kan funktionaliseres med SpVCA, kan bruges. I tilfælde, hvor adsorption som beskrevet her ikke virker, kan streptavidin-delen bruges til at fastgøre SpVCA til overfladen af interesse efter biotinylering. De således dannede actinstrukturer, kometer eller på anden måde, kan bruges til at teste forskellige biokemiske og biofysiske aspekter af actinnetværk og er især velegnede til fysiske manipulationer med mikropipetter, optisk pincet og laserablationer 15,26,31,32. Ud over dets anvendelser for forskersamfundet er den tilgang, der er beskrevet her, passende som et undervisningsværktøj for bachelorstuderende i biofysik til at studere aktive stofbegreber som symmetribrud og selvorganisering.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter med indholdet af denne artikel.

Acknowledgments

Vi anerkender oprigtigt medlemmerne af vores nye hjem på LPENS for deres varme velkomst, og især ABCDJ-teamet for al deres hjælp og støtte. J.P. anerkender økonomisk støtte fra Foundation ARC (Grant PJA 20191209604), og CS anerkender økonomisk støtte fra Human Frontiers Science Program Organization (Grant RGP0026/2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin, rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate  Invitrogen (ThermoFisher Scientific) A12373 (recently discontinued) This product can be replaced with ATTO-488 actin from Hypermol.
Actin, rabbit muscle, ATTO-488 Hypermol 8153
Actin, rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99
Arp2/3 complex Cytoskeleton RP01P
ATP Sigma A7699
BioSpectrometer, basic Eppendorf 035739
Bradford Reagent Bio-Rad 500-0006
BSA, high quality Sigma A3059
BSA standard 2 mg/mL (Pierce) Thermo Scientific 23209
Capping protein (a1b2, mouse recombinant) Home-purified (Reference 13) This product will soon be commercially available from Cytoskeleton.
Capping protein (a1b2, human recombinant) Hypermol 8322
Cube, GFP: U-MNIBA3 or U-MWB2 Olympus discontinued Any GFP cube, adapted to the microscope being used, can be used.
Dry block, agitating: ThermoMixer C (refrigerated) Eppendorf 035963
** with SmartBlock, 24 microtubes 2 mL Eppendorf 035969
Gelsolin (human recombinant, His-tagged) Cytoskeleton HPG6
Lanolin Sigma 49909
Microcentrifuge 5427R + rotor Eppendorf 934126
Microscope, upright: BX51 Olympus discontinued Any epifluorescence upright microscope equipped with phase contrast optics can be used.
Microscope, inverted: IX70 Olympus discontinued Any epifluorescence inverted microscope equipped with phase contrast optics can be used.
Paraffin Sigma 76244
Petroleum jelly: Vaseline Sigma 16415
Pipettes Research Plus Eppendorf Gilson pipettes don't work as well for delivery of very small volumes (0.5 µL for example).
**10 µL 933954
**2.5 µL 933953 These two sizes are essential, but the use of high-quality pipettes (a full Research Plus set for example) is recommended.
Polystyrene carboxylate beads Polysciences
**approx. 1 µm diameter 08226
**approx. 4.5 µm diameter 17140-5
Profilin 1 (human recombinant, untagged) Cytoskeleton PR02
SpVCA (human WASP pVCA domain, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag) Home-purified (Reference 14) This product will soon be commercially available from Cytoskeleton.
VCA (human WASP VCA domain, GST-tagged) Cytoskeleton VCG03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campellone, K. G., Welch, M. D. A nucleator arms race: cellular control of actin assembly. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 237-251 (2010).
  2. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).
  3. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture and mechanics in cell motility. Physiological Reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
  4. Tilney, L. G., Tilney, M. S. The wily ways of a parasite: induction of actin assembly by Listeria. Trends in Microbiology. 1 (1), 25-31 (1993).
  5. Moore, A. S., et al. Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis. Nature. 591 (7851), 659-664 (2021).
  6. Taunton, J., et al. Actin-dependent propulsion of endosomes and lysosomes by recruitment of N-WASP. Journal of Cell Biology. 148 (3), 519-530 (2000).
  7. Velarde, N., Gunsalus, K. C., Piano, F. Diverse roles of actin in C. elegans early embryogenesis. BMC Developmental Biology. 7, 142 (2007).
  8. Merrifield, C. J., et al. Endocytic vesicles move at the tips of actin tails in cultured mast cells. Nature Cell Biology. 1 (1), 72-74 (1999).
  9. Samarin, S., et al. How VASP enhances actin-based motility. Journal of Cell Biology. 163 (1), 131-142 (2003).
  10. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  11. Boujemaa-Paterski, R., et al. Network heterogeneity regulates steering in actin-based motility. Nature Communications. 8 (1), 655 (2017).
  12. Akin, O., Mullins, R. D. Capping protein increases the rate of actin-based motility by promoting filament nucleation by the Arp2/3 complex. Cell. 133 (5), 841-851 (2008).
  13. Palmgren, S., Ojala, P. J., Wear, M. A., Cooper, J. A., Lappalainen, P. Interactions with PIP2, ADP-actin monomers, and capping protein regulate the activity and localization of yeast twinfilin. Journal of Cell Biology. 155 (2), 251-260 (2001).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 368 (1629), 20130005 (2013).
  15. Marcy, Y., Prost, J., Carlier, M. -F., Sykes, C. Forces generated during actin-based propulsion: a direct measurement by micromanipulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 5992-5997 (2004).
  16. Carlier, M. -F. Actin: protein structure and filament dynamics. Journal of Biological Chemistry. 266 (1), 1-4 (1991).
  17. Loisel, T. P., Boujemaa, R., Pantaloni, D., Carlier, M. F. Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins. Nature. 401 (6753), 613-616 (1999).
  18. Reymann, A. -C., et al. Turnover of branched actin filament networks by stochastic fragmentation with ADF/cofilin. Molecular Biology of the Cell. 22 (14), 2541-2550 (2011).
  19. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Quantitative variations with pH of Actin Depolymerizing Factor/Cofilin's multiple actions on actin filaments. Biochemistry. 58 (1), 40-47 (2019).
  20. Plastino, J., Blanchoin, L. Dynamic stability of the actin ecosystem. Journal of Cell Science. 132 (4), 219832 (2019).
  21. Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
  22. Suarez, C., et al. Profilin regulates F-actin network homeostasis by favoring formin over Arp2/3 complex. Developmental Cell. 32 (1), 43-53 (2015).
  23. Courtemanche, N., Pollard, T. D. Interaction of profilin with the barbed end of actin filaments. Biochemistry. 52 (37), 6456-6466 (2013).
  24. Achard, V., et al. A "primer"-based mechanism underlies branched actin filament network formation and motility. Current Biology. 20 (5), 423-428 (2010).
  25. Sykes, C., Plastino, J. Actin filaments up against a wall. Nature. 464 (7287), 365-366 (2010).
  26. vander Gucht, J., Paluch, E., Plastino, J., Sykes, C. Stress release drives symmetry breaking for actin-based movement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7847-7852 (2005).
  27. McGough, A. M., Staiger, C. J., Min, J. -K., Simonetti, K. D. The gelsolin family of actin regulatory proteins: modular structures, versatile functions. FEBS Letters. 552 (2-3), 75-81 (2003).
  28. Abou-Ghali, M., et al. Capping protein is not necessary for polarized actin network growth and actin based motility. Journal of Biological Chemistry. 295, 15366-15375 (2020).
  29. Yarar, D., D'Alessio, J. A., Jeng, R. L., Welch, M. D. Motility determinants in WASP family proteins. Molecular Biology of the Cell. 13 (11), 4045-4059 (2002).
  30. Padrick, S. B., et al. Hierarchical regulation of WASP/WAVE proteins. Molecular Cell. 32 (3), 426-438 (2008).
  31. Bussonier, M., et al. Mechanical detection of a long-range actin network emanating from a biomimetic cortex. Biophysical Journal. 107 (4), 854-862 (2014).
  32. Paluch, E., vander Gucht, J., Joanny, J. -F., Sykes, C. Deformations in actin comets from rocketing beads. Biophysical Journal. 91 (8), 3113-3122 (2006).

Tags

Bioengineering udgave 188
Rekonstitution af actinbaseret bevægelighed med kommercielt tilgængelige proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sykes, C., Plastino, J.… More

Sykes, C., Plastino, J. Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64261, doi:10.3791/64261 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter