تغزو السالمونيلا وتتكاثر داخل الخلايا الظهارية المعوية في كل من الفجوات العصارية الخاصة بالسالمونيلا والحرة في السيتوسول (فرط التكاثر). يتم وصف بروتوكول قائم على الفحص المجهري الفلوري عالي الإنتاجية هنا لتحديد الأنماط الظاهرية داخل الخلايا للسالمونيلا من خلال تحليلين متكاملين للصور من خلال ImageJ ، للوصول إلى دقة الخلية الواحدة والتسجيل.
السالمونيلا هو أحد مسببات الأمراض المعوية القادرة على غزو ظهارة الأمعاء والتكاثر في الخلايا المعوية ، سواء داخل فجوات خاصة بالسالمونيلا أو حرة في السيتوسول (فرط التكاثر الخلوي). هذه الأنماط الظاهرية المختلفة للتكاثر داخل الخلايا تدفع إلى مسارات مختلفة من التسبب في المرض ، أي أن فرط التكاثر الخلوي يؤدي إلى موت الخلايا الالتهابية وقذفها في تجويف الأمعاء ، بينما يؤدي التكرار الفراغي إلى اختراق عبر الظهارة والانتشار الجهازي. تم بذل جهد كبير لإنشاء أدوات الفحص المجهري لدراسة سلوك السالمونيلا داخل الخلايا الغازية ، مثل بلازميد مراسل مضان pCHAR-Duo الذي يسمح بالتمييز بين البكتيريا الفراغية والخلوية عن طريق التعبير التفاضلي ل mCherry و GFP. ومع ذلك ، غالبا ما يتم تسجيل الأنماط الظاهرية داخل الخلايا يدويا ، وهو إجراء يستغرق وقتا طويلا ويقصر التحليل على عدد صغير من العينات والخلايا. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير تحليلين مكملين وآليين للصور باستخدام ImageJ ، وهو برنامج تحليل صور متاح مجانا. في بروتوكول الإنتاجية العالية ، أصيبت الخلايا الظهارية بالسالمونيلا التي تحمل pCHAR-Duo باستخدام 96 لوحة بئر. تم إجراء التصوير باستخدام مجهر مضان آلي. بعد ذلك ، تم تطبيق طريقتين لتحليل الصور لقياس السلوك داخل الخلايا للسالمونيلا على مستويات تفصيلية مختلفة. تقيس الطريقة الأولى الحمل البكتيري الكلي داخل الخلايا ومدى فرط التكاثر الخلوي. إنه سريع ويسمح بتسجيل عدد كبير من الخلايا والعينات ، مما يجعله مناسبا للفحوصات عالية الإنتاجية مثل تجارب الفحص. تقوم الطريقة الثانية بإجراء تحليل الخلية الواحدة لتحديد النسبة المئوية للخلايا المصابة ، ومتوسط الحمل الفراغي للسالمونيلا ، ومعدل التكاثر المفرط للخلايا الخلوية مما يعطي تفاصيل أكبر حول سلوك السالمونيلا داخل الخلايا الظهارية. يمكن تنفيذ البروتوكولات بواسطة نصوص ImageJ المصممة خصيصا لتشغيل تحليلات الدفعات تلقائيا للخطوات الرئيسية لتفاعل السالمونيلا المعوي.
السالمونيلا هي العامل البكتيري الأكثر شيوعا الذي يتسبب في تفشي الأمراض المنقولة بالغذاء في الاتحاد الأوروبي1. المظهر المرضي الأساسي لعدوى السالمونيلا هو التهاب الأمعاء ، وهو نتيجة لسلوك الممرض في الأمعاء بعد الابتلاع وما يترتب على ذلك من استجابة التهابية محلية2. ومع ذلك ، يمكن أن تنتشر السالمونيلا أيضا إلى مواقع خارج الأمعاء وتسبب عدوى جهازية ، خاصة في الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة. نوع التفاعل بين السالمونيلا وظهارة الأمعاء شروط نتيجة العدوى. بمجرد دخول تجويف الأمعاء ، تغزو السالمونيلا وتتكاثر داخل الخلايا الظهارية المعوية. على المستوى داخل الخلايا ، يمكن أن تقدم السالمونيلا نمطين ظاهريين مختلفين للتكرار ، فرط التكاثر الخلوي والتكرار البطيء داخل الفراغ داخل الفجوات العصارية المحتوية على السالمونيلا (SCVs). يؤدي فرط التكاثر الخلوي إلى موت الخلايا المضيفة الالتهابية وقذف السالمونيلا في تجويف الأمعاء3 ؛ يؤدي التكرار الفراغي إلى اختراق عبر الظهارة والانتشار الجهازي4. لذلك ، فإن مدى الغزو والتكاثر الفراغي مقابل التكاثر الخلوي يؤثر على مسار العدوى.
جنس السالمونيلا متنوع للغاية ، بما في ذلك الآلاف من الأنماط المصلية ذات النطاقات المضيفة المختلفة والقدرات على التسبب في المرض. على سبيل المثال ، S. يعرف التيفيموريوم بأنه مصل عام ، لأنه يصيب العديد من المضيفين غير المرتبطين ، ويمثل أحد الأسباب الرئيسية لداء السلمونيلات البشري. بشكل مختلف ، س. يعتبر ديربي مصليا متكيفا مع الخنازير ، حيث يتم عزله في الغالب عن الخنازير ، ولكن يتم الإبلاغ عنه أيضا في المراكز الخمسة الأولى من المصل المسؤول عن العدوى البشرية1. ومع ذلك ، فإن المعرفة حول السلوك البكتيري داخل الخلايا الظهارية تقتصر بشكل أساسي على دراسة بعض السلالات المرجعية ، مثل S. التيفيموريوم SL1344 ، التي لا تمثل التنوع الطبيعي الشاسع لإمراضية السالمونيلا . إن توصيف تفاعل سلالات مختلفة من السالمونيلا مع الخلايا الظهارية من شأنه أن يساهم في فهم إمراضيتها المختلفة. لهذا السبب ، تم تطوير بروتوكول قائم على الفحص المجهري الفلوري عالي الإنتاجية لتحليل السلوك داخل الخلايا لعدد كبير من السلالات بطريقة سريعة وآلية إلى حد كبير. في هذا البروتوكول ، تم إجراء عدوى الخلايا الظهارية في 96 لوحة تصوير جيدة وتم الحصول على الصور باستخدام مجهر مضان آلي. تم استخدام بلازميد pCHAR-Duo لمراقبة الأنماط الظاهرية للغزو والتكرار للسالمونيلا داخل الخلايا الظهارية من خلال الفحص المجهري الفلوري5. يحمل هذا البلازميد الجين الذي يشفر المراسل الفلوري الأحمر mCherry ، الذي يتم التعبير عنه بشكل أساسي من قبل جميع الخلايا البكتيرية المحولة ، والجين الذي يشفر مراسل الفلورسنت الأخضر GFP ، الذي يتم تنشيط تعبيره بواسطة الجلوكوز 6 فوسفات الموجود حصريا في السيتوسول للخلايا حقيقية النواة والغائب في SCVs. لذلك ، يسمح البلازميد بالتمييز بين البكتيريا الفراغية والخلوية عن طريق التعبير التفاضلي لمراسلي mCherry و GFP.
عادة ما يتم قياس البكتيريا الفراغية والخلوية في صور الفحص المجهري عن طريق التسجيل اليدوي6 ، ولكن هذه طريقة تستغرق وقتا طويلا وتقصر التحليل على عدد صغير من العينات. لذلك ، تم تطوير تحليلين متكاملين وآليين للصور وتحليل المنطقة وتحليل الخلية الواحدة باستخدام ImageJ7 ، وهو برنامج تحليل صور متاح مجانا. يقيس تحليل المنطقة الحمل البكتيري الكلي داخل الخلايا ومدى فرط التكاثر الخلوي باستخدام بيانات المناطق التي تشغلها الخلايا الظهارية والسالمونيلا الحمراء والخضراء في كل صورة مجهرية مكتسبة. يمكن تطبيق هذه الطريقة على الصور التي تم الحصول عليها عند التكبير المنخفض ؛ لذلك ، فإنه يسمح بتسجيل عدد كبير من الخلايا الظهارية مع عدد قليل من الصور ، وتقصير وقت الاستحواذ. يستخدم تحليل الخلية الواحدة تجزئة الخلية لتحديد النسبة المئوية للخلايا المصابة ، ومتوسط الحمل الفراغي ، والنسبة المئوية للخلايا المصابة التي تخضع لفرط التكاثر الخلوي بدقة خلية واحدة.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف جميع خطوات تحليل الصور بالتفصيل ليتم إجراؤها يدويا ، ولكن يمكن أتمتة نفس التحليل بواسطة نصوص ImageJ النصية المصممة خصيصا. تسمح هذه البرامج النصية أيضا بتشغيل تحليلات الدفعات لتحليل صور متعددة تلقائيا وبالتالي تسريع تنفيذ الطريقة.
الطريقة التي تستعمر بها السالمونيلا الخلايا الظهارية المعوية ، تؤثر على نتيجة العدوى. عند الغزو ، يؤدي فرط التكاثر الخلوي إلى التهاب الأمعاء3 ، في حين أن التكرار الفراغي يمكن أن يؤدي إلى انتشار جهازي4. يمكن أن تختلف سلالات السالمونيلا في قدرتها على غزو وتكاثر الخلايا الظهارية المعوية9. في الواقع ، السالمونيلا هو جنس متنوع للغاية يضم أكثر من 2500 مصل ، والتي لها قدرات مختلفة على التسبب في المرض. بالإضافة إلى ذلك ، السالمونيلا هي السبب الأكثر شيوعا لتفشي الأمراض المنقولة بالغذاء في الاتحاد الأوروبي ، مما يشير إلى انتشار كبير في السكان البشريين1. لذلك ، فإن توافر طرق موثوقة وعالية الإنتاجية للقياس الكمي للأنماط الظاهرية داخل الخلايا للسالمونيلا له أهمية كبيرة لتقييم الاختلافات في الفوعة بين أعداد كبيرة من سلالات السالمونيلا والسماح في نهاية المطاف بإجراء تقييم دقيق ومحدد للمخاطر الخاصة بالسلالة لهذا العامل الممرض.
يقيس البروتوكول الموصوف هنا سلوك السالمونيلا داخل الخلايا الظهارية بطريقة سريعة وآلية. يتم إجراء عدوى الخلايا الظهارية في 96 لوحة دقيقة للتصوير ويستخدم مجهر مضان آلي للحصول على الصور ، مما يجعل البروتوكول مناسبا للتطبيقات عالية الإنتاجية. يستفيد هذا البروتوكول من بلازميد pCHAR-Duo ، والذي يسمح بالتمييز بين الفراغ والسالمونيلا الخلوية من خلال التعبير التفاضلي لاثنين من مراسلي الفلورسنت5. غالبا ما يتم تحليل الأنماط الظاهرية داخل الخلايا للسالمونيلا عن طريق التسجيل اليدوي ، وهو إجراء يستغرق وقتا طويلا وغير مناسب لتحليل أعداد كبيرة من السلالات ومزارع الخلايا لكل سلالة وعرضة لأخطاء المشغل والاختلاف بين المشغلين. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير تحليلين مكملين وآليين للصور ، تحليل المنطقة وتحليل الخلية الواحدة. تم استخدام ImageJ ، وهو برنامج متاح مجانا ، لتطوير التحليلين. من أجل تسريع تنفيذ البروتوكول ، يتم توفير نصوص ImageJ لتحليل الدفعات لملفات الاستحواذ المتعددة دون تدخل المشغل كملفات تكميلية.
تم تصميم تحليل المنطقة لتحديد ، في بضع خطوات ، الاستعمار الكلي للخلايا الظهارية (نسبة العدوى) ومستوى التكاثر المفرط (نسبة التكاثر المفرط) من خلال قياس المناطق التي تشغلها على وجه التحديد نوى الخلايا الظهارية والسالمونيلا التي تعبر إما عن mCherry أو mCherry مع GFP. يتم تطبيق تحليل المنطقة على الصور التي تم الحصول عليها عند التكبير المنخفض ، حيث يتم التركيز على كل من السالمونيلا الفراغية والمفرطة التكرار في نفس المستوى z ، ويتم عرض عدد كبير من الخلايا الظهارية لكل مجال مجهري ، مما يقلل من حجم وعدد ملفات الاستحواذ. يسمح تحليل المنطقة بإجراء تحليل آلي وسريع وخفيف حسابيا لعدد كبير من العينات ، مما يجعله مناسبا للمقايسات عالية الإنتاجية مثل تجارب الفحص.
تم تصميم تحليل الخلية الواحدة لتحديد الأنماط الظاهرية للسالمونيلا داخل الخلايا الظهارية بدقة خلية واحدة ، والتي تم الحصول عليها من خلال تجزئة الخلية وقياس المنطقة الخلوية والنسبة المئوية للمساحة التي تشغلها السالمونيلا الفراغية والخلوية المفرطة التكاثر. يتم هنا تقسيم الاستعمار الكلي للخلايا الظهارية التي تتميز من خلال تحليل المنطقة إلى ثلاثة معلمات كمية ، النسبة المئوية للخلايا المصابة ، ومتوسط الحمل الفراغي ، ومعدل التكرار المفرط ، مما يسمح بتقييم وقياس مساهمة كل نمط ظاهري في الاستعمار الكلي ، وبالتالي استكمال نتائج تحليل المنطقة. تأتي التفاصيل الأكبر التي يقدمها تحليل الخلية الواحدة على حساب الحصول على الصور وتحليلها بشكل أبطأ. في الواقع ، من أجل تحقيق دقة خلية واحدة ، يتم الحصول على الصورة عند التكبير العالي. هذا يعني أن هناك حاجة إلى مستويات z متعددة لمراقبة كل من السالمونيلا الفراغية والخلوية في التركيز وأن اكتساب عدد كبير من الحقول لكل عينة ضروري لتسجيل عدد كبير من الخلايا الظهارية ، وبالتالي إطالة وقت الاكتساب مقارنة بتحليل المنطقة. علاوة على ذلك ، فإن تحليل العديد من ملفات الاستحواذ الكبيرة يتطلب حسابيا ، وبالتالي يتطلب محطة عمل مناسبة (تم استخدام محطة عمل ذات 6 نواة وذاكرة وصول عشوائي (RAM) بسعة 32 جيجابايت). لذلك ، يمكن استخدام تحليل الخلية الواحدة كمستقل في ظروف الإنتاجية المحدودة أو كطريقة من المستوى الثاني مقترنة بتحليل المنطقة للحصول على فهم أعمق للأنماط الظاهرية للسالمونيلا داخل الخلايا الظهارية.
تم التحقق من صحة التحليلين المتكاملين باستخدام S. تي إم ، س. ديربي الوزن ، و S. Derby ΔsipA ، تم اختياره لأن سلوكهم داخل الخلايا الظهارية كان معروفا بالفعل أنه يختلف من حيث الغزو أو التكرار 9,10. تظهر نتائج تحليلات المنطقة والخلية الواحدة أن البروتوكول سمح بالتمييز الكمي بين الاختلافات في الأنماط الظاهرية للسالمونيلا داخل الخلايا وفقا لخصائص السلالات المختبرة. علاوة على ذلك ، توضح هذه النتائج أن تحليل الخلية الواحدة يسمح بالقياس الكمي لمساهمة كل نمط ظاهري داخل الخلايا (الغزو ، الحمل الفراغي والتكرار الخلوي) في الاستعمار الكلي المسجل باستخدام تحليل المنطقة.
تم تطبيق هذا البروتوكول هنا لدراسة الإمراضية في المختبر لسلالات مختلفة من السالمونيلا ، ولكن يمكن أن يكون لها تطبيقات أخرى مثل دراسة الطفرات العشوائية لتحديد الجينات المشاركة في الغزو و / أو التكاثر داخل الخلايا الظهارية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول لتحليل سلوك السالمونيلا داخل خطوط الخلايا الأخرى غير خلايا INT407. يمكن استخدامه أيضا كنقطة انطلاق لتطوير طرق مماثلة لدراسة تفاعل الخلية الممرضة للكائنات الحية الدقيقة الأخرى داخل الخلايا.
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة أوليفيا ستيل مورتيمر على مشاركة بلازميد pCHAR-Duo. تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الصحة الإيطالية ، ومنح PRC2019014 و PRC2021004.
96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |