Hybridcellanalyssystem för att bedöma strukturella och kontraktila förändringar av humana iPSC-härledda kardiomyocyter för preklinisk hjärtriskutvärdering
Summary
Analysen av förändringar i kontraktil funktion och cellulär integritet hos humana iPSC-härledda kardiomyocyter är av enorm betydelse för icke-klinisk läkemedelsutveckling. Ett hybrid 96-brunns cellanalyssystem adresserar båda parametrarna på ett realtids- och fysiologiskt sätt för tillförlitliga, människorelevanta resultat, nödvändiga för en säker övergång till kliniska stadier.
Abstract
Hjärtkontraktilitetsbedömning är av enorm betydelse för utvecklingen av nya terapier och deras säkra övergång till kliniska stadier. Medan humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) lovar att fungera som en människorelevant modell i prekliniska faser av läkemedelsupptäckt och säkerhetsfarmakologi, är deras mognad fortfarande kontroversiell i det vetenskapliga samfundet och under ständig utveckling. Vi presenterar en hybridkontraktilitet och impedans/extracellulär fältpotential (EFP) -teknik, vilket ger betydande pro-mognadsfunktioner till en branschstandard 96-brunnsplattform.
Impedansen/EFP-systemet övervakar mobilfunktionaliteten i realtid. Förutom takthastigheten för kontraktila celler upptäcker de elektriska impedansspektroskopiavläsningarna föreningsinducerade morfologiska förändringar som celldensitet och integritet hos det cellulära monoskiktet. I den andra komponenten i hybridcellanalyssystemet odlas cellerna på biokompatibla membran som efterliknar den mekaniska miljön i verklig hjärtvävnad. Denna fysiologiska miljö stöder mognad av hiPSC-CMs in vitro, vilket leder till mer vuxenliknande kontraktila svar inklusive positiva inotropa effekter efter behandling med isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil. Parametrar som amplituden för sammandragningskraft (mN/mm2) och slagvaraktighet avslöjar också nedströmseffekter av föreningar med påverkan på elektrofysiologiska egenskaper och kalciumhantering.
Hybridsystemet ger det perfekta verktyget för holistisk cellanalys, vilket möjliggör preklinisk hjärtriskbedömning utöver de nuvarande perspektiven för humanrelevanta cellbaserade analyser.
Introduction
Ett av de viktigaste målen med modern läkemedelsutveckling är att förbättra framgångsgraden från bänk till säng för nya terapier i pipelinen för läkemedelsupptäckt. Säkerhetsfarmakologiska tester av dessa nya läkemedel avslöjar ofta biverkningar på hjärt-kärlsystemet som står för nästan en fjärdedel av läkemedelsförlusten vid prekliniska stadier1. Utvecklingen och integrationen av nya metodmetoder (NAMs) spelar en nyckelroll i moderniseringen av preklinisk bedömning, särskilt kärnbatteriorgan som hjärtat. Eftersom dessa metoder är djurfria tillvägagångssätt blev användningen av människobaserade cellmodeller som kardiomyocyter (CM) av inducerat pluripotent stamcellsursprung (iPSC) arbetshästen under det senaste decenniet för den moderna bedömningen av säkerhetsfarmakologiska och toxikologiska frågor2. Allmänt använda analyssystem för sådana undersökningar är mikroelektrodmatris (MEA) och spänningskänsliga färgämnesbaserade experimentella metoder3.
Icke desto mindre sätter den påstådda fenotypiska och funktionella omogenheten av denna celltyp hinder i vägen för en idealisk människobaserad cellmodell, med potential att minska translationella luckor mellan icke-kliniska och kliniska studier4.
Enorm forskning har genomförts genom åren för att förstå orsaken till den underförstådda omogna fenotypen och för att hitta sätt att driva mognadsprocessen för humana iPSC-CMs in vitro.
Brist på hjärtmognadssignaler som förlängda cellodlingstider, frånvaro av andra celltyper i närheten eller brist på hormonell stimulering visade sig påverka mognadsprocessen5. Den icke-fysiologiska miljön hos vanliga cellodlingsplattor identifierades också som en signifikant orsak som hindrar mognaden av humana iPSC-CM på grund av den saknade fysiologiska substratstyvheten hos det ursprungliga mänskliga hjärtat 5,6.
Olika analyssystem med fokus på inhemska fysiologiska förhållanden utvecklades för att hantera denna fråga, inklusive 3D-cellodlingssystem där celler är inriktade tredimensionellt för att likna inhemsk hjärtarkitektur istället för typiska tvådimensionella cellkulturer7. Även om förbättrad mognad uppnås med 3D-analyser, hindrar behovet av en kvalificerad arbetskraft och den låga genomströmningen av dessa system en riklig användning av detta i läkemedelsutvecklingsprocessen, eftersom tid och kostnad spelar en grundläggande roll i bedömningen av nya terapier på finansiell nivå8.
Viktiga avläsningar för säkerhetsfarmakologisk och toxikologisk bedömning av nya terapier är förändringar i funktionella och strukturella egenskaper hos humana iPSC-CM, eftersom sammansatta inducerade biverkningar i hjärt-kärlsystemet vanligtvis påverkar en eller båda av dessa egenskaper 1,9. Välkända exempel på sådana breda biverkningar är läkemedel mot cancer i antracyklinfamiljen. Här rapporteras farliga funktionella och negativa strukturella effekter på hjärt-kärlsystemet i stor utsträckning under och efter cancerbehandling hos patienter samt med in vitro-cellbaserade analyser10,11.
I den aktuella studien beskriver vi en omfattande metodik för bedömning av både funktionella och strukturella sammansatta biverkningar på hiPSC-CM. Metodiken inkluderar analys av kardiomyocytkontraktil kraft och impedans / extracellulär fältpotential (EFP) analys. Den kontraktila kraften mäts under fysiologiska mekaniska förhållanden, med cellerna odlade på mjuka (33 kPa) silikonsubstrat, vilket återspeglar den mekaniska miljön i naturlig mänsklig hjärtvävnad.
Systemet är utrustat med 96-brunnsplattor för analys med hög genomströmning av humana iPSC-CM för prekliniska hjärtsäkerhetsfarmakologiska och toxikologiska studier, och ger därmed en fördel för för närvarande använda 3D-metoder som Langendorff-hjärta eller hjärtskivor12,13.
I detalj består hybridsystemet av två moduler, antingen för bedömning av hjärtkontraktilitet under fysiologiska förhållanden eller analys av cellulär strukturell toxiciteti realtid 6,14. Båda modulerna arbetar med specialiserade 96-brunnsplattor med hög genomströmning för snabb och kostnadseffektiv datainsamling.
Utan behov av en 3D-konstruktion använder kontraktilitetsmodulen specialplattor som innehåller flexibla silikonmembran som substrat för cellerna istället för det styva glaset eller plasten som vanliga cellodlingsplattor vanligtvis består av. Membranen återspeglar typiska humana biomekaniska hjärtegenskaper och efterliknar därför in vivo-förhållanden på ett sätt med hög genomströmning. Medan humana iPSC-CMs ofta misslyckas med att visa vuxen kardiomyocytbeteende angående sammansatt inducerad positiv inotropi i andra cellbaserade analyser14, kan en mer vuxenliknande reaktion bedömas när cellerna odlas på plattorna i kontraktilitetsmodulen. I tidigare studier har det visats att iPSC-CM uppvisar positiva inotropa effekter vid behandling med föreningar som isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil 6,15. Här kan flera kontraktilitetsparametrar bedömas, såsom primära parametrar som amplituden för sammandragningskraft (mN / mm2), slagvaraktighet och slaghastighet, samt sekundära parametrar för kontraktionscykeln som område under kurvan, sammandragning och avslappningslutningar, takthastighetsvariationer och arytmier (kompletterande figur 1)16 . Läkemedelsinducerade förändringar i alla parametrar bedöms icke-invasivt genom kapacitiv avståndsavkänning. Rådata analyseras därefter av specialiserad programvara.
Den strukturella toxicitetsmodulen lägger till sina unika impedans- och EFP-parametrar som en avläsning för strukturell cellulär toxicitet och analys av elektrofysiologiska egenskaper17,18. Den elektriska impedansspektroskopitekniken avslöjar föreningsinducerade förändringar i celldensitet eller cell- och monolagerintegritet övervakad i realtid, vilket visas med humana iPSC-CM behandlade med kända kardiotoxiska föreningar13. Med impedansavläsningar vid olika frekvenser (1-100 kHz) är det möjligt att dissekera ett fysiologiskt svar ytterligare, och därmed är det möjligt att avslöja förändringar i membrantopografi, cell-cell- eller cellmatriskorsningar. Den ytterligare EFP-registreringen av humana iPSC-CM möjliggör ytterligare analys av elektrofysiologiska effekter som framkallas av föreningsbehandling, vilket visades i ljuset av CiPA-studien17,19.
I den aktuella studien användes humana iPSC-CM, behandlade med epirubicin och doxorubicin, båda väl beskrivna som kardiotoxiska antracykliner, och erlotinib, en tyrosinkinashämmare (TKI) med en ganska låg risk för kardiovaskulär toxicitet. Kronisk bedömning med epirubicin, doxorubicin och erlotinib utfördes i 5 dagar. Resultatet visar mindre förändringar i kontraktilitet och basimpedans när celler behandlades med erlotinib, men en tids- och dosberoende toxisk minskning av kontraktionsamplitud och basimpedans vid behandling med epirubicin respektive doxorubicin. Akuta mätningar utfördes med kalciumkanalblockeraren nifedipin och visar en minskning av sammandragningsamplituden, fältpotentialvaraktighet och basimpedans, vilket visar kardiotoxiska biverkningar av denna förening på funktionella såväl som strukturella nivåer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hybridsystemet impedans/EFP/kontraktilitet är en omfattande metod för farmakologisk och toxikologisk bedömning av hjärtskulder för preklinisk läkemedelsutveckling med hög genomströmning. Det ger ett modernt tillvägagångssätt för preklinisk säkerhetstestning utan användning av djurmodeller, men med högre genomströmningskapacitet som avsevärt minskar tid och kostnader. Detta system har potential att användas som ett kompletterande tillvägagångssätt för Langendorff Heart och andra djurmodeller för pre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från det tyska federala ministeriet för ekonomi och klimatåtgärder (ZIM) och från det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (KMUinnovativ). Vi tackar FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) för att vänligen tillhandahålla kardiomyocyter och Ncardia B.V. (Leiden, Nederländerna) för att vänligen tillhandahålla kardiomyocyter, som används i denna studie.
Materials
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. Today’s challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
