Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تحرير الجينوم الفعال للفئران بواسطة كريسبر التثقيب الكهربائي للزيجوت

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

هنا ، نصف تقنية بسيطة مخصصة للتوليد الفعال للفئران المعدلة وراثيا تسمى CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). توفر هذه الطريقة كواشف التحرير عن طريق التثقيب الكهربائي في الأجنة بكفاءة تقترب من 100٪. هذا البروتوكول فعال للطفرات النقطية ، والإدخالات الجينومية الصغيرة ، والحذف في أجنة الثدييات.

Abstract

بفضل الكفاءة والدقة والسهولة الاستثنائية ، قام نظام CRISPR / Cas9 بتحسين تحرير الجينوم بشكل كبير في زراعة الخلايا والتجارب المعملية على الحيوانات. عند توليد نماذج حيوانية ، يوفر التثقيب الكهربائي للزيجوت كفاءة أعلى وبساطة وتكلفة وإنتاجية كبديل للطريقة القياسية الذهبية للحقن المجهري. التثقيب الكهربائي ألطف أيضا ، مع قابلية أعلى للحياة ، ويوفر بشكل موثوق Cas9 / أحادي التوجيه RNA (sgRNA) البروتينات النووية الريبية (RNPs) في زيجوت سلالات الفئران المختبرية الشائعة (على سبيل المثال ، C57BL / 6J و C57BL / 6N) التي تقترب من كفاءة التوصيل بنسبة 100٪. تتيح هذه التقنية طفرات الإدراج / الحذف (indels) ، والطفرات النقطية ، وحذف الجينات الكاملة أو الإكسونات ، والإدخالات الصغيرة في نطاق 100-200 نقطة أساس لإدراج LoxP أو العلامات القصيرة مثل FLAG أو HA أو V5. بينما يتم تحسينها باستمرار ، نقدم هنا الحالة الحالية ل CRISPR-EZ في بروتوكول يتضمن إنتاج sgRNA من خلال النسخ في المختبر ، ومعالجة الأجنة ، وتجميع RNP ، والتثقيب الكهربائي ، والتنميط الجيني للأجنة قبل الزرع. يمكن للباحث على مستوى الدراسات العليا مع الحد الأدنى من الخبرة في التعامل مع الأجنة الحصول على الأجنة المعدلة وراثيا في أقل من 1 أسبوع باستخدام هذا البروتوكول. هنا ، نقدم طريقة مباشرة ومنخفضة التكلفة وفعالة وعالية السعة يمكن استخدامها مع أجنة الفئران.

Introduction

تم تبسيط تحرير الجينوم في الفئران الحية إلى حد كبير وأصبح متاحا وبأسعار معقولة منذ ظهور تحرير كريسبر1،2،3. استخدمت محاولات التحرير الأولية للحيوانات الحقن المجهري لتوصيل كريسبر Cas9 mRNA / sgRNA إلى أجنة في المرحلة النووية4،5،6. في حين أن الحقن المجهري فعال للغاية ، فإن مقدار الممارسة المطلوبة لإتقانه بالكامل قد لا يكون مناسبا للمتدربين والطلاب ويتطلب أيضا معدات باهظة الثمن لا يستطيع المختبر الممول بشكل متواضع تحملها. عادة ما يتم إجراء الحقن المجهري من قبل فنيين خبراء في مرافق معدلة وراثيا مع جداول زمنية وأسعار خدمة تحدد المعدل للعديد من الباحثين. وهناك نهج أكثر سهولة هو نهج التثقيب الكهربائي ، والذي ثبت أنه فعال للغاية لتوصيل كريسبر Cas9 mRNA / sgRNA إلى أجنة في المرحلة النووية7. اقترحت التحسينات الإضافية في استراتيجيات تحرير وتسليم جينوم كريسبر أن RNPs المجمعة مسبقا والتي تعمل بالفعل مع sgRNAs قد تكون وسيلة فعالة لتقليل الفسيفساء8.

كان الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذا البروتوكول هو تجاوز العديد من القيود والعقبات المرتبطة بالحقن المجهري. كما يوحي الاسم ، فإن الطريقة السهلة والداخلية والفعالة من حيث التكلفة والتي يمكن أن تحدد بسرعة ما إذا كانت تصميمات sgRNA غير المختبرة ستكون جديرة بالاستخدام أثناء تجربة الحقن المجهري ستكون خطوة مراقبة جودة المرور الأولى مريحة للغاية (الشكل 1). في حين أن هذه الطريقة لا يمكن أن تحل محل الحقن المجهري لاستراتيجيات أكثر تعقيدا ، مثل إدخال تسلسلات الحمض النووي للمتبرع الطويل للنتائج القائمة على إعادة التركيب ، إلا أنها مثالية للاستراتيجيات الأقل تعقيدا مثل عمليات الحذف أو الإدراج الصغيرة ووضع علامات على الجينات. هذه الطريقة مناسبة للباحثين ذوي المهارات الأساسية لمعالجة الأجنة الذين لديهم احتياجات تحرير بسيطة ، أو يرغبون في اختبار فرضيتهم ضمن الإطار الزمني لتطوير ما قبل الزرع ، أو يفضلون اختبار sgRNAs في الأجنة قبل تحديد موعد مع أخصائي الحقن المجهري. هنا ، يتم تسليم كواشف التحرير بشكل عابر إلى أجنة في المرحلة النووية مثل Cas9 / sgRNA RNPs عبر التثقيب الكهربائي (سلسلة من النبضات الكهربائية) لزيادة الكفاءة إلى أقصى حد مع تقليل الفسيفساء8. باستخدام طريقة التنميط الجيني للجنين ، تتوفر نتائج التحرير في حوالي 1 أسبوع9 ، مما يقلل من الحاجة إلى تطبيقات الحقن المجهري المختلفة بتكلفة منخفضة بشكل كبير.

تبلغ فعالية هذه الطريقة ذروتها في مرحلة الجنين الطليعي النواة ، عندما لا يكون الجنين قد دمج بعد نوى الأم والأب أو دخل المرحلة S (الشكل 2). يستخدم التبويض الفائق لزيادة عدد الزيجوتات إلى أقصى حد، ولكنه ينتج كلا من الزيجوت الطليعي النووي والبيض غير المخصب. يمكن أيضا اختيار الزيجوت الصحي مسبقا قبل التثقيب الكهربائي لزيادة الكفاءة الكلية. نظرا لأن بروتوكولات التثقيب الكهربائي الأخرى قد حررت الزيجوت بكفاءة دون الحاجة إلى تضمين خطوة مماثلة7،10،11،12،13،14،15 ، فإن الخطوة الاختيارية لهذا البروتوكول هي التآكل الطفيف للمنطقة الشفافة (ZP). ZP عبارة عن طبقة بروتين سكري تساعد على ربط الحيوانات المنوية ، واستجابة الجسيم القمي ، والإخصاب المحيط بالأجنة في المرحلة الأولية. في تجربتنا ، وجدنا أن التآكل اللطيف القائم على الحمض ل ZP يوفر توصيلا موثوقا به للثقب الكهربائي Cas9 RNP مع تأثير هامشي فقط على الجدوى.

لقد لاحظنا معدلات توصيل RNP بكفاءة تصل إلى 100٪ عن طريق التثقيب الكهربائي في سلالات الماوس التي يشيع استخدامها في أبحاث مثل C57BL / 6J و C57BL / 6N 9,16. طورت مجموعات مستقلة أيضا إجراءات قائمة على التثقيب الكهربائي بكفاءة أكبر من أو مطابقة الحقن المجهري 11،12،13،14،15،17 ، مع بروتوكولات التثقيب الكهربائي التي تعمل بشكل جيد في الفئران18،19 ، الخنزير 20،21،22 والبقرة 23 ، لذلك نقترح أن يقارن القراء البروتوكولات للعثور على الظروف التي تناسب احتياجاتهم التجريبية والمعدات. يستخدم النظام الموصوف هنا مواد ومعدات شائعة ، ولا يتطلب سوى مهارات التلاعب بالأجنة الأساسية. هذه التقنية فعالة لمجموعة من استراتيجيات التحرير ، مما يجعل هذه الطريقة متاحة على نطاق واسع لمجتمع البحث.

يعد تصميم دليل RNAs الصغير المثالي (sgRNAs) أمرا ضروريا للتحرير الفعال. نوصي بفحص اثنين إلى ثلاثة استراتيجيات sgRNA لكل موقع مستهدف مباشرة في أجنة الفئران ، خاصة إذا كان إنشاء خط الماوس مطلوبا. بمجرد التصميم ، يوصى باستخدام طرق خالية من الاستنساخ مثل النسخ في المختبر (IVT) لإنتاج sgRNAs عالية الجودة3. يتم خلط RNPs و sgRNAs مع 30-50 أجنة في المرحلة النووية المعالجة وتتعرض لسلسلة من النبضات الكهربائية لاختراق ZP وغشاء الخلية مؤقتا أولا ، مع نبضات لاحقة لإبقاء المسام مفتوحة والكهربائي RNPs من خلال الزيجوت24. بعد التحسين ، وجدنا أن ست نبضات 3 مللي ثانية عند 30 فولت للأجنة السائبة (~ 50) كانت مثالية لتحرير الفعالية والجدوى ، مما يوفر توصيل Cas9 / sgRNA RNP عالي الكفاءة9،16،25. يمكن تأكيد أحداث التحرير في توتية الماوس الفردية باستخدام مجموعة متنوعة من استراتيجيات التحقق الشائعة لتحرير كريسبر ، مثل تعدد الأشكال لطول شظية التقييد (RFLP) ، وهضم نوكلياز T7 ، وتسلسل سانجر لمنطقة الاهتمام26.

الطريقة الحالية هي الأنسب لمخططات التحرير البسيطة (الشكل 3) ، مثل الإدراج / الحذف (indels) ، وعمليات الحذف ذات الحجم الخارجي بترتيب 500-2000 نقطة أساس ، وتسليم طفرات النقاط والإدخالات الصغيرة مثل علامات C- أو N-Terminal (على سبيل المثال ، FLAG أو HA أو V5) 9،16،27. لا تزال إمكانية تحرير الجينوم المعقد ، مثل الإدخالات الكبيرة لعلامات الفلورسنت أو الأليلات الشرطية ، غير مؤكدة وهي محور التركيز الحالي للتحسينات القادمة.

يمكن إتقان هذه الطريقة بسهولة ويمكن استخدامها لاختبار sgRNAs بسرعة في أجنة الفئران المستزرعة في أسبوع واحد9 (الشكل 1). يقدم في هذا العمل بروتوكول من ست خطوات ، والذي يتضمن 1) تصميم sgRNA. 2) توليف sgRNA. 3) الإباضة والتزاوج. 4) زراعة الأجنة وجمعها ومعالجتها ؛ 5) تجميع RNP والتثقيب الكهربائي ؛ 6) زراعة الأجنة والتنميط الجيني. يتم توفير معلومات حول جميع المواد المستخدمة (جدول المواد). كعنصر تحكم إيجابي ، تم تضمين الكواشف لتحرير موضع التيروزيناز (صور)9،16 في الجدول التكميلي 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

التزمت جميع رعاية الحيوانات واستخدامها في جميع أنحاء هذا البروتوكول بسياسات قانون رعاية الحيوان ودليل ILAR لرعاية واستخدام المختبر واتبعت إرشادات AVMA للقتل الرحيم وإرشادات وسياسات لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة بنسلفانيا (IACUC). تمت مراجعة بروتوكول رعاية الحيوان واستخدامه والموافقة عليه من قبل جامعة بنسلفانيا IACUC لهذا المشروع. على سبيل الامتثال والحذر ، يرجى البحث عن جميع التراخيص اللازمة قبل محاولة هذا البروتوكول.

1. sgRNA وتصميم oligo المانحين الاختياري

  1. تصميم sgRNA
    1. حدد sgRNAs المرشحة من أي خوارزميات مستخدمة على نطاق واسع عبر الإنترنت ، مثل Sequence Scan ل CRISPR (SSC ؛ http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/) 28 أو CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) 29. نظرا لأن كل منصة فريدة من نوعها ، يرجى قراءة تعليمات المستخدم بعناية من أجل تصميم sgRNAs مثالية. بالنسبة للتجارب in/del، حدد اثنين إلى ثلاثة sgRNAs لاختبارها. بالنسبة لعمليات الحذف ، يتم اقتراح sgRNAs التي تحيط بالمنطقة المستهدفة ، على سبيل المثال ، اثنين من sgRNAs في المنبع من الهدف واثنين من sgRNAs في اتجاه مجرى الهدف.
      ملاحظة: في حين أن خوارزميات sgRNA المختلفة عبر الإنترنت تأخذ في الاعتبار الأهداف خارج الأهداف لتجنب تصميمات sgRNA المعيبة ، فإن أداة BLAST من NCBI مفيدة في تأكيد جودة تسلسلات sgRNA المحددة.
    2. أدخل 19-20 نيوكليوتيدات (nt) محددة من الخطوة السابقة (1.1.1) في المنطقة المتغيرة من oligo sgRNA (الجدول التكميلي 1) وشراء sgRNA المركب كأوليغوس DNA مخصص.
      ملاحظة: تنقية الصفحة غير مطلوبة.
  2. (اختياري) تصميم oligo المانحة للإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) بوساطة الضرب.
    1. صمم قليل النوكليوتيد المناسب أحادي الشريط (ssODN) بناء على النتيجة التجريبية المرغوبة (طفرة النقطة الدقيقة ، إدخال loxP ، إدخال علامة صغيرة ، إلخ) ، مع الحفاظ على الطول الإجمالي إلى 100-200 nt مع أذرع متجانسة تبلغ 50 nt أو أكثر تحيط بالمنطقة الوسطى.
    2. لضمان كفاءة أعلى في الضرب ، صمم sgRNA ليكون مكملا ل ssODN30 ، واستبدل تسلسل الشكل المجاور للمسافة الأولية (PAM) بطفرة صامتة لمنع القطع المتكرر بواسطة إنزيم Cas9.
    3. اطلب ssODN باستخدام خيار oligo المخصص.

2. توليف sgRNA

  1. إنشاء قالب للنسخ في المختبر (IVT)
    1. لإنشاء قالب الحمض النووي ل sgRNA IVT من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد تفاعل IVT في أنبوب شريط PCR خال من الحمض النووي الريبي. (انظر الجدول التكميلي 2).
    2. استخدم شروط التدوير الحراري التالية:
      95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ 30 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 57 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 72 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ؛ ثم 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
    3. للتحقق من نجاح تفاعل PCR لقالب الحمض النووي sgRNA ، تم دمج 5 ميكرولتر من المنتج مع 1 ميكرولتر من صبغة تحميل 6x على هلام أغاروز 2٪ (بالوزن / المجلد).
      ملاحظة: حجم المنتج المتوقع هو 127 نقطة أساس. يمكن تخزين أي تفاعل PCR متبقي عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أشهر.
  2. النسخ في المختبر (IVT) من sgRNA
    1. لتوليد sgRNA ، قم بإعداد خليط التفاعل (T7 IVT وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) في أنبوب PCR ونفض الغبار لخلط الكواشف.
      ملاحظة: انظر الجدول التكميلي 3 للحصول على مثال لإعداد التفاعل. تفاعل IVT حساس للتلوث RNase. لذلك ، بذل قصارى جهدك لتوفير بيئة خالية من RNase.
    2. للسماح للتفاعل بالبدء والمضي قدما ، قم باحتضان خليط تفاعل IVT لمدة >18 ساعة عند 37 درجة مئوية إما في دورة حرارية أو كتلة حرارية.
    3. لتحلل قالب الحمض النووي الأصلي (الخطوة 2.1.3) ، أدخل 1 ميكرولتر من DNase I (وحدتان لكل تفاعل) واحتضان التفاعل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. لتعزيز ارتباط الحمض النووي الريبي بخرز التنقية المغناطيسية ، اجمع 129 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ في التفاعل ، والذي سيكون الآن 150 ميكرولتر.
    5. لإعادة تعليق حبات التنقية ، التي تميل إلى الاستقرار أثناء التخزين ، دوامة القسمة لمدة 10 ثوان على الأقل.
    6. لتنقية sgRNAs ، أضف 100 ميكرولتر من الخرزات المعاد تعليقها (الخطوة 2.2.5) إلى تفاعل IVT (الخطوة 2.2.4) واخلطها برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10x.
    7. للسماح بالربط ، اترك الخليط يرتاح عند RT لمدة 5 دقائق.
    8. لعزل sgRNA عن منتجات التفاعل غير المدمجة ، ضع التفاعل على الحوامل المغناطيسية لمدة 5 دقائق في RT وانتظر حتى تتشكل حبيبات صغيرة.
    9. لغسل sgRNAs ، تخلص أولا من المادة الطافية بعناية ثم أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ بعيدا عن الحبيبات.
      ملاحظة: أثناء خطوة غسل الإيثانول بنسبة 80٪ (حجم / حجم) ، من الأهمية بمكان تجنب إزعاج الحبيبات عن طريق السحب ، لأن هذا سيقلل من تركيزات sgRNA بشكل كبير. بدلا من ذلك ، ماصة برفق 80٪ من الإيثانول حتى يتم غمر الحبيبات ، وإزالة الحجم برفق باستخدام ماصة.
    10. كرر الخطوة السابقة (الخطوة 2.2.9) وجفف الحبيبات في الهواء لمدة لا تزيد عن 5-6 دقائق وإلا سيتم ربط sgRNA بشكل دائم بالخرز.
    11. قم بإخراج sgRNA ب 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز عن طريق سحب الحبيبات 10x ، والتحضين لمدة دقيقتين عند (RT) ، ثم وضعها مرة أخرى على الحامل المغناطيسي لفصل الخرز عن sgRNA المنقى الآن.
    12. لتقييم جودة وكمية sgRNA ، استخدم أداة مثل مقياس الطيف الضوئي أو المحلل الحيوي. بدلا من ذلك ، على هلام الأغاروز 2٪ ، قم بتشغيل 2 ميكرولتر من sgRNAs ، على غرار الخطوة 2.1.3.
      ملاحظة: يتم تأكيد الجودة من خلال نطاق واحد واضح. يمكن استخدام ما تبقى من sgRNA على الفور أو تخزينه في ظروف -80 درجة مئوية.

3. الإباضة

  1. لتوفير أجنة كافية لاختبار كل تصميم من تصميم sgRNA ، قم بالإباضة من اثنين إلى ثلاثة إناث C57BL / 6J تتراوح أعمارهن بين 3-5 أسابيع ، كما هو موضح سابقا9. يوصى بالكهرباء 20-30 جنينا لكل sgRNA لتوليد نتائج كافية لتأكيد الفعالية.
    ملاحظة: إذا نجح الإخصاب ، فتوقع 10-20 جنينا لكل تزاوج.
  2. للحث على الإباضة ، اتبع جدول حقن الهرمونات هذا:
    1. اليوم الأول: تطبيق 5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحوامل (PMSG) (100 ميكرولتر) من خلال حقنة داخل الصفاق (IP) باستخدام حقنة 26 جم في إناث الفئران البالغة من العمر 3-5 أسابيع.
    2. يوم 3: بعد 46-48 ساعة من حقن PMSG ، حقن 5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (hCG) (100 ميكرولتر) من خلال حقن IP للحث على الإباضة.
    3. لإعداد التربية ، قم بإقران الإناث 1: 1 مع ذكر من تربية موثوقة مباشرة بعد حقن قوات حرس السواحل الهايتية.
      ملاحظة: لمنع الهرمونات من التدهور وفقدان النشاط ، قم بإجراء الحقن في أقل من 30 دقيقة من الذوبان.

4. جمع الأجنة ومعالجتها

  1. جمع الأجنة
    1. للقتل الرحيم للإناث واسترداد المواد اللازمة ، كما هو موضح سابقا31 ، تأكد أولا من تأكيد الطريقة المناسبة وفقا للسياسات المؤسسية. على سبيل المثال ، استخدم اختناق CO2 و / أو خلع عنق الرحم و / أو طرق أخرى معتمدة.
      ملاحظة: عادة ، تظهر >75٪ من الإناث المحفزات بالهرمونات سدادات جماعية ، مما يشير إلى التزاوج الناجح.
    2. لمنع الشعر من جعل جمع الأنسجة صعبا ، ضع الإناث الرحيمة على ظهورهن ورش 70٪ (حجم / حجم) من الإيثانول على منطقة البطن ليتم فتحها جراحيا.
      ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، ينصح بإجراء الخطوات الجراحية في غطاء جيد التهوية من أجل الحفاظ على بيئة معقمة وتقليل احتمالية التلوث.
    3. لفتح تجويف البطن وإزالة قنوات البيض ، قم بقص طبقة الجلد / الشعر (تحت الجلد) بمقص جراحي ، وحدد موقع المبيضين (الشكل 4) ، الموجودان بالقرب من الكلى ويتشاركان جزءا من وسادة دهنية. تقع قنوات البيض بالقرب من المبايض (الشكل 4). قم بإزالة قناتي البيض جراحيا من الأنثى ووضعهما في قطرات فردية سعة 50 ميكرولتر من وسط M2 + BSA (4 مجم / مل BSA) (الشكل 5 أ).
      ملاحظة: يمكن عرض الإرشادات التفصيلية لهذا القسم من الإجراء بصريا31 أو اتباعها خطوة بخطوة9 باستخدام البروتوكولات المنشورة مسبقا.
    4. لتحرير مجمعات الخلايا الركامية والبويضة (CoCs) التي تحتوي على البويضات (الشكل 4) ، استخدم ملقط التشريح لشق أمبولة قناة البيض أثناء المشاهدة من خلال المجهر المجسم.
    5. لتقليل كمية الحطام (الدم والدهون والأنسجة) ، قم بنقل ودمج كل CoC في قطرة واحدة سعة 50 ميكرولتر من وسائط M2 + BSA مع ماصة محمولة باليد مضبوطة على 20-30 ميكرولتر لتجنب ترحيل الحطام.
  2. إزالة الخلايا الركامية
    1. للبدء في إزالة الخلايا الركامية من الزيجوت (الشكل 4) ، انقل CoCs بأقل قدر ممكن من الوسائط الإضافية إلى قطرة من 100 ميكرولتر M2 + hyaluronidase (الشكل 5B) ، واخلطها برفق عن طريق سحب CoCs حتى يتم فصل الأجنة بشكل واضح عن الخلايا الركامية الأصغر بكثير. تأكد من تقليل تعرض M2 + hyaluronidase للأجنة إلى الحد الأدنى ، لأنه قد يؤثر على البقاء.
      ملاحظة: يمكن للمرء إما التسخين المسبق (37 درجة مئوية) أو إضافة 50 ميكرولتر إضافية من M2 + hyaluronidase إذا لم تنفصل الأجنة عن الخلايا الركامية في غضون دقيقتين.
    2. لتخفيف الهيالورونيداز وإزالة الخلايا الركامية السائبة من الزيجوت ، استخدم ماصة تعمل بالفم لنقل الزيجوت إلى قطرة جديدة 50 ميكرولتر M2 + BSA.
      ملاحظة: تتطلب معظم الخطوات التي تتجاوز هذه النقطة استخدام ماصة تعمل بالفم ما لم يذكر خلاف ذلك. في حين أن خطر التلوث من المستخدم منخفض ، يوصى باستخدام مرشح هواء مضمن للحفاظ على بيئة معقمة. يرجى الرجوع إلى الطرق الموضحة سابقا لإعداد واستخدام هذه الأداة 9,31.
    3. باستخدام ماصة الفم ، مرر الأجنة عبر ما لا يقل عن أربع إلى خمس قطرات أخرى 50 ميكرولتر M2 + BSA لتقليل عدد الخلايا الركامية.
  3. (اختياري) ترقق المنطقة pellucida بمحلول حمض التيرود (AT).
    1. لتآكل المنطقة الشفافة للجنين وتقليل العوائق المادية الإضافية لتسليم الكاشف ، انقل الأجنة إلى قطرة 100 ميكرولتر من محلول AT قبل التسخين (37 درجة مئوية) على لوحة 60 مم (الشكل 5C). راقب الزيجوت باستمرار باستخدام مجهر مجسم حتى يتآكل حوالي 30٪ من المنطقة الشفافة9. يجب أن يكون إجمالي التعرض ل AT 60-90 ثانية. يمكن أن يؤدي التعرض المطول ل AT إلى إذابة المنطقة الشفافة تماما وتعريض بقاء الجنين للخطر.
      ملاحظة: للحصول على إرشادات وصور مفصلة لهذا القسم من الإجراء ، يرجى الرجوع إلى الطرق المنشورة مسبقا9،16.
    2. لتخفيف AT، استخدم ماصة الفم لتمرير الأجنة من خلال ما لا يقل عن أربع قطرات 50 ميكرولتر من M2 + BSA.
    3. لتحديد ما إذا كان قد تمت معالجة عدد مناسب من الأجنة ، استخدم مجهرا مجسما لعد الأجنة. اعتمادا على عدد الفئران الإناث المستخدمة ، يمكن للمرء أن يتوقع ما يقرب من 10-20 زيجوت قابلة للحياة لكل أنثى.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، ينبغي أن تكون الأجنة خالية نسبيا من الحطام الذي من شأنه أن يحول دون تقييم الكمية والنوعية. على سبيل المثال ، إذا كنت تستخدم خمس إناث ، فمن المحتمل أن تكون أعداد الزيجوت المتوقعة بين 50-100 ، وسيكون عداد الخلايا الميكانيكية مناسبا لتتبع الأجنة. من الشائع فقدان حوالي 10٪ -20٪ من الأجنة بسبب الفشل في الإخصاب أو التبويض بويضات منخفضة الجودة. خلال الخطوة التالية ، قم بتخزين الأجنة لفترة وجيزة في 50 ميكرولتر من M2 + BSA لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة في حاضنة.

5. تجميع RNP والتثقيب الكهربائي

  1. تجميع RNP
    1. لتجميع مركب RNP ، استخدم جداول الأمثلة المرفقة لدمج مخاليط التفاعل المناسبة بناء على استراتيجية التحرير المطلوبة في المخزن المؤقت RNP (100 mM HEPES pH 7.5 ، 750 mM KCl ، 5 mM MgCl 2 ، 50٪ جلسرين ، و 100 mM Tris (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد [TCEP] في ماء خال من النيوكلياز)
      ملاحظة: TCEP هو عامل اختزال مناسب ولكن له عمر نصف قصير في المحاليل المائية. لذلك ، أضف TCEP قبل تجميع مجمع RNP مباشرة.
      1. للحصول على إندلس غير متماثل للانضمام النهائي (NHEJ) ، راجع الجدول التكميلي 4.
      2. للتحرير بوساطة الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) ، راجع الجدول التكميلي 5.
      3. للاطلاع على عمليات الحذف الهندسية باستخدام sgRNAs المقترنة، يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 6.
        1. بغض النظر عن الاستراتيجية ، اجمع الكواشف المطلوبة في RT في أنبوب PCR.
        2. للسماح بتكوين مركب RNP ، احتضن الخليط لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
          ملاحظة: يمكن تخزين مجمع RNP في RT لمدة تصل إلى 1 ساعة.
  2. التثقيب الكهربائي
    1. لتخفيف BSA قبل التثقيب الكهربائي ، مرر الأجنة من خلال قطرتين على الأقل من 50 ميكرولتر من وسائط المصل المخفضة.
      ملاحظة: يزيد BSA من المقاومة أثناء التثقيب الكهربائي ويمكن أن يتلف الزيجوت.
    2. لتحضير وخلط الزيجوت (الخطوة 4.3.2) مع مركب RNP (الخطوة 5.1.1.2) للتثقيب الكهربائي ، ماصة الفم 25-30 أجنة في قطرة 10 ميكرولتر من وسائط المصل المخفضة ، ثم استخدم ماصة محمولة بإضافة 10 ميكرولتر من مركب RNP (الخطوة 5.1.1.2).
    3. لتخفيف الجلسرين اللزج من مركب RNP وتجانس العينة ، اخلطه عن طريق سحب 10x أو حتى لا يظهر الخليط علامات اللزوجة (نمط دوامة) باستخدام مجهر مجسم.
    4. لتحضير العينة لإدخالها في جهاز التثقيب الكهربائي ، ماصة 20 ميكرولتر من خليط الجنين + RNP في كفيت كهربي 0.1 سم مع تجنب الفقاعات.
    5. لتوصيل كواشف التحرير إلى الزيجوت ، قم بكهرباء الأجنة باستخدام بروتوكول الموجة المربعة مع هذه الشروط: 30 فولت ، 4-6 نبضات ، طول نبضة 3 مللي ثانية ، و 100 فترة نبضة.
    6. لاسترداد الزيجوت من الكوفيت ، استخدم ماصة يدوية لتوصيل 50 ميكرولتر من KSOM + BSA (1 مجم / مل BSA) إلى الجزء العلوي من الكوفيت لطرد الأجنة التي ربما استقرت في القاع. ماصة برفق هذا الخليط للخارج وعلى طبق 60 مم.
    7. كرر الخطوة 5.2.6 على الأقل 2x-3x وادمج كل تدفق على طبق 60 مم حتى يتم استرداد معظم الأجنة.
      ملاحظة: الانتعاش النموذجي هو >90٪ من الأجنة المحملة في الأصل. لضمان بقاء الجنين ، اختبر الحاضنة وتحقق من تواريخ انتهاء الصلاحية لجميع الكواشف. الأجنة عرضة لظروف الثقافة غير المثالية مثل درجة الحرارة ومستوى CO2 والرطوبة ودرجة الحموضة.

6. زراعة الأجنة والتنميط الجيني

  1. زراعة الأجنة
    1. لزراعة الزيجوت إلى المرحلة المرغوبة ، استخدم ماصة الفم لنقل 20-30 زيجوتا إلى قطرة من KSOM + BSA في صفيحة زراعة متوازنة مسبقا ونقل الأجنة إلى القطرة (الشكل 5D). احتضان اللوحة طوال الليل في 5٪ CO2 ، عند 37 درجة مئوية ، مع رطوبة 95٪.
      ملاحظة: قم بالتوازن المسبق عن طريق وضع لوحة استزراع 35 مم محضرة في حاضنة إما في اليوم السابق أو قبل 4 ساعات على الأقل من الحضانة (الشكل 5D).
    2. لتعزيز ظروف النمو المثالية ، انقل الأجنة المكونة من خليتين فقط في اليوم التالي إلى قطرة جديدة من خليط KSOM + BSA باستخدام مجهر مجسم والعودة إلى الحاضنة. تأكد من ترك أو التخلص من الأجنة الميتة أو غير المخصبة.
      ملاحظة: تنمو الأجنة في المرحلة البدائية النووية عادة لتصبح توتية بعد 72 ساعة من المزرعة والكيسات الأريمية بعد 84 ساعة.
  2. التنميط الجيني
    1. لتخفيف مكونات الوسائط التي قد تتداخل مع تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، اغسل أجنة التوتية / الكيسة الأريمية باستخدام ماصة الفم عن طريق المرور عبر قطرتين من DPBS.
    2. لتحميل أجنة مفردة للتحلل ، انقل الأجنة الفردية إلى بئر واحد من شريط تفاعل البوليميراز المتسلسل المكون من 8 آبار عن طريق ضبط ماصة على 1 ميكرولتر ، ثم أضف 10 ميكرولتر من محلول التحلل (50 mM KCl ، 10 mM Tris-HCl ph 8.5 ، 2.5 mM MgCl 2 ، 0.1 مجم / مل جيلاتين ، 0.45٪ Nonidet P-40 ، 0.45٪ توين 20 ، 0.2 مجم / مل بروتين K في H2 O الخالي من النيوكلياز).
      ملاحظة: أضف بروتيناز K قبل تحضير محلول التحلل مباشرة.
    3. لتحليل الأجنة ، قم ببرمجة دورة حرارية إلى 55 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، ثم قم بإلغاء تنشيط البروتين K مع حضانة لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية.
      ملاحظة: خاصة للمستخدمين لأول مرة ، حاول تجربة تحرير في موقع Tyr . تم تحسين سير العمل هذا ويمكن أن يكون بمثابة عنصر تحكم إيجابي. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين محللات الجنين عند 4 درجات مئوية لمدة 2-3 أيام أو في الفريزر لمدة تصل إلى أسبوعين قبل تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل. منع دورات التجميد والذوبان المتكررة.
    4. لزيادة فرص تحليل التنميط الجيني الناجح ، قم بإجراء إستراتيجية PCR متداخلة عن طريق تضخيم شظايا الحمض النووي الأطول قليلا التي تحيط بالموقع المستهدف بالإضافة إلى المناطق التي سيتم استخدامها لتضخيم جزء أكثر دقة من الحمض النووي. اتبع الشروط الواردة في الجدول التكميلي 7.
    5. اتبع شروط الدورة الحرارية المذكورة أدناه:
      95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
      30+ دورة: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 60 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 72 درجة مئوية لمدة 10 ثوان
      72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
    6. لإعداد المرحلة الثانية من استراتيجية تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخلة ، قم بإجراء تخفيف 1:10 لمنتج PCR الأول (الخطوة 6.2.5) وقم بتحميل 2 ميكرولتر من هذا في تفاعل PCR التالي (مع البادئات المصممة لتكون داخل amplicon السابق).
      ملاحظة: يجب تخفيف تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الأول لتقليل ترحيل البادئات المرافقة في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني. قم بإعداد PCR المتداخل باتباع الخطوات الواردة في الجدول التكميلي 8.
    7. ضع تفاعل PCR في جهاز تدوير حراري باستخدام ظروف الدورة التالية:
      95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
      30 دورة: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 60 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 72 درجة مئوية لمدة 10 ثوان
      72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
      ملاحظة: عادة ما تكون >90٪ من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ناجحة عندما يكون حجم amplicon 500 نقطة أساس أو أقل.
    8. (تحكم اختياري) بالنسبة للطفرات in/del بوساطة NHEJ باستخدام Tyr كعنصر تحكم إيجابي، قم بهضم 10 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخلة من الخطوة 6.2.7 عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات باستخدام 10 U من HinfI في تفاعل 20 ميكرولتر (انظر الجدول التكميلي 9). على هلام الأغاروز 2٪ ، قم بتشغيل المنتج المهضوم لتقييم التحرير واستخدام منتج PCR غير مهضوم كعنصر تحكم في التحميل. قم بتشغيل الجل عند 135 فولت لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: تم اختيار استخدام HinfI كإنزيم تقييد مناسب بسبب وجود موقع HinfI في مكان مناسب داخل المنطقة المستهدفة sgRNA والتي من المتوقع أن يتم استئصالها عند تحرير NHEJ الناجح. تم وصف طريقة ونتائج مفصلة سابقا 9,16.
    9. (تحكم اختياري) بالنسبة للطفرات بوساطة HDR باستخدام Tyr كعنصر تحكم إيجابي ، اهضم 10 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخلة من الخطوة 6.2.7 عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات باستخدام 10 U من EcoRI في تفاعل 20 ميكرولتر (انظر الجدول التكميلي 10). على هلام الأغاروز 2٪ ، قم بتشغيل المنتج المهضوم لتقييم التحرير واستخدام منتج PCR غير مهضوم كعنصر تحكم في التحميل. قم بتشغيل الجل عند 135 فولت لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يستفيد اختيار EcoRI كإنزيم تقييد تشخيصي من التسلسل الأصلي الموجود في المنطقة المستهدفة sgRNA ، حيث ، عند HDR الناجح ، يتم استبدال موقع HinfI الذي يحدث بشكل طبيعي بموقع EcoRI ، ويتم إجبار طفرة إزاحة الإطار التي تتداخل مع جين Tyr. بالنسبة لتحليل HDR ، قم بإجراء كل من تحليلات NHEJ (الخطوة 6.2.8) و HDR (الخطوة 6.2.9) على كل عينة حيث يمكن أن تحدث كلتا النتيجتين ويمكن أن تساعد في تحديد الفسيفساء. تم وصف طريقة ونتائج مفصلة سابقا 9,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تولد هذه الطريقة أكثر من 100 ميكروغرام من sgRNA (20 ميكرولتر بتركيز >6000 نانوغرام / لتر) لتجميع Cas9 / sgRNA RNP الفعال. عادة ما تنتج طريقة الإباضة الفائقة الروتينية الموصوفة هنا 10-20 جنينا قابلا للحياة لكل أنثى مسدودة. بسبب أخطاء التعامل والخسائر النموذجية المرتبطة بالتلاعب بالأجنة ، من المتوقع أن يتم تخصيب 80٪ من الأجنة وقابلة للحياة وفي حالة ممتازة بعد التثقيب الكهربائي. لمساعدة الباحثين في تنفيذ تجربة ناجحة ، قدمنا مثالا على استراتيجية لاستهداف موضع صور للفأر كعنصر تحكم إيجابي (الشكل 6) ، بما في ذلك تصميمات oligo (الشكل 6A ، الجدول التكميلي 1) واستراتيجيات التنميط الجيني لكل من أحداث NHEJ و HDR (الشكل 6B) (الخطوة 6.2). تتوفر أمثلة مفصلة للنجاح التجريبي والنتائج 9,16.

في محاولة سابقة لمقارنة هذا البروتوكول بالحقن المجهري ، بشكل جماعي ، كانت أكثر من 30 محاولة تحرير متميزة تتضمن سبعة مختبرات متميزة لإنشاء نماذج فأرة ناجحة 9,16. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذه الطريقة للتحقيق والإبلاغ عن أول ارتداد أساسي في تطور الثدييات27. عند استخدام استراتيجية بسيطة مثل توصيل sgRNA واحد ، كان تسليم RNPs يصل إلى 100٪ في سلالات الماوس C57BL / 6J و C57BL / 6N ، مع حدوث تكوين في / del بنسبة 50-100٪ وبدائل صغيرة قائمة على oligo تتراوح من 14٪ -63٪ 9,16 (الجدول 1). عند هندسة عمليات الحذف الجينومية ، يمكن أن تختلف فعالية التحرير من 3٪ إلى 100٪ ، حيث تشمل العوامل المساهمة الموقع الجينومي وتصميم sgRNA وحجم الحذف (الجدول 2). على سبيل المثال ، عمليات الحذف الأصغر من 1,000 نقطة أساس تكون أكثر نجاحا من تلك الأكبر من 1,000 نقطة أساس 9,16.

عند استخدام 60 جنينا للتثقيب الكهربائي ، يتجاوز هذا البروتوكول الحقن المجهري من حيث فعالية التحرير ، مما ينتج عنه 3-4 مؤسسة مقارنة بمؤسس واحد من الحقن المجهري9. بالنسبة لتجارب خروج المغلوب الجيني في سلالة الفئران C57BL / 6N باستخدام sgRNA متطابقة ، تفوقت هذه الطريقة على الحقن المجهري ، مما أسفر عن متوسط أربعة مؤسسة9 (الجدول 2). بالنسبة للإدخالات الصغيرة ، مثل وضع علامات V5 أو HA ، تم اختبار ssODNs حتى 162 nt بنجاح ، وتهدف الجهود حاليا إلى توسيع نطاق 1000-2000 nt. يعتمد نجاح هذه التجارب إلى حد كبير على فعالية sgRNA المستخدمة لتكون نتائج HDR قوية. جميع نتائج HDR تقريبا هي فسيفساء ، ولكن ما بين 31٪ -64٪ من الأجنة تظهر بعض الأدلة على الإدراج 9,16.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على كريسبر-EZ. نظرة عامة رسومية على سير العمل. بمجرد وضع استراتيجية وتصميم ، يمكن إنشاء الأجنة المحررة واختبارها في حوالي 1 أسبوع. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. وتشن وآخرون 16. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: التوقيت المثالي لتنفيذ الإجراء. يوضح الشكل السمات والنقاط الزمنية ذات الصلة أثناء الانقسام الخلوي الأول بعد الإخصاب. لتنفيذ هذا النهج ، يتم تزويد الباحثين ببعض القرائن المرئية ، مثل التغيرات المورفولوجية ، وتقديرات وقت دورة الخلية ، والعلامات الكيميائية التي يتم ملاحظتها بشكل متكرر قبل الانقسام الأول. نظرا لأن التوقيت الدقيق للتلقيح والإخصاب غير معروف ، فإن التوصية المعقولة هي اعتبار الساعة 0 منتصف الليل. قبل دخول الزيجوت إلى المرحلة S هي اللحظة المثالية لتقديم آلات التحرير إما ل NHEJ أو HDR ، والتي تترجم إلى تنفيذ هذا البروتوكول بين الساعة 7 صباحا و 11 صباحا في الصباح. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: نجاح استراتيجيات التحرير. تؤدي الاستراتيجيات البسيطة مثل sgRNA واحد إلى إدخال / del عبر إصلاح NHEJ أو طفرة دقيقة عند دمجها مع قالب ssODN من خلال HDR. يمكن أيضا استخدام إصلاح NHEJ لعمليات الحذف باستخدام sgRNAs متعددة. بشكل عام ، كلما كانت الإستراتيجية أبسط ، كانت CRISPR-EZ أكثر فعالية دون مزيد من التحسين. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تحديد موقع قناة البيض والأمبولة. بعد عزل الأنسجة التناسلية جراحيا ، يجب على المرء تأمين المنطقة عن طريق الضغط اللطيف على وسادة الدهون بالملقط. وسادة الدهون هي منطقة آمنة نسبيا للتلاعب بها حتى لا تضر المبايض / قناة البيض. يجب إزالة المنطقة الموجودة في المربع المتقطع ووضعها في قطرة من M2 لمزيد من التشريح. يوضح الرسم التخطيطي للرسوم المتحركة المنطقة محل الاهتمام مع الهياكل التشريحية ذات الصلة المسماة. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: الإعداد المقترح للمعالجة والاستزراع. مخططات تظهر إعدادات لوحة مختلفة لمساعدة الباحثين في إجراء كل من معالجة الأجنة والثقافة. (أ) لوحة غسيل M2 + BSA نموذجية. (ب) M2 + لوحة هيالورونيداز لإزالة الخلايا الركامية. (C) لوحة حل AT اختيارية لتخفيف Zona. (د) لوحة KSOM + BSA لزراعة الأجنة ، مع تراكب الزيت المعدني الضروري للحفاظ على درجة الحموضة والرطوبة ودرجة الحرارة. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: مثال التنميط الجيني لنواتج NHEJ وHDR . (أ) رسم كاريكاتوري للمنطقة المحيطة بجين صور في جينوم الفأر. فيما يلي تفاصيل التسلسل غير المحرر (WT) حيث يوجد موقع تقييد HinfI يحدث بشكل طبيعي ، والذي يقع داخل موقع التعرف على الهدف ل sgRNA (النص الأحمر). يوجد أدناه أحد النتائج العديدة المحتملة بعد استهداف CRISPR / Cas9 الناجح حيث يتم تشكيل "in/del". من الصعب التنبؤ بالطبيعة الدقيقة لهذا التعديل ولكن من شبه المؤكد أنه سيعطل موقع HinfI. علاوة على ذلك ، يوجد أدناه تسلسل oligo للمانحين الذي يغير زوجين أساسيين لتحويل موقع HinfI إلى موقع التعرف على EcoRI. (ب) نتائج تعدد الأشكال لطول جزء التقييد التمثيلي (RFLP) بعد التحرير. يتم عرض أمثلة تحرير NHEJ (أعلى) و HDR (أسفل). تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: النمط الظاهري وصلاحية الزيجوت والفئران المحررة من صور. تم تكييف هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: نتائج تجارب حذف كريسبر-إيز والحقن المجهري. تم تكييف هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 1: قائمة oligos و ssODN المانحة. تم تكييف هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: قالب الحمض النووي لإعداد تفاعل sgRNA. تم تكييف هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 3: إعداد النسخ في المختبر . تم تعديل هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 4: إعداد مجمع RNP لتشكيل NHEJ. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 5: الإعداد المعقد RNP لتشكيل HDR. تم تكييف هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 6: الإعداد المعقد RNP للحذف. تم تعديل هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 7: التنميط الجيني لإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تعديل هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 8: التنميط الجيني المتداخل إعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تعديل هذا الجدول بإذن من Modzelewski et al.9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 9: إعداد ملخص تقييد HinFi. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 10: إعداد ملخص تقييد EcoRi. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تظهر هنا تقنية تحرير جينوم الماوس المباشرة وعالية الكفاءة. يمكن استخدام التثقيب الكهربائي لتوليد أجنة معدلة في 1-2 أسابيع (الشكل 1) ويمكن أن ينتج فئرانا معدلة في غضون 6 أسابيع9. بالمقارنة مع البروتوكولات القائمة على التثقيب الكهربائي المطورة بشكل معاصر والتي توفر RNPs7،10،11،12،13،14،15،17،32 ، فإن الطريقة كما هو موضح هنا متشابهة من الناحية المفاهيمية وتوفر كفاءات في نفس النطاق ، مع اختلافات طفيفة فقط في تطوير الكاشف والمعلمات. لذلك ، نقترح أن يقارن القراء ويتناقضون بناء على الاحتياجات والوصول إلى المعدات. كما يوحي الاسم ، تم تطوير هذا البروتوكول مع وضع "مختبر الفئران العادي" في الاعتبار ، مع الطرق الشائعة فقط (IVT ، PCR ، الرحلان الكهربائي الهلامي) ، الكواشف (تستهلك الأجنة القياسية وزراعة الأنسجة) ، أو المعدات (electroporator و cuvettes المستخدمة عادة لنقل البكتيريا) ، والتي من المحتمل أن تكون في متناول معظم المختبرات المهتمة والقادرة على جمع الأجنة (أو عن طريق سؤال المختبرات المجاورة بلطف). يمكن للباحثين على مستوى طلاب الدراسات العليا الذين يتمتعون بمهارات أساسية في التعامل مع الأجنة اختبار sgRNAs للتأكد من كفاءتها أو إجراء تجارب لإنتاج البيانات عدة مرات ضمن الإطار الزمني لتطوير ما قبل الزرع دون الحاجة إلى جدولة مع منشأة أساسية. ومع ذلك ، إذا كان الهدف المنشود هو توليد نماذج حيوانية دون الحاجة إلى الحقن المجهري أو التلاعب بالأجنة ، تتوفر طرق أقل تدخلا10,32.

يتم البحث بنشاط عن العديد من العوامل التي تؤثر على كفاءة Cas9 ، مثل خصوصية الهدف الجينومي ، ومعلمات تسلسل sgRNA ، وإمكانية الوصول إلى الجينوم والطوبولوجيا ، وخاصة نوع الخلية. لذلك ، يعد تصميم واختبار sgRNAs أمرا بالغ الأهمية للنجاح. تم تحسين هذا البروتوكول وغيره من طرق التثقيب الكهربائي المطورة بشكل مستقل لتوصيل بروتين Cas9 / sgRNA RNPs بسرعة وبشكل عابر إلى أجنة مرحلة الزيجوت ، مما يعزز الكفاءة مع تقليل الفسيفساء بسبب التسليم في مرحلة النمو المبكرة وعمر النصف القصير ل RNP7،9،10،11،12،13،14،15 ، 16،33،34.

بالنسبة لاستراتيجيات تحرير الجينوم الأكثر شيوعا والسلالات المختلفة من الفئران ، يمكن أن تتفوق هذه الطريقة على الحقن الدقيقة من حيث التكلفة والكفاءة والإدخالات الصغيرة والطفرات في / ديل وحذف إكسون والإدراج والطفرات النقطية9. مع البروتوكول الحالي ، تعد هذه الطريقة مثالية لإنشاء طفرات in/del وعمليات حذف تصل إلى 2.6 كيلو بايت ، وهي أطول بكثير من الطول النموذجي لإكسون ترميز البروتين البالغ 170 نقطة أساس35. عمليات الحذف الطويلة أقل كفاءة. ومع ذلك ، فإن هذا القيد ليس فريدا لهذا البروتوكول. لذلك ، مع تحسين التحرير بوساطة Cas9 وتطوير متغيرات جديدة من بروتين Cas ، تسمح الطبيعة المعيارية لهذه الطريقة لهذه التحسينات بزيادة قدرات بروتوكولنا بشكل مباشر.

في حين أن هذه الطريقة يمكن أن تؤدي مجموعة متنوعة من التعديلات البسيطة ، إلا أن إمكاناتها لاستراتيجيات أكبر وأكثر تعقيدا ، مثل إدخال الأليلات الشرطية أو علامات الفلورسنت ، يتم اختبارها حاليا في مختبرنا. يمكن أن توفر SSODNs الأطول نهجا قابلا للتطبيق لتحرير الجينوم المعقد وقد أظهرت نجاحا في تحرير الأجنة القائم على الحقن المجهري36 ؛ ومع ذلك ، فإن SSODNs الأطول مكلفة في التوليف ولم يتم اختبارها بعد على نطاق واسع باستخدام التثقيب الكهربائي37. أظهر استخدام الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV) لإدخال تسلسل مانح يصل إلى 3.3 كيلو بايت نجاحا أيضا ولكن قد لا يكون متاحا لمعظم المختبرات25. في الوقت الحالي ، نوصي بتحرير جينوم الخلايا الجذعية الجنينية القياسية والحقن المجهري لهندسة جينوم الفئران المعقدة.

لا تزال المخاوف بشأن تأثيرات Cas9 خارج الهدف8،38،39. قد تزيد اختلافات Cas9 المهندسة من خصوصية الهدف ، على الرغم من أن هذا لم يتم التحقيق فيه بشكل كامل في دراسات التثقيب الكهربائي للأجنة RNP. يمكن أن تكون تقنية كريسبر-إيز طريقة مفيدة لإنشاء نماذج طفرات مركبة لاستكشاف علم الوراثة المعقد. في حين أن الحقن المجهري جعل تحرير مواقع متعددة في وقت واحد ممكنا40 ، فإن طرق التثقيب الكهربائي مثل تلك الموصوفة هنا تجعل هذا أكثر ملاءمة وفعالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا توجد إقرارات مالية ذات صلة من جانب أصحاب البلاغ.

Acknowledgments

ابتكرت A.J.M. المفهوم الأصلي الذي أدى إلى تطوير CRISPR-EZ وأنتجت الأشكال. قام C.K.D. بتجميع وتكييف البروتوكولات الداخلية والمنشورة لهذه المخطوطة الحالية. A.J.M. مدعوم من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R00HD096108).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  3. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  4. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
  5. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  6. Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
  7. Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  8. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  9. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  10. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  11. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
  12. Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
  13. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  14. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  15. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  16. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  17. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  18. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  19. Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
  20. Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
  21. Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
  22. Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
  23. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
  24. Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
  25. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  26. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  27. Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
  28. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  29. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  30. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
  31. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
  32. Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
  33. Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
  34. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
  35. Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
  36. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  37. Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
  38. Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
  39. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
  40. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 190 ،
تحرير الجينوم الفعال للفئران بواسطة كريسبر التثقيب الكهربائي للزيجوت
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J.… More

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J. Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes. J. Vis. Exp. (190), e64302, doi:10.3791/64302 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter