प्रीक्लिनिकल कार्डियक जोखिम मूल्यांकन के लिए मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के संरचनात्मक और सिकुड़ा हुआ परिवर्तनों का आकलन करने के लिए हाइब्रिड सेल विश्लेषण प्रणाली
Summary
मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के सिकुड़ा हुआ कार्य और सेलुलर अखंडता में परिवर्तन का विश्लेषण गैर-नैदानिक दवा विकास के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है। एक हाइब्रिड 96-वेल सेल विश्लेषण प्रणाली विश्वसनीय, मानव-प्रासंगिक परिणामों के लिए वास्तविक समय और शारीरिक तरीके से दोनों मापदंडों को संबोधित करती है, जो नैदानिक चरणों में एक सुरक्षित संक्रमण के लिए आवश्यक है।
Abstract
नए चिकित्सीय के विकास और नैदानिक चरणों में उनके सुरक्षित संक्रमण के लिए कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मूल्यांकन का अत्यधिक महत्व है। जबकि मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) दवा की खोज और सुरक्षा फार्माकोलॉजी के प्रीक्लिनिकल चरणों में मानव-प्रासंगिक मॉडल के रूप में सेवा करने का वादा करते हैं, उनकी परिपक्वता अभी भी वैज्ञानिक समुदाय में विवादास्पद है और निरंतर विकास के अधीन है। हम एक हाइब्रिड कॉन्ट्रैक्टिलिटी और प्रतिबाधा / बाह्य क्षेत्र क्षमता (ईएफपी) तकनीक प्रस्तुत करते हैं, जो उद्योग-मानक 96-वेल प्लेटफॉर्म में महत्वपूर्ण प्रो-परिपक्वता सुविधाओं को जोड़ते हैं।
ईएफपी सिस्टम वास्तविक समय में सेलुलर कार्यक्षमता की निगरानी करता है। सिकुड़ा हुआ कोशिकाओं की बीट दर के अलावा, विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी रीडआउट सेल घनत्व और सेलुलर मोनोलेयर की अखंडता जैसे यौगिक-प्रेरित रूपात्मक परिवर्तनों का पता लगाता है। हाइब्रिड सेल विश्लेषण प्रणाली के अन्य घटक में, कोशिकाओं को जैव-अनुरूप झिल्ली पर सुसंस्कृत किया जाता है जो वास्तविक हृदय ऊतक के यांत्रिक वातावरण की नकल करते हैं। यह शारीरिक वातावरण विट्रो में एचआईपीएससी-सीएम की परिपक्वता का समर्थन करता है, जिससे आइसोप्रोटेरनॉल, एस-बे के 8644, या ओमेकेमटिव मेकार्बिल के साथ उपचार के बाद सकारात्मक इनोट्रोपिक प्रभाव सहित अधिक वयस्क जैसी सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाएं होती हैं। संकुचन बल के आयाम (एमएन / मिमी2) और बीट अवधि जैसे पैरामीटर भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों और कैल्शियम हैंडलिंग पर प्रभाव के साथ यौगिकों के डाउनस्ट्रीम प्रभावों को प्रकट करते हैं।
हाइब्रिड सिस्टम समग्र सेल विश्लेषण के लिए आदर्श उपकरण प्रदान करता है, जिससे मानव-प्रासंगिक सेल-आधारित परख के वर्तमान दृष्टिकोण से परे प्रीक्लिनिकल कार्डियक जोखिम मूल्यांकन की अनुमति मिलती है।
Introduction
आधुनिक दवा विकास के प्रमुख लक्ष्यों में से एक दवा खोज पाइपलाइन में नए चिकित्सीय की बेंच-टू-बेडसाइड सफलता दर में सुधार है। इन नई दवाओं के सुरक्षा औषधीय परीक्षण से अक्सर कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम पर प्रतिकूल दवा प्रतिक्रियाओं का पता चलता है जो प्रीक्लिनिकल चरण1 में दवा एट्रिशन दर का लगभग एक-चौथाई हिस्सा है। नई दृष्टिकोण पद्धतियों (एनएएम) का विकास और एकीकरण प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन के आधुनिकीकरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, विशेष रूप से हृदय जैसे कोर बैटरी अंगों में। चूंकि ये पद्धतियां पशु-मुक्त दृष्टिकोण हैं, इसलिए प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) मूल के कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) जैसे मानव-आधारित सेल मॉडल का उपयोग सुरक्षा औषधीय और विषविज्ञान के मुद्दों के आधुनिक मूल्यांकन के लिए पिछले दशक में वर्कहॉर्स बन गया। इस तरह की जांच के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली परख प्रणाली माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) और वोल्टेज-संवेदनशील डाई-आधारित प्रयोगात्मक दृष्टिकोणहैं।
फिर भी, इस सेल प्रकार की दावा की गई फेनोटाइपिक और कार्यात्मक अपरिपक्वता एक आदर्श मानव-आधारित सेल मॉडल के रास्ते में बाधाएं डालती है, जिसमें गैर-नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों के बीच ट्रांसलेशनल अंतराल को कम करने की क्षमताहोती है।
निहित अपरिपक्व फेनोटाइप के कारण को समझने और विट्रो में मानव आईपीएससी-सीएम की परिपक्वता प्रक्रिया को आगे बढ़ाने के तरीके खोजने के लिए वर्षों से जबरदस्त शोध किया गया है।
कार्डियक परिपक्वता संकेतों की कमी जैसे कि लंबे समय तक सेल संस्कृति समय, आसपास के क्षेत्र में अन्य सेल प्रकारों की अनुपस्थिति, या हार्मोनल उत्तेजना की कमी कोपरिपक्वता प्रक्रिया को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था। इसके अलावा, नियमित सेल कल्चर प्लेटों के गैर-शारीरिक वातावरण को एक महत्वपूर्ण कारण के रूप में पहचाना गया था जो देशी मानव हृदय 5,6 की लापता शारीरिक सब्सट्रेट कठोरता के कारण मानव आईपीएससी-सीएम की परिपक्वताको बाधित करता है।
इस मुद्दे से निपटने के लिए देशी शारीरिक स्थितियों पर ध्यान देने के साथ विभिन्न परख प्रणालियों को विकसित किया गया था, जिसमें 3 डी सेल कल्चर सिस्टमशामिल हैं जहां कोशिकाओं को विशिष्ट दो-आयामी सेल संस्कृतियों के बजाय देशी कार्डियक आर्किटेक्चर के समान तीन-आयामी रूप से संरेखित किया जाता है। यद्यपि 3 डी परख के साथ बेहतर परिपक्वता प्राप्त की जाती है, एक कुशल कार्यबल की आवश्यकता और इन प्रणालियों के कम थ्रूपुट दवा विकास प्रक्रिया में इसके प्रचुर उपयोग में बाधा डालते हैं, क्योंकि समय और लागत वित्तीय स्तर 8 पर नए चिकित्सीय के मूल्यांकन में मौलिक भूमिकानिभाते हैं।
नए चिकित्सीय के सुरक्षा औषधीय और विष विज्ञान मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण रीडआउट मानव आईपीएससी-सीएम की कार्यात्मक और संरचनात्मक विशेषताओं में परिवर्तन हैं, क्योंकि हृदय प्रणाली की यौगिक-प्रेरित प्रतिकूल दवा प्रतिक्रियाएं आमतौर पर इन गुणों में से एक या दोनों को प्रभावित करती हैं। इस तरह की व्यापक प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं के प्रसिद्ध उदाहरण एंथ्रासाइक्लिन परिवार की कैंसर विरोधी दवाएं हैं। यहां, रोगियों में कैंसर के उपचार के दौरान और बाद में कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम पर खतरनाक कार्यात्मक और प्रतिकूल संरचनात्मक प्रभावों के साथ-साथ इन विट्रो सेल-आधारित परख10,11 के साथ व्यापक रूप से रिपोर्ट किए जाते हैं।
वर्तमान अध्ययन में, हम एचआईपीएससी-सीएम पर कार्यात्मक और संरचनात्मक यौगिक दुष्प्रभावों दोनों के आकलन के लिए एक व्यापक पद्धति का वर्णन करते हैं। कार्यप्रणाली में कार्डियोमायोसाइट्स सिकुड़ा हुआ बल और प्रतिबाधा / एक्स्ट्रासेल्युलर फील्ड पोटेंशियल (ईएफपी) विश्लेषण का विश्लेषण शामिल है। सिकुड़ा हुआ बल शारीरिक यांत्रिक परिस्थितियों में मापा जाता है, जिसमें कोशिकाओं को नरम (33 केपीए) सिलिकॉन सब्सट्रेट्स पर संवर्धित किया जाता है, जो देशी मानव हृदय ऊतक के यांत्रिक वातावरण को दर्शाता है।
यह प्रणाली प्रीक्लिनिकल कार्डियक सुरक्षा फार्माकोलॉजिकल और टॉक्सिकोलॉजिकल अध्ययनों के लिए मानव आईपीएससी-सीएम के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए 96-वेल प्लेटों से लैस है, और इस प्रकार वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले 3 डी दृष्टिकोण जैसे लैंगनडॉर्फ हार्ट या हार्ट स्लाइस12,13 के लिए एक लाभ प्रदान करता है।
विस्तार से, हाइब्रिड सिस्टम में दो मॉड्यूल होते हैं, या तो शारीरिक परिस्थितियों के तहत कार्डियक सिकुड़न के आकलन के लिए या वास्तविक समय सेलुलर संरचनात्मक विषाक्तता 6,14 के विश्लेषण के लिए। दोनों मॉड्यूल तेज और लागत प्रभावी डेटा अधिग्रहण के लिए विशेष उच्च थ्रूपुट 96-वेल प्लेटों के साथ काम करते हैं।
3 डी निर्माण की आवश्यकता के बिना, अनुबंध मॉड्यूल विशेष प्लेटों को नियोजित करता है जिसमें कठोर ग्लास या प्लास्टिक के बजाय कोशिकाओं के लिए सब्सट्रेट के रूप में लचीली सिलिकॉन झिल्ली होती है जो नियमित सेल कल्चर प्लेटों में आमतौर पर होती है। झिल्ली विशिष्ट मानव बायोमेकेनिकल हृदय गुणों को दर्शाती है और इसलिए उच्च थ्रूपुट तरीके से विवो स्थितियों में नकल करती है। जबकि मानव आईपीएससी-सीएम अक्सर अन्य सेल-आधारित परख14 में यौगिक-प्रेरित सकारात्मक इनोट्रॉपी के बारे में वयस्क कार्डियोमायोसाइट व्यवहार प्रदर्शित करने में विफल रहते हैं, जब कोशिकाओं को अनुबंध मॉड्यूल की प्लेटों पर सुसंस्कृत किया जाता है तो अधिक वयस्क जैसी प्रतिक्रिया का आकलन किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों में, यह प्रदर्शित किया गया है कि आईपीएससी-सीएम आइसोप्रोटेरनॉल, एस-बे के 8644, या ओमेकामटिव मेकार्बिल 6,15 जैसे यौगिकों के साथ उपचार पर सकारात्मक इनोट्रोपिक प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। यहां, कई संकुचन मापदंडों का आकलन किया जा सकता है, जैसे कि संकुचन बल के आयाम (एमएन / मिमी2), बीट अवधि और बीट दर, साथ ही संकुचन चक्र के द्वितीयक पैरामीटर जैसे वक्र, संकुचन और विश्राम ढलानों के तहत क्षेत्र, बीट दर भिन्नताएं और अतालता (पूरक चित्र 1)16 . सभी मापदंडों में दवा-प्रेरित परिवर्तनों का मूल्यांकन कैपेसिटिव डिस्टेंस सेंसिंग द्वारा गैर-आक्रामक रूप से किया जाता है। कच्चे डेटा का विश्लेषण बाद में विशेष सॉफ्टवेयर द्वारा किया जाता है।
संरचनात्मक विषाक्तता मॉड्यूल संरचनात्मक सेलुलर विषाक्तता और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों के विश्लेषण के लिए रीडआउट के रूप में अपनी अनूठी प्रतिबाधा और ईएफपी मापदंडों को जोड़ता है। विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक वास्तविक समय में निगरानी की गई सेल घनत्व या सेल और मोनोलेयर अखंडता में यौगिक-प्रेरित परिवर्तनों का खुलासा करती है, जैसा कि ज्ञात कार्डियोटॉक्सिकयौगिकों के साथ इलाज किए गए मानव आईपीएससी-सीएम के साथ दिखाया गया है। विभिन्न आवृत्तियों (1-100 kHz) पर प्रतिबाधा रीडआउट के साथ एक शारीरिक प्रतिक्रिया को आगे विच्छेदित करना संभव है, और इस प्रकार झिल्ली स्थलाकृति, सेल-सेल या सेल-मैट्रिक्स जंक्शनों में परिवर्तन का खुलासा करना प्राप्त करने योग्य है। मानव आईपीएससी-सीएम की अतिरिक्त ईएफपी रिकॉर्डिंग आगे यौगिक उपचार द्वारा प्राप्त इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रभावों के विश्लेषण को सक्षम बनाती है, जैसा कि सीआईपीए अध्ययन17,19 के प्रकाश में दिखाया गया था।
वर्तमान अध्ययन में, मानव आईपीएससी-सीएम को नियोजित किया गया था, एपिरुबिसिन और डॉक्सोर्यूबिसिन के साथ इलाज किया गया था, दोनों को कार्डियोटॉक्सिक एंथ्रासाइक्लिन के रूप में अच्छी तरह से वर्णित किया गया था, और एर्लोटिनिब, एक टायरोसिन किनेज अवरोधक (टीकेआई) जिसमें कार्डियोवैस्कुलर विषाक्तता का खतरा कम था। एपिरुबिसिन, डॉक्सोर्यूबिसिन और एर्लोटिनिब के साथ क्रोनिक मूल्यांकन 5 दिनों के लिए किया गया था। परिणाम संकुचन और आधार प्रतिबाधा में मामूली बदलाव दिखाता है जब कोशिकाओं को एर्लोटिनिब के साथ इलाज किया गया था, लेकिन क्रमशः एपिरुबिसिन और डॉक्सोर्यूबिसिन के साथ इलाज किए जाने पर संकुचन आयाम और आधार प्रतिबाधा में समय और खुराक-निर्भर विषाक्त कमी। तीव्र माप कैल्शियम चैनल ब्लॉकर निफेडिपिन के साथ किए गए थे और संकुचन आयाम, क्षेत्र संभावित अवधि और आधार प्रतिबाधा में कमी दिखाते हैं, कार्यात्मक और संरचनात्मक स्तरों पर इस यौगिक के कार्डियोटॉक्सिक दुष्प्रभावों का प्रदर्शन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रतिबाधा/ईएफपी/कॉन्ट्रैक्टिलिटी हाइब्रिड प्रणाली प्रीक्लिनिकल दवा विकास के लिए हृदय संबंधी देनदारियों के उच्च थ्रूपुट सुरक्षा औषधीय और विष विज्ञान मूल्यांकन के लिए एक व्यापक पद्धति है। यह पशु मॉ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को जर्मन संघीय आर्थिक मामलों और जलवायु कार्रवाई मंत्रालय (ZIM) और जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (KMUinnovativ) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले कार्डियोमायोसाइट्स प्रदान करने के लिए फुजीफिल्म सेलुलर डायनेमिक्स, इंक (मैडिसन, डब्ल्यूआई, यूएसए) और एनकार्डिया बीवी (लीडेन, नीदरलैंड) को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
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