Summary
인간 iPSC 유래 심근 세포의 수축 기능 및 세포 무결성의 변화 분석은 비임상 약물 개발에 매우 중요합니다. 하이브리드 96웰 세포 분석 시스템은 임상 단계로의 안전한 전환에 필요한 신뢰할 수 있는 인간 관련 결과를 위해 실시간 및 생리학적 방식으로 두 파라미터를 모두 처리합니다.
Abstract
심장 수축성 평가는 새로운 치료제의 개발과 임상 단계로의 안전한 전환에 매우 중요합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 발견 및 안전 약리학의 전임상 단계에서 인간 관련 모델로 사용될 것으로 기대되지만, 그 성숙도는 여전히 과학계에서 논란의 여지가 있으며 지속적으로 개발 중입니다. 우리는 하이브리드 수축성 및 임피던스/세포외 전위(EFP) 기술을 제시하여 산업 표준 96웰 플랫폼에 상당한 성숙 방지 기능을 추가합니다.
임피던스/EFP 시스템은 실시간으로 셀룰러 기능을 모니터링합니다. 수축 세포의 박동 속도 외에도 전기 임피던스 분광법 판독값은 세포 밀도 및 세포 단층의 무결성과 같은 화합물 유도 형태학적 변화를 감지합니다. 하이브리드 세포 분석 시스템의 다른 구성 요소에서 세포는 실제 심장 조직의 기계적 환경을 모방하는 생체 적합성 막에서 배양됩니다. 이 생리적 환경은 시험관 내에서 hiPSC-CM의 성숙을 지원하여 이소프로테레놀, S-Bay K8644 또는 omecamtiv mecarbil로 치료한 후 양성 변성 효과를 포함하여 성인과 같은 수축 반응을 유발합니다. 수축력의 진폭 (mN /mm2) 및 박동 지속 시간과 같은 매개 변수는 전기 생리 학적 특성 및 칼슘 취급에 영향을 미치는 화합물의 다운 스트림 효과를 나타냅니다.
하이브리드 시스템은 전체론적 세포 분석을 위한 이상적인 도구를 제공하여 인간 관련 세포 기반 분석의 현재 관점을 넘어 전임상 심장 위험 평가를 가능하게 합니다.
Introduction
현대 약물 개발의 주요 목표 중 하나는 약물 발견 파이프 라인에서 새로운 치료법의 벤치 투 병상 성공률을 향상시키는 것입니다. 이러한 신약의 안전성 약리학적 검사는 종종 전임상 단계에서 약물 소모율의 거의 1/4을 차지하는 심혈관계에 대한 약물 부작용을 나타냅니다1. 새로운 접근법 방법론(NAM)의 개발 및 통합은 전임상 평가, 특히 심장과 같은 핵심 배터리 기관의 현대화에 핵심적인 역할을 합니다. 이러한 방법론은 동물이 없는 접근 방식이기 때문에 유도만능줄기세포(iPSC) 기원의 심근세포(CM)와 같은 인간 기반 세포 모델의 사용은 지난 10년 동안 안전성 약리학적 및 독성학적 문제의 현대적 평가를 위한 주력 제품이 되었습니다2. 이러한 조사를 위해 널리 사용되는 분석 시스템은 미세 전극 어레이 (MEA) 및 전압에 민감한 염료 기반 실험 접근법3입니다.
그럼에도 불구하고, 이 세포 유형의 표현형 및 기능적 미성숙은 비임상 연구와임상 연구 사이의 번역 격차를 줄일 수 있는 잠재력을 가진 이상적인 인간 기반 세포 모델의 길에 장애물을 놓는다4.
내포된 미성숙 표현형의 이유를 이해하고 시험관 내에서 인간 iPSC-CM의 성숙 과정을 추진하는 방법을 찾기 위해 수년에 걸쳐 엄청난 연구가 수행되었습니다.
세포 배양 시간 연장, 주변에 다른 세포 유형의 부재 또는 호르몬 자극 부족과 같은 심장 성숙 단서가 부족하면성숙 과정에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다5. 또한, 일반 세포 배양 플레이트의 비생리학적 환경은인간 iPSC-CM의 성숙을 방해하는 중요한 원인으로 확인되었으며, 이는 천연 인간 심장의 생리적 기질 경직성 누락으로 인해 5,6.
이 문제를 해결하기 위해 천연 생리적 조건에 초점을 맞춘 다양한 분석 시스템이 개발되었으며, 여기에는 세포가 일반적인 2차원 세포 배양 대신 천연 심장 구조와 유사하도록 3차원으로 정렬되는 3D 세포 배양 시스템이포함됩니다7. 3D 분석으로 향상된 성숙도를 얻을 수 있지만, 시간과 비용이재무 수준에서 새로운 치료제를 평가하는 데 근본적인 역할을 하기 때문에 숙련된 인력의 필요성과 이러한 시스템의 낮은 처리량은 약물 개발 프로세스에서 이를 풍부하게 사용하는 데 방해가 됩니다8.
새로운 치료제의 안전성 약리학적 및 독성학적 평가를 위한 중요한 판독값은 인간 iPSC-CM의 기능적 및 구조적 특성의 변화인데, 이는 심혈관계의 화합물 유발 약물 부작용이 일반적으로이러한 특성 중 하나 또는 둘 다에 영향을 미치기 때문입니다1,9. 이러한 광범위한 부작용의 잘 알려진 예는 안트라사이클린 계열의 항암제입니다. 여기에서 심혈관 시스템에 대한 유해한 기능적 및 유해한 구조적 영향은 환자의 암 치료 중 및 치료 후 뿐만 아니라 시험관 내 세포 기반 분석10,11에서도 널리 보고됩니다.
본 연구에서는 hiPSC-CM에 대한 기능적 및 구조적 화합물 부작용을 평가하기위한 포괄적 인 방법론을 설명합니다. 이 방법론에는 심근 세포 수축력 분석 및 임피던스 / 세포 외 전위 (EFP) 분석이 포함됩니다. 수축력은 생리적 기계적 조건에서 측정되며, 세포는 천연 인간 심장 조직의 기계적 환경을 반영하여 연질(33kPa) 실리콘 기질에서 배양됩니다.
이 시스템에는 전임상 심장 안전 약리학 및 독성학 연구를 위한 인간 iPSC-CM의 고처리량 분석을 위한 96웰 플레이트가 장착되어 있어 Langendorff 심장 또는 심장 슬라이스12,13과 같이 현재 사용되는 3D 접근 방식에 이점을 제공합니다.
세부적으로, 하이브리드 시스템은 생리적 조건 하에서의 심장 수축성 평가 또는 실시간 세포 구조 독성분석 (6,14)의 두 가지 모듈로 구성됩니다. 두 모듈 모두 빠르고 비용 효율적인 데이터 수집을 위해 특수 고처리량 96웰 플레이트와 함께 작동합니다.
3D 구조가 필요 없는 수축성 모듈은 일반 세포 배양 플레이트가 일반적으로 구성되는 뻣뻣한 유리 또는 플라스틱 대신 유연한 실리콘 멤브레인을 포함하는 특수 플레이트를 세포의 기판으로 사용합니다. 멤브레인은 전형적인 인간의 생체 역학적 심장 특성을 반영하므로 높은 처리량 방식으로 생체 내 조건을 모방합니다. 인간 iPSC-CM은 종종 다른 세포 기반 분석에서 화합물-유도된 양성 변성에 관한 성인 심근세포 거동을 나타내지 못하는 반면(14), 세포가 수축성 모듈의 플레이트 상에서 배양될 때 보다 성인-유사 반응이 평가될 수 있다. 이전 연구에서 iPSC-CM은 이소프로테레놀, S-Bay K8644 또는 omecamtiv mecarbil 6,15와 같은 화합물로 치료할 때 긍정적인 변성 효과를 나타내는 것으로 입증되었습니다. 여기에서 수축력의 진폭(mN/mm2), 박동 지속 시간 및 박동 속도와 같은 1차 매개변수와 곡선 아래 면적, 수축 및 이완 기울기, 박동률 변화 및 부정맥과 같은 수축 주기의 2차 매개변수와 같은 여러 수축성 매개변수를 평가할 수 있습니다(보충 그림 1)16 . 모든 파라미터에서 약물-유도된 변화는 용량성 거리 감지에 의해 비침습적으로 평가된다. 원시 데이터는 특수 소프트웨어에 의해 분석됩니다.
구조적 독성 모듈은 구조적 세포 독성 및 전기 생리 학적 특성분석 17,18에 대한 판독 값으로 고유 한 임피던스 및 EFP 매개 변수를 추가합니다. 전기 임피던스 분광법 기술은 알려진 심장 독성 화합물로 처리 된 인간 iPSC-CM에서 볼 수 있듯이 실시간으로 모니터링되는 세포 밀도 또는 세포 및 단층 무결성의 화합물 유도 변화를 나타냅니다13. 다양한 주파수(1-100kHz)에서 임피던스 판독값을 사용하면 생리적 반응을 추가로 해부할 수 있으므로 막 지형, 세포-셀 또는 세포-매트릭스 접합의 변화를 밝힐 수 있습니다. 인간 iPSC-CM의 추가 EFP 기록은 CiPA 연구17,19에 비추어 나타난 바와 같이 화합물 처리에 의해 유도된 전기생리학적 효과의 분석을 추가로 가능하게 합니다.
본 연구에서, 인간 iPSC-CM은 심장 독성 안트라 사이클린으로 잘 설명 된 에피 루비 신 및 독소루비신과 심혈관 독성 위험이 다소 낮은 티로신 키나제 억제제 (TKI) 인 erlotinib으로 치료되었습니다. 에피 루비 신, 독소루비신 및 에를로 티닙을 사용한 만성 평가를 5 일 동안 수행했습니다. 결과는 세포가 erlotinib으로 처리되었을 때 수축성 및 염기 임피던스의 약간의 변화를 보여 주지만, 각각 에피 루비 신 및 독소루비신으로 처리했을 때 수축 진폭 및 염기 임피던스의 시간 및 용량 의존적 독성 감소를 보였다. 급성 측정은 칼슘 채널 차단제 니페디핀으로 수행되었으며 수축 진폭, 전계 전위 지속 시간 및 기본 임피던스의 감소를 보여 기능적 및 구조적 수준에 대한 이 화합물의 심장 독성 부작용을 보여줍니다.
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Protocol
참고: 수축성 및 임피던스/EFP 측정을 위한 워크플로는 보충 그림 2에 나와 있습니다.
1. 플레이트 코팅
- 진공 밀봉 포장을 열고 96웰 플레이트를 꺼냅니다. 두 모듈의 96웰 플레이트에 대한 처리 절차는 동일합니다. 수축 모듈에서 측정할 때까지 추가로 제공된 멤브레인 가드로 덮인 수축판을 그대로 두십시오.
- 심근 세포를 파종하기 위해 유연한 96 웰 플레이트를 코팅하십시오.
- 멸균 원심분리 튜브에 2.75mL의 EHS 겔 즉시 사용 가능한 용액을 옮겨 희석된 EHS 겔 코팅 용액을 준비합니다. 그런 다음 Ca 2+ 및 Mg 2+와 함께8.25mL의 DPBS를 추가합니다. 용액을 조심스럽게 섞는다.
참고: 선택적으로, 피브로넥틴은 웰 코팅에도 사용할 수 있습니다: 13mL의 DPBS에 650μL의 피브로넥틴 원액(1μg/mL)을 Ca 2+ 및 Mg2+로 희석하여 멸균 원심분리 튜브에서 피브로넥틴 코팅 용액 13mL를 준비하여 50μg/mL 작업 용액을 만듭니다. 용액을 조심스럽게 섞는다.
- 멸균 원심분리 튜브에 2.75mL의 EHS 겔 즉시 사용 가능한 용액을 옮겨 희석된 EHS 겔 코팅 용액을 준비합니다. 그런 다음 Ca 2+ 및 Mg 2+와 함께8.25mL의 DPBS를 추가합니다. 용액을 조심스럽게 섞는다.
- 코팅 용액을 실험실 자동화 로봇에 배치된 멸균 시약 저장소로 옮깁니다.
- "ADD100μL" 프로그램을 사용하여 실험실 자동화 로봇으로 웰당 100μL의 코팅 용액을 추가합니다. 뚜껑을 96웰 플레이트에 다시 놓고 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.
알림: 실험실 자동화 로봇용 프로그램은 미리 수동으로 사전 설정해야 합니다.
2. 인간 iPSC 유래 심근 세포를 유연한 96웰 플레이트에 파종(Day 0)
- 제조업체의 지침에 따라 세포를 해동하십시오.
- 수동 계수 챔버로 세포를 계수하고 세포 제조업체 지침(예: 1 x 105 cells/well)에 따라 권장 도금 매체에서 셀을 조정하면 전체 96웰 플레이트를 시딩하기 위한 11 x 106 cells/11mL가 생성됩니다.
- 프로그램 "REMOVE100μL"을 사용하여 실험실 자동화 로봇으로 웰에서 EHS 겔 용액을 제거합니다. 분배된 코팅 용액이 들어 있는 시약 저장소를 로봇에서 제거합니다.
- 세포 현탁액(총 11mL)을 실험실 자동화 로봇에 있는 멸균 시약 저장소로 옮기고 "CELLS_ADD100 μL" 프로그램을 사용하여 100μL/웰로 세포를 시딩합니다.
- 세포 파종 직후 유연한 96웰 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5%CO2, 습도 제어)로 옮기고 세포를 밤새 안정시킵니다.
3. 유연한 96웰 플레이트의 중간 교환(1일차)
- 플레이트를 시딩한 후 18-24시간 동안 플레이트당 최소 22mL의 심근세포 유지 배지를 50mL 원심분리 튜브에서 37°C로 가온합니다.
- 새 배지(최소 22mL)를 멸균 시약 저장소로 옮기고 실험실 자동화 로봇 바로 옆에 두십시오. 로봇에 빈 시약 저장소를 놓고 "REMOVE100μL" 프로그램으로 배지 제거를 수행합니다. 그런 다음 폐 배지가 포함된 시약 저장소를 새 배지가 포함된 시약 저장소로 교환하고 "ADD100μL" 프로그램으로 웰당 200μL의 새 배지를 분배합니다. 이 단계를 두 번 수행하여 200μL/웰에 도달합니다.
- 배지 교환 직후 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮깁니다.
- 화합물이 첨가될 때까지 격일로 배지 교환(200μL/웰)을 수행합니다.
4. 화합물 첨가 전 최종 배지 교환 (Day 5-7)
- 화합물 첨가 4-6시간 전에 최종 배지 변경을 수행합니다.
- 유연한 96웰 플레이트 1개에 대해 최소 22mL의 분석 버퍼를 따뜻하게 합니다. 분석 완충액은 유지 배지 또는 이의 유도체(예를 들어, 저혈청 배지/무혈청 배지, 페놀 레드 유리 배지 또는 다른 등장성 완충액)로 구성된다.
- 새로운 배지를 멸균 시약 저장소로 옮기고 실험실 자동화 로봇 바로 옆에 두십시오. 로봇에 빈 시약 저장소를 놓고 배지 제거를 수행합니다. 그런 다음 폐 배지가 포함된 시약 저장소를 새 배지가 들어 있는 시약 저장소로 교환하고 새 배지 200μL/well을 분배합니다.
- 배지 교환 직후 플렉시블 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮깁니다.
5. 화합물 첨가 및 데이터 기록 (5-7 일)
참고: 실험에 대한 측정 계획의 예는 보충 그림 3에 나와 있습니다.
- 멸균 일반 96-deep 웰 플레이트를 사용하여 층류 후드에서 4x 농도로 화합물당 작업 용액을 준비합니다. 화합물 용액은 단계 4에서 사용된 분석 완충액에 기초한다. 화합물 용액이 포함된 96-딥 웰 플레이트를 최소 1시간 동안 인큐베이터로 옮겨 플렉시블 플레이트와 동일한 조건으로 조정합니다.
참고 : 모든 실험에 사용 된 각 약물의 1x 농도는 그림과 범례에 제공됩니다. - 기준선 측정을 수행하기 1시간 전에 플레이트를 각 측정 장치로 옮깁니다.
- 제어 소프트웨어(하이브리드 세포 분석 시스템의 일부)에서 프로토콜 편집을 열고 각 측정 모드 수축성 또는 임피던스/EFP를 선택합니다.
- 스윕 지속 시간(한 측정 길이, 예: 30초)과 반복 간격(측정 간 시간, 예: 5분)을 정의하고 프로토콜 번호를 저장합니다.
- 프로토콜 시작 > 계속을 선택하고 요청된 필드를 채웁니다.
- 마지막으로 측정 시작을 선택합니다. 화합물 첨가 직전에 5분 간격으로 최소 3회의 기준선 측정(스윕)을 수행합니다.
참고: 화합물 첨가 전에 수축성 모듈을 사용한 수축성 기준선 측정의 예제 데이터는 보충 그림 4에 나와 있습니다. - 측정 장치에서 유연한 96웰 플레이트를 제거하지 않고 각 웰에서 50μL의 분석 버퍼를 제거합니다.
- 측정 계획에 따라 4x 농축 화합물 용액 50μL를 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
- 영역 마커 추가를 선택하고 화합물 플레이트 레이아웃과 화합물 첨가 후 화합물 용액의 부피를 정의합니다.
- 마지막으로 실험 계획에 따라 표준 측정 진행 또는 측정 계열로 진행 을 선택합니다.
6. 데이터 분석
- 기록 소프트웨어를 사용하면 길이와 반복 간격이 사용자에 의해 정의되는 스윕을 측정합니다.
- 분석 소프트웨어를 사용하면 진폭, 비트 속도, 펄스 폭 등과 같은 파라미터를 자동으로 판독하여 신호의 형태를 캡처할 수 있습니다.
알림: 표준 편차를 포함한 평균 신호, 소위 평균 비트는 한 번의 스윕 데이터를 기반으로 자동으로 계산됩니다. 사용자는 소프트웨어가 계산하고 표시하는 수축성/IMP/EFP 매개변수를 정의할 수 있습니다. - 분석 소프트웨어를 사용하여 각 화합물에 대한 용량-반응 곡선과 IC50/EC50을 계산합니다.
참고: 분석 소프트웨어로 생성된 원시 데이터와 분석 결과는 다양한 형식으로 쉽게 내보낼 수 있습니다. 마지막으로 실험 결과를 요약하고 보관하기 위해 데이터 보고서가 자동으로 생성됩니다. EFP 신호가 측정되는 대상과 방법에 대한 포괄적인 설명은 17에서 설명합니다.
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Representative Results
키나아제 억제제 에를로티닙이 hiPSC-CM의 수축성에 미치는 영향은 그림 1에 나와 있습니다. 세포를 5일 동안 10 nM 내지 10 μM 범위의 농도로 처리하고, 박동 파라미터를 매일 기록하였다. 심장 독성의 위험이 비교적 낮은 EGFR (표피 성장 인자 수용체) 및 티로신 키나제 억제제 인 Erlotinib은 마이크로 몰 범위의 농도에서만 hiPSC-CM에 약간의 용량과 시간 의존적 영향을 미쳤습니다. 최저 농도 (10 nM)에서, erlotinib은 화합물 적용 후 첫 번째 측정 (1 시간)에서 통계적으로 유의하지 않은 진폭 감소를 유도했다. 모든 후속 측정에서, 이 농도에서 비교 가능한 효과는 측정되지 않았다. 일시적인 감소는 복합 효과의 결과일 수 있지만, 예를 들어 열적 또는 기계적 성질의 화합물 첨가 절차 동안 비트 패턴의 일시적인 왜곡으로 인해 발생할 수도 있습니다. erlotinib의 마이크로 몰 농도는 약간이지만 상당한 시간 및 용량 의존적 심장 독성 효과를 보였다. 효과의 시작은 1μM erlotinib으로 96 시간에서 나타 났으며, 10 μM은 화합물 첨가 후 24 시간 만에 크게 감소했습니다.
화학 요법 제제 인 에피 루비 신은 hiPSC-CM에 시간 및 용량 의존적 효과를 모두 가졌습니다 (그림 2). 세포는 10μM 에피루비신을 적용한 후 24시간 이내에 박동을 멈췄습니다. 1μM의 경우, 진폭이 44%로 급격히 감소± 24시간 후 대조군의 2%가 화합물 첨가 후 48시간까지 완전히 중단되었습니다. 100nM에서, 5일째에 25% ± 3%의 잔류 진폭과 함께 5일의 기간에 걸친 비트 진폭의 시간 의존적 감소가 관찰되었다. 10 nM의 최저 농도에서, 에피 루비 신의 효과는 단지 용량 의존적이지만 시간 의존적이지는 않았으며, 첫 번째 측정 (화합물 첨가 후 1 시간)에서 시작되었다. 진폭은 5 일 동안 제어의 60 % -80 % 사이에서 꾸준히 변동했습니다. 이 그룹의 편차는 더 높은 농도에 비해 더 컸습니다. 한 가지 가능한 이유는이 농도가 우물의 일부에만 측정 가능한 영향을 미쳤다는 사실 일 수 있습니다.
독소루비신은 또 다른 안트라사이클린 계열의 약물이며, hiPSC-CM의 세포 활력은 시간 경과에 따른 기본 임피던스를 모니터링하여 조사되었습니다. 도 3은 300, 1, 3 및 10 μM 독소루비신에 24시간 노출되면 농도 및 시간 의존적 방식으로 세포 생존율이 감소한다는 것을 보여준다.
Nifedpinie는 주로 L 형 칼슘 채널을 차단하는 디 하이드로 피리딘 칼슘 채널 차단제입니다. 24시간 이상의 세포 생존율을 장기간 모니터링하면 독성 척도로 사용되는 염기 임피던스의 시간 및 농도 의존적 감소가 나타납니다(그림 4A). 증가하는 니페디핀 농도 (3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM)를 적용하면 hiPSC-CM에 대한 전위 기록은 예상대로 표준화 된 필드 지속 시간 (FPD)의 농도 의존적 단축을 나타냅니다 (그림 4B, C). 심장 수축력에 관한 니페디핀 평가는 또한 10 nM 및 30 nM 농도로 급성 측정시 상당한 농도 의존적 진폭 감소를 보였다 (그림 5).
하이브리드 세포 분석 시스템으로 얻은 결과는 hiPSC-CM의 세 가지 심장 종점(수축성, 구조 및 전기생리학)을 하나의 시스템을 사용하여 평가할 수 있음을 보여줍니다.
그림 1: 5일 동안 에를로티닙으로 처리된 인간 iPSC 유래 심근 세포의 수축성 평가. x축은 시간 단위의 시간을 나타내고 y축은 매개변수 진폭을 백분율로 표시합니다. 별표는 p < 0.05 (*) 또는 p < 0.01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney 검정, n = 4)로 통계적 유의성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 5일 동안 심독성 안트라사이클린 에피루비신으로 처리된 인간 iPSC 유래 심근세포의 수축성 평가. x축은 시간 단위의 시간을 나타내고 y축은 매개변수 진폭을 백분율로 표시합니다. 별표는 p < 0.05 (*) 또는 p < 0으로 통계적 유의성을 나타냅니다. 01 (**) (윌콕슨 만 휘트니 검정, n = 4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 독소루비신 치료 후 인간 iPSC 유래 심근 세포의 기본 임피던스. 인간 iPSC 유래 심근세포의 기본 임피던스의 시간 경과를 300, 1, 3 및 10 μM 독소루비신에 24시간 노출시켰다(n=5). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 인간 iPSC 유래 심근 세포의 임피던스 및 EFP 기록. (A) 3, 10, 30 및 100 nM 니페디핀에 노출되었을 때 24 시간 동안 인간 iPSC 유래 심근 세포의 기본 임피던스의 시간 경과 (n = 5). (B) 3, 10, 30 및 100 nM 니페디핀에 노출되었을 때 1 시간 동안 인간 iPSC 유래 심근 세포의 전위 지속 시간의 시간 경과 (n = 5). (C) 임피던스 / EFP 플레이트의 전극 레이아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 20분 동안 니페디핀으로 처리된 인간 iPSC 유래 심근 세포의 수축성 평가(수축성 모듈). x축은 시간을 분 단위로 표시하고 Y축은 매개변수 진폭을 백분율로 표시합니다. 별표는 p < 0인 통계적 유의성을 나타냅니다. 05 (*) 또는 p < 0.01 (**) (윌콕슨 만 휘트니 검정, n = 4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 수축성 모듈로 평가된 수축성 매개변수 및 원시 데이터. (왼쪽) 수축성 모듈로 평가된 파라미터. 매개변수: 수축력의 진폭(mN/mm2), 비트 지속 시간, 업스트로크 및 다운스트로크 속도, 업스트로크 및 다운스트로크 곡선 아래 영역(AUC), 비트 속도, 비트 속도 변화, 부정맥 이벤트. (오른쪽) 처리되지 않은 심근세포가 있는 한 웰의 수축성 원시 데이터 기록은 (A) 박동 속도, (B) 박동 속도 변화, (C) 수축 후 초기, 및 (D) 부정맥 사건. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 수축성 및 임피던스/EFP 측정을 위한 워크플로우. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 96웰 플레이트에 대한 측정 계획의 레이아웃 예. 4개의 농도와 4개의 반복실험을 가진 4개의 화합물(빨간색, 밝은 녹색, 갈색 및 짙은 녹색으로 강조 표시됨)이 묘사됩니다. 양성 및 음성 대조군(예: 배양 전 조건 및 DMSO)은 노란색으로 강조 표시됩니다. 백업 셀은 파란색으로 강조 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: 화합물 첨가 전 수축성 모듈을 사용한 수축성 기준선 측정의 예제 데이터. 각 차트에는 한 번의 스윕에 대한 모든 수축 주기의 평균이 표시됩니다. 박동 속도를 시각화하기 위해 두 개의 연속 수축이 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
임피던스/EFP/수축성 하이브리드 시스템은 전임상 약물 개발을 위한 심장 책임에 대한 고처리량 안전성 약리학적 및 독성학적 평가를 위한 포괄적인 방법론입니다. 동물 모델을 사용하지 않고 전임상 안전성 테스트를 위한 현대적인 접근 방식을 제공하지만 시간과 비용을 크게 줄이는 더 높은 처리량 기능을 제공합니다. 이 시스템은 전임상 기능 및 구조적 독성 평가를 위한 Langendorff Heart 및 기타 동물 모델에 대한 보완적인 접근 방식으로 사용될 가능성이 있습니다.
무동물 접근법으로서, 인간 iPSC-CM이 하이브리드 시스템(20)에 채용된다. 여기서, 인간 iPSC-CM에 대한 성숙 촉진 효과가 있는 특수한 유연한 96웰 플레이트는 처리량과 생리학적 환경이 보다 성인과 같은 인간 심장 위험 평가(6,15)를 위해 고유하게 결합되기 때문에 다른 세포 기반 분석(21,22)과 비교하여 중요한 이점을 제공한다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 특히 급성 효과를 검사해야 할 때 화합물의 적용입니다. 세포는 기계적 힘을 전도하는 부드러운 기질에서 배양되기 때문에 플레이트 취급 중 과도한 가속 및 피펫팅 중 전단력 적용은 수축 매개변수의 일시적(5-10분) 변경을 초래할 수 있으므로 피해야 합니다. 일반적으로 멤브레인의 파손을 방지하기 위해 매체를 교체하는 동안주의를 기울여야합니다. 실험실 자동화 장비를 사용하는 것이 좋습니다.
화합물 분석을 수행하기 전에 5-7일의 사전 배양 단계가 필요하므로 일반적으로 냉동 보존 상태에서 획득한 인간 iPSC-CM이 해동 절차에서 회복되어 적절한 융합을 구축할 수 있습니다. 두 모듈 모두에서 수축 진폭과 박동 속도는 일반적으로 5-7일 사이에 발생하는 측정의 이상적인 시작점에 대한 통찰력을 제공합니다. 기준선 측정은 연구된 hiPSC-CM에 대한 포함 기준으로 사용되는 기능적 기준선 특성을 식별하기 위한 중요한 단계입니다3. 수축 거동의 변화를 비처리 조건과 비교할 수 있도록 복합 처리 직전에 기준선 값을 기록해야 합니다(보충 그림 3).
변동성을 고려하고 기준선 특성을 정의하는 것은 hiPSC-CM 및 데이터 해석의 성공적인 측정의 핵심입니다. 이러한 이유로 Gintant 등의 모범 사례 권장 사항은 하이브리드 세포 분석 시스템을 사용하여 따릅니다. 예를 들어, 기준선은 화합물 첨가 전에 기록되어야 하고, 기준선 기록은 특정 전제조건(3)을 충족해야 한다.
유연한 96웰 플레이트에는 깨지기 쉬운 멤브레인이 장착되어 있지만 조심스럽게 취급할 수 있는 보호 플레이트가 제공되면 손상을 방지할 수 있습니다. 멤브레인은 고유 생체 적합성이 낮은 실리콘 기판에 세포를 안정적으로 부착할 수 있도록 전처리됩니다. 치료는 최소 6 개월 동안 안정적입니다. 셀이 37°C에서 일정하게 유지되는 동안, 실리콘 재료의 기계적 특성은 광범위한 온도 범위에서 안정하다. 또한 약물이나 용매는 세포 기반 분석에 사용되는 농도에서 실리콘의 특성에 영향을 미치지 않습니다(예: DMSO 농도는 0.1% 미만으로 유지됨).
이 시스템은 상업적으로 이용 가능한 광범위한 hiPSC-CM으로 검증 및 최적화되었습니다. 맞춤형 세포를 사용하는 경우 최적의 세포 부착을 위해 표준 세포외 기질(ECM) 단백질(예: 피브로넥틴, EHS 매트릭스 및 폴리-L-라이신 6,15)을 테스트하는 것이 좋습니다.
전기 생리학, 칼슘 신호 전달 및 수축성은 전임상 개발에서 다루어지는 세 가지 주요 심장 종점입니다. 하이브리드 시스템은 현재 이러한 심장 종점 중 두 가지인 수축성과 전기 생리학을 분석하는 것으로 제한됩니다. 심근 세포의 칼슘 신호 전달은 직접 분석 할 수 없지만 수축성 및 전기 생리 학적 특성을 통해 접선 방향으로 검출됩니다.
임피던스/EFP와 수축력 측정은 모두 심근세포의 단층으로 수행됩니다. 수축 측정 동안 생리학적 기계적 기질 강성의 이점에도 불구하고, 세포는 실제 인간 조직의 3차원 환경을 경험하지 않는다. 반면에, 이것은 표준 실험실 장비로 값 비싼 줄기 세포 유래 세포 모델의 일부만을 사용할 수있게합니다. 따라서 이 응용 프로그램은 in vivo/ex vivo 또는 3D 모델에 비해 비용, 견고성 및 예측 가능성의 유리한 관계를 약속합니다. 하이브리드 시스템의 향후 적용에는 평활근 세포와 같은 다른 수축 세포 유형의 분석이 포함될 수 있습니다. 심혈관 항상성의 조절에서, 이들 세포는 심근 세포의 대응 물로서 중요한 역할을한다. 하이브리드 시스템은 또한 인간 iPSC-CM의 광학 자극과 같은 특정 프로젝트를 위한 추가 기능을 제공합니다. 이를 위해 전용 광학 뚜껑을 두 모듈에 적용하여 전배양 시간 동안 채널로돕신-2로 형질감염된 인간 iPSC-CM을 자극할 수 있습니다.
따라서 임피던스/EFP/수축성 하이브리드 시스템은 하나의 방법론 내에서 세 가지 다른 심장 종말점(수축성, 구조적 변화 및 전기생리학)을 분석하여 현대적인 전임상 안전성 및 독성 평가를 가능하게 합니다. 높은 처리량 수준에서 인간 기반 심장 세포 모델로 이러한 종말점을 해결하는 이점은 이 하이브리드 시스템을 전임상 심장 위험 평가의 현재 관점 이상으로 끌어올립니다.
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Disclosures
B.L., M.GO. 및 P.L.은 플렉시블 플레이트 제조업체인 INNOVitro GmbH에 고용되어 있습니다. U.T., E.D., M.L., M.Ge., NF 및 S.S.는 하이브리드 장치 제조업체인 Nanion Technologies GmbH에 고용되어 있습니다.
Acknowledgments
이 작업은 독일 연방 경제 및 기후 행동부 (ZIM)와 독일 연방 교육 연구부 (KMUinnovativ)의 보조금으로 지원되었습니다. 심근 세포를 친절하게 제공 한 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (미국 위스콘신 주 매디슨)와 심근 세포를 친절하게 제공 한 Ncardia B.V. (네덜란드 라이덴)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
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