La Salmonella invade e si replica all’interno delle cellule epiteliali intestinali sia nei vacuoli specifici della Salmonella che libera nel citosol (iperreplicazione). Un protocollo basato sulla microscopia a fluorescenza ad alta produttività è descritto qui per quantificare i fenotipi intracellulari di Salmonella mediante due analisi di immagini complementari attraverso ImageJ, raggiungendo la risoluzione e il punteggio di una singola cellula.
La Salmonella è un patogeno enterico in grado di invadere l’epitelio intestinale e replicarsi negli enterociti, sia all’interno dei vacuoli specifici della Salmonella che liberi nel citosol (iperreplicazione citosolica). Questi diversi fenotipi di replicazione intracellulare guidano verso diverse vie di patogenesi, cioè l’iperreplicazione citosolica induce la morte e l’estrusione delle cellule infiammatorie nel lume intestinale, mentre la replicazione vacuolare porta alla penetrazione transepiteliale e alla diffusione sistemica. È stato fatto uno sforzo significativo per creare strumenti di microscopia per studiare il comportamento della Salmonella all’interno delle cellule invase, come il plasmide reporter di fluorescenza pCHAR-Duo che consente la discriminazione tra batteri vacuolari e citosolici mediante espressione differenziale di mCherry e GFP. Tuttavia, i fenotipi intracellulari sono spesso valutati manualmente, una procedura che richiede tempo e che limita l’analisi a un piccolo numero di campioni e cellule. Per superare questi limiti, sono state sviluppate due analisi delle immagini complementari e automatizzate utilizzando ImageJ, un software di analisi delle immagini disponibile gratuitamente. Nel protocollo ad alto rendimento, le cellule epiteliali sono state infettate da Salmonella trasportando pCHAR-Duo utilizzando piastre a 96 pozzetti. L’imaging è stato eseguito utilizzando un microscopio a fluorescenza automatizzato. Quindi, sono stati applicati due metodi di analisi delle immagini per misurare il comportamento intracellulare di Salmonella a diversi livelli di dettaglio. Il primo metodo misura la carica batterica intracellulare complessiva e l’estensione dell’iperreplicazione citosolica. È veloce e consente il punteggio di un numero elevato di cellule e campioni, rendendolo adatto per saggi ad alto rendimento come esperimenti di screening. Il secondo metodo esegue l’analisi di singole cellule per determinare la percentuale di cellule infette, il carico vacuolare medio di Salmonella e il tasso di iperreplicazione citosolica fornendo maggiori dettagli sul comportamento di Salmonella all’interno delle cellule epiteliali. I protocolli possono essere eseguiti da script ImageJ appositamente progettati per eseguire automaticamente analisi batch delle fasi principali dell’interazione Salmonella-enterociti.
La Salmonella è l’agente batterico più frequentemente segnalato che causa focolai di malattie di origine alimentare nell’Unione europea1. La principale manifestazione patologica dell’infezione da Salmonella è l’enterite, che è il risultato del comportamento patogeno nell’intestino dopo l’ingestione e della conseguente risposta infiammatoria locale2. Tuttavia, la Salmonella può anche diffondersi in siti extra-intestinali e causare infezioni sistemiche, specialmente in individui immunocompromessi. Il tipo di interazione tra Salmonella ed epitelio intestinale condiziona l’esito dell’infezione. Una volta nel lume intestinale, la Salmonella invade e si replica all’interno delle cellule epiteliali intestinali. A livello intracellulare, la Salmonella può presentare due diversi fenotipi di replicazione, l’iperreplicazione citosolica e la replicazione lenta intravacuolare all’interno dei vacuoli contenenti Salmonella (SCV). L’iperreplicazione citosolica induce la morte infiammatoria delle cellule ospiti e l’estrusione di Salmonella nel lume intestinale3; La replicazione vacuolare porta ad una penetrazione trans-epiteliale e alla diffusione sistemica4. Pertanto, l’estensione dell’invasione e la replicazione vacuolare rispetto a quella citosolica influenzano il decorso dell’infezione.
Il genere Salmonella è molto vario, tra cui migliaia di sierotipi con diversi intervalli di ospiti e capacità di causare malattie. Ad esempio, S. Il Typhimurium è definito come un sierotipo generalista, perché infetta più ospiti non correlati e rappresenta una delle principali cause di salmonellosi umana. Diversamente, S. Il derby è considerato un sierotipo adattato ai suini, poiché è per lo più isolato dai suini, ma è anche segnalato tra i primi cinque sierotipi responsabili dell’infezione umana1. Tuttavia, la conoscenza del comportamento batterico all’interno delle cellule epiteliali è essenzialmente limitata allo studio di alcuni ceppi di riferimento, come S. Typhimurium SL1344, che non rappresentano la vasta diversità naturale della patogenicità della Salmonella . La caratterizzazione dell’interazione di diversi ceppi di Salmonella con cellule epiteliali contribuirebbe a comprendere la loro diversa patogenicità. Per questo motivo, è stato sviluppato un protocollo basato sulla microscopia a fluorescenza ad alta produttività per analizzare il comportamento intracellulare di un gran numero di ceppi in modo rapido e ampiamente automatizzato. In questo protocollo, l’infezione delle cellule epiteliali è stata eseguita in piastre di imaging a 96 pozzetti e l’acquisizione delle immagini è stata effettuata utilizzando un microscopio a fluorescenza automatizzato. Il plasmide pCHAR-Duo è stato utilizzato per osservare i fenotipi di invasione e replicazione della Salmonella all’interno delle cellule epiteliali attraverso la microscopia fluorescente5. Questo plasmide veicola il gene che codifica per il reporter fluorescente rosso mCherry, costitutivamente espresso da tutte le cellule batteriche trasformate, e il gene codificante per il reporter fluorescente verde GFP, la cui espressione è attivata dal glucosio-6-fosfato presente esclusivamente nel citosol delle cellule eucariotiche e assente negli SCV. Pertanto, il plasmide consente la discriminazione tra batteri vacuolari e citosolici mediante l’espressione differenziale di mCherry e dei reporter GFP.
I batteri vacuolari e citosolici sulle immagini al microscopio sono comunemente quantificati dal punteggio manuale6, ma questo è un metodo che richiede tempo e limita l’analisi a un piccolo numero di campioni. Pertanto, sono state sviluppate due analisi di immagini complementari e automatizzate: l’analisi ad area e l’analisi a cella singola, utilizzando ImageJ7, un software di analisi delle immagini disponibile gratuitamente. L’analisi dell’area misura la carica batterica intracellulare complessiva e l’estensione dell’iperreplicazione citosolica utilizzando i dati delle aree occupate da cellule epiteliali, Salmonelle rosse e verdi in ciascuna immagine di microscopia acquisita. Questo metodo può essere applicato a immagini acquisite a basso ingrandimento; Pertanto, consente di segnare un numero elevato di cellule epiteliali con poche immagini, riducendo i tempi di acquisizione. L’analisi a singola cellula utilizza la segmentazione cellulare per determinare la percentuale di cellule infette, il carico vacuolare medio e la percentuale di cellule infette sottoposte a iperreplicazione citosolica con risoluzione a singola cellula.
In questo protocollo, tutte le fasi dell’analisi delle immagini sono descritte in dettaglio per essere eseguite manualmente, ma la stessa analisi può essere automatizzata dai nostri script ImageJ appositamente progettati. Questi script consentono inoltre di eseguire analisi batch per analizzare automaticamente più immagini e velocizzare così l’esecuzione del metodo.
Il modo in cui la Salmonella colonizza le cellule epiteliali intestinali influenza l’esito dell’infezione. Dopo l’invasione, l’iperreplicazione citosolica induce l’infiammazione dell’intestino3, mentre la replicazione vacuolare può portare alla diffusione sistemica4. I ceppi di Salmonella possono variare nella loro capacità di invadere e replicarsi all’interno delle cellule epiteliali intestinali9. In effetti, Salmonella è un genere estremamente diversificato che comprende più di 2.500 sierotipi, che hanno diverse capacità di causare malattie. Inoltre, la Salmonella è la causa più frequentemente segnalata di focolai di tossinfezione alimentare nell’Unione europea, indicando una grande diffusione nella popolazione umana1. Pertanto, la disponibilità di metodi affidabili e ad alto rendimento per la quantificazione dei fenotipi intracellulari di Salmonella è di grande importanza per valutare le differenze di virulenza tra un gran numero di ceppi di Salmonella e, in ultima analisi, consentire una valutazione accurata e specifica del rischio di questo patogeno.
Il protocollo qui descritto misura il comportamento della Salmonella all’interno delle cellule epiteliali in modo rapido e automatizzato. L’infezione delle cellule epiteliali viene eseguita in micropiastre di imaging a 96 pozzetti e un microscopio a fluorescenza automatizzato viene utilizzato per l’acquisizione delle immagini, rendendo il protocollo adatto per applicazioni ad alto rendimento. Questo protocollo sfrutta il plasmide pCHAR-Duo, che permette di distinguere le Salmonelle vacuolari da quelle citosoliche attraverso l’espressione differenziale di due reporter fluorescenti5. I fenotipi intracellulari di Salmonella sono spesso analizzati mediante punteggio manuale, una procedura dispendiosa in termini di tempo che non è adatta per l’analisi di un gran numero di ceppi e colture cellulari per ceppo e soggetta a errori dell’operatore e variazioni tra operatori. Per superare questi limiti, sono state sviluppate due analisi di immagini complementari e automatizzate, l’analisi dell’area e l’analisi a cella singola. ImageJ, un software liberamente disponibile, è stato utilizzato per sviluppare le due analisi. Al fine di accelerare l’esecuzione del protocollo, gli script ImageJ per l’analisi batch di più file di acquisizione senza intervento da parte dell’operatore vengono forniti come file supplementari.
L’analisi dell’area è stata progettata per quantificare, in pochi passaggi, la colonizzazione complessiva delle cellule epiteliali (infection ratio) e il livello di iper-replicazione (hyper-replication ratio) attraverso la misurazione delle aree specificamente occupate dai nuclei delle cellule epiteliali e dalle Salmonelle che esprimono mCherry o mCherry insieme a GFP. L’analisi dell’area viene applicata alle immagini acquisite a basso ingrandimento, dove sia le Salmonelle vacuolari che quelle iperreplicanti sono a fuoco nello stesso piano z e un gran numero di cellule epiteliali viene visualizzato per campo microscopico, riducendo le dimensioni e il numero di file di acquisizione. L’analisi dell’area consente un’analisi automatizzata, veloce e computazionalmente leggera di un gran numero di campioni, rendendola adatta per saggi ad alto rendimento come esperimenti di screening.
L’analisi unicellulare è stata progettata per quantificare i fenotipi di Salmonella all’interno di cellule epiteliali con risoluzione monocellulare, ottenuta attraverso la segmentazione cellulare e la misurazione dell’area cellulare e della percentuale di area occupata da Salmonelle iperreplicanti vacuolari e citosoliche. La colonizzazione complessiva delle cellule epiteliali caratterizzata attraverso l’analisi dell’area è qui suddivisa in tre parametri quantitativi, la percentuale di cellule infette, il carico vacuolare medio e il tasso di iperreplicazione, consentendo di valutare e quantificare il contributo di ciascun fenotipo alla colonizzazione complessiva, completando quindi i risultati dell’analisi dell’area. I maggiori dettagli offerti dall’analisi a cella singola vanno a scapito di un’acquisizione e di un’analisi delle immagini più lente. Infatti, al fine di ottenere una risoluzione a cella singola, l’acquisizione delle immagini viene eseguita ad alto ingrandimento. Ciò implica che sono necessari più piani z per osservare le salmonelle vacuolari e citosoliche a fuoco e che l’acquisizione di un gran numero di campi per campione è necessaria per segnare un numero elevato di cellule epiteliali, estendendo così il tempo di acquisizione rispetto all’analisi dell’area. Inoltre, l’analisi di diversi file di acquisizione di grandi dimensioni è impegnativa dal punto di vista computazionale, richiedendo quindi una workstation adatta (è stata utilizzata una workstation a 6 core e 32 GB di RAM). Pertanto, l’analisi a singola cellula può essere utilizzata come stand-alone in condizioni di produttività limitata o come metodo di secondo livello accoppiato all’analisi dell’area per ottenere una comprensione più profonda dei fenotipi di Salmonella all’interno delle cellule epiteliali.
Le due analisi complementari sono state convalidate utilizzando S. Tm, S. Derby wt, e S. Derby ΔsipA, scelto perché il loro comportamento all’interno delle cellule epiteliali era già noto per differire in termini di invasione o replicazione 9,10. I risultati delle analisi di area e di singole cellule mostrano che il protocollo ha permesso di distinguere quantitativamente le differenze nei fenotipi intracellulari di Salmonella in base alle caratteristiche dei ceppi testati. Inoltre, questi risultati dimostrano che l’analisi a singola cellula consente di quantificare il contributo di ciascun fenotipo intracellulare (invasione, carico vacuolare e replicazione citosolica) alla colonizzazione complessiva valutata utilizzando l’analisi dell’area.
Questo protocollo è stato applicato qui per studiare la patogenicità in vitro di diversi ceppi di Salmonella, ma può avere altre applicazioni come lo studio di mutanti casuali per identificare geni coinvolti nell’invasione e / o nella replicazione all’interno delle cellule epiteliali. Inoltre, il protocollo può essere adattato per analizzare il comportamento della Salmonella all’interno di altre linee cellulari rispetto alle cellule INT407. Può anche essere usato come punto di partenza per sviluppare metodi simili per studiare l’interazione cellula-patogeno di altri microrganismi intracellulari.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Olivia Steele-Mortimer per aver condiviso il plasmide pCHAR-Duo. Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero della Salute italiano, sovvenzioni PRC2019014 e PRC2021004.
96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |