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Developmental Biology

जाइगोट्स के सीआरआईएसपीआर इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा चूहों का कुशल जीनोम संपादन

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

यहां, हम आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की कुशल पीढ़ी के लिए एक सरल तकनीक का वर्णन करते हैं जिसे सीआरआईएसपीआर आरएनपी इलेक्ट्रोपोरेशन ऑफ जाइगोट्स (सीआरआईएसपीआर-ईजेड) कहा जाता है। यह विधि 100% तक पहुंचने वाली दक्षता पर भ्रूण में इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा संपादन अभिकर्मकों को वितरित करती है। यह प्रोटोकॉल स्तनधारी भ्रूण में बिंदु उत्परिवर्तन, छोटे जीनोमिक सम्मिलन और विलोपन के लिए प्रभावी है।

Abstract

असाधारण दक्षता, सटीकता और आसानी के साथ, CRISPR / Cas9 प्रणाली ने सेल संस्कृति और प्रयोगशाला पशु प्रयोगों में जीनोम संपादन में काफी सुधार किया है। पशु मॉडल उत्पन्न करते समय, युग्मनज का इलेक्ट्रोपोरेशन माइक्रोइंजेक्शन की स्वर्ण मानक विधि के विकल्प के रूप में उच्च दक्षता, सादगी, लागत और थ्रूपुट प्रदान करता है। इलेक्ट्रोपोरेशन भी उच्च व्यवहार्यता के साथ सौम्य है, और विश्वसनीय रूप से कैस 9 / एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) को सामान्य प्रयोगशाला माउस उपभेदों (जैसे, सी 57 बीएल / 6 जे और सी 57 बीएल / 6 एन) के युग्मकों में वितरित करता है जो 100% वितरण दक्षता तक पहुंचता है। यह तकनीक प्रविष्टि / विलोपन (इंडेल) उत्परिवर्तन, बिंदु उत्परिवर्तन, पूरे जीन या एक्सॉन के विलोपन, और 100-200 बीपी की सीमा में छोटे सम्मिलन को एलओएक्सपी या एफएजी, एचए या वी 5 जैसे छोटे टैग डालने में सक्षम बनाती है। लगातार सुधार करते हुए, यहां हम एक प्रोटोकॉल में सीआरआईएसपीआर-ईजेड की वर्तमान स्थिति को प्रस्तुत करते हैं जिसमें इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन, भ्रूण प्रसंस्करण, आरएनपी असेंबली, इलेक्ट्रोपोरेशन और प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण की जीनोटाइपिंग के माध्यम से एसजीआरएनए उत्पादन शामिल है। भ्रूण में हेरफेर करने के न्यूनतम अनुभव के साथ एक स्नातक स्तर का शोधकर्ता इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके 1 सप्ताह से भी कम समय में आनुवंशिक रूप से संपादित भ्रूण प्राप्त कर सकता है। यहां, हम एक सरल, कम लागत वाली, कुशल, उच्च क्षमता वाली विधि प्रदान करते हैं जिसका उपयोग माउस भ्रूण के साथ किया जा सकता है।

Introduction

जीवित चूहों में जीनोम संपादन काफी सरल हो गया है और सीआरआईएसपीआर संपादन 1,2,3 के उद्भव के बाद से सुलभ और अधिक किफायती हो गया है। प्रारंभिक पशु संपादन प्रयासों ने सीआरआईएसपीआर सीएएस 9 एमआरएनए / एसजीआरएनए को प्रोन्यूक्लियर-स्टेज भ्रूण 4,5,6 में वितरित करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग किया। जबकि माइक्रोइंजेक्शन काफी प्रभावी है, इसे पूरी तरह से मास्टर करने के लिए आवश्यक अभ्यास की मात्रा प्रशिक्षुओं और छात्रों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती है और महंगे उपकरणों की भी आवश्यकता होती है जो एक मामूली वित्त पोषित प्रयोगशाला वहन करने में असमर्थ है। माइक्रोइंजेक्शन आमतौर पर ट्रांसजेनिक सुविधाओं में विशेषज्ञ तकनीशियनों द्वारा शेड्यूल और सेवा की कीमतों के साथ किया जाता है जो कई शोधकर्ताओं के लिए दर-सीमित हैं। एक अधिक सुलभ दृष्टिकोण इलेक्ट्रोपोरेशन का है, जिसे सीआरआईएसपीआर सीएएस 9 एमआरएनए / एसजीआरएनए के प्रोन्यूक्लियर-स्टेज भ्रूण7 में वितरण के लिए काफी प्रभावी दिखाया गया है। सीआरआईएसपीआर जीनोम संपादन और वितरण रणनीतियों में आगे के सुधारों ने सुझाव दिया कि पहले से ही एसजीआरएनए के साथ लगे हुए पूर्व-इकट्ठे आरएनएस मोज़ेकिज्म 8 को कम करने का एक प्रभावी साधन हो सकताहै।

इस प्रोटोकॉल के विकास और उपयोग के पीछे तर्क माइक्रोइंजेक्शन से जुड़ी कई सीमाओं और बाधाओं को बाईपास करना था। जैसा कि नाम से ही स्पष्ट है, एक आसान, इन-हाउस और लागत प्रभावी विधि जो जल्दी से यह निर्धारित कर सकती है कि माइक्रोइंजेक्शन प्रयोग के दौरान अप्रमाणित एसजीआरएनए डिजाइन उपयोग करने योग्य होंगे या नहीं, यह एक बहुत ही सुविधाजनक पहला पास गुणवत्ता नियंत्रण कदम होगा (चित्रा 1)। हालांकि यह विधि अधिक जटिल रणनीतियों के लिए माइक्रोइंजेक्शन को प्रतिस्थापित नहीं कर सकती है, जैसे पुनर्संयोजन-आधारित परिणामों के लिए लंबे दाता डीएनए अनुक्रमों को पेश करना, यह छोटे विलोपन या सम्मिलन और टैगिंग जीन जैसी कम जटिल रणनीतियों के लिए आदर्श है। यह विधि बुनियादी भ्रूण हेरफेर कौशल वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है, जिनके पास सरल संपादन आवश्यकताएं हैं, प्रीइंप्लांटेशन विकास की समय सीमा के भीतर अपनी परिकल्पना का परीक्षण करना चाहते हैं, या माइक्रोइंजेक्शन विशेषज्ञ के साथ नियुक्ति निर्धारित करने से पहले भ्रूण में एसजीआरएनए का परीक्षण करना पसंद करते हैं। यहां, संपादन अभिकर्मकों को मोज़ेकिज्म को कम करते हुए दक्षता को अधिकतम करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन (विद्युत दालों की एक श्रृंखला) के माध्यम से कैस 9 / एसजीआरएनए आरएनपी के रूप में प्रोन्यूक्लियर-स्टेज भ्रूण में क्षणिक रूप से वितरितकिया जाता है। भ्रूण जीनोटाइपिंग विधि का उपयोग करके, संपादन परिणाम लगभग 1 सप्ताह9 में उपलब्ध होते हैं, इस प्रकार काफी कम लागत पर विभिन्न माइक्रोइंजेक्शन अनुप्रयोगों की आवश्यकता कम हो जाती है।

इस विधि की प्रभावशीलता प्रोन्यूक्लियर भ्रूण चरण में चरम पर होती है, जब भ्रूण ने अभी तक मातृ और पैतृक प्रोन्यूक्लियस को नहीं जोड़ा है या एस-चरण में प्रवेश नहीं किया है (चित्रा 2)। सुपरोव्यूलेशन का उपयोग युग्मनज की संख्या को अधिकतम करने के लिए किया जाता है लेकिन प्रोन्यूक्लियर युग्मकों और अनफर्टिलाइज्ड अंडे दोनों का उत्पादन करता है। समग्र दक्षता बढ़ाने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले स्वस्थ युग्मकों का भी पूर्व-चयन किया जा सकता है। चूंकि अन्य इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल ने समान चरण 7,10,11,12,13,14,15 को शामिल करने की आवश्यकता के बिना युग्मनकों को कुशलतापूर्वक संपादित किया है, इस प्रोटोकॉल का एक वैकल्पिक कदम ज़ोना पेलुसीडा (जेडपी) का मामूली क्षरण है। जेडपी एक ग्लाइकोप्रोटीन परत है जो शुक्राणु बंधन, एक्रोसोम प्रतिक्रिया और प्रोन्यूक्लियर-स्टेज भ्रूण के आसपास निषेचन में सहायता करती है। हमारे अनुभव में, हमने पाया कि जिला परिषद का एक सौम्य एसिड-आधारित क्षरण व्यवहार्यता पर केवल मामूली प्रभाव के साथ विश्वसनीय कैस 9 आरएनपी इलेक्ट्रोपोरेशन डिलीवरी प्रदान करता है।

हमने माउस उपभेदों में इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से 100% दक्षता तक की आरएनपी वितरण दर देखी है जो आमतौर पर सी 57बीएल / 6 जे और सी 57 बीएल / 6 एन9, 16 जैसे अनुसंधान में उपयोग की जाती हैं। स्वतंत्र समूहों ने 11,12,13,14,15,17 से अधिक क्षमता या मिलान करने वाली क्षमता के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित प्रक्रियाएं भी विकसित की हैं, जिसमें इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल चूहे 18,19, सुअर 20,21,22 और गाय 23 में अच्छी तरह से काम कर रहे हैं। , इसलिए हम सुझाव देते हैं कि पाठक उन स्थितियों को खोजने के लिए प्रोटोकॉल की तुलना करें जो उनकी प्रयोगात्मक और उपकरण आवश्यकताओं के अनुरूप हैं। यहां वर्णित प्रणाली सामान्य सामग्री और उपकरणों का उपयोग करती है, जिसमें केवल बुनियादी भ्रूण हेरफेर कौशल की आवश्यकता होती है। यह तकनीक संपादन रणनीतियों की एक श्रृंखला के लिए प्रभावी है, जिससे इस विधि को अनुसंधान समुदाय के लिए व्यापक रूप से सुलभ बनाया जा सकता है।

कुशल संपादन के लिए आदर्श छोटे गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) को डिजाइन करना आवश्यक है। हम माउस भ्रूण में सीधे प्रति लक्ष्य साइट पर दो से तीन एसजीआरएनए रणनीतियों की स्क्रीनिंग की सलाह देते हैं, खासकर यदि माउस लाइन पीढ़ी वांछित है। एक बार डिजाइन किए जाने के बाद, उच्च गुणवत्ता वाले एसजीआरएनए का उत्पादन करने के लिए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) जैसे क्लोनिंग-मुक्त तरीकों की सिफारिश की जातीहै। आरएनपी और एसजीआरएनए को 30-50 संसाधित प्रोन्यूक्लियर-स्टेज भ्रूण के साथ मिलाया जाता है और पहले अस्थायी रूप से जेडपी और कोशिका झिल्ली को स्थिर करने के लिए विद्युत दालों की एक श्रृंखला के संपर्क में लाया जाता है, बाद में छिद्रों को खुला रखने और युग्मनज24 के माध्यम से आरएनपी को वैद्युतकणसंचलन करने के लिए। अनुकूलन के बाद, हमने पाया कि थोक भ्रूण (~ 50) के लिए 30 वी पर छह 3 एमएस दालें संपादन प्रभावशीलता और व्यवहार्यता के लिए इष्टतम थीं, जो अत्यधिक कुशल कैस 9 / एसजीआरएनए आरएनपी डिलीवरी 9,16,25 प्रदान करती हैं। अलग-अलग माउस मोरुला में संपादन घटनाओं की पुष्टि सीआरआईएसपीआर संपादन के लिए आम विभिन्न सत्यापन रणनीतियों का उपयोग करके की जा सकती है, जैसे कि प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी), टी 7 एंडोन्यूक्लिज़ पाचन, और रुचि के क्षेत्र का सेंगर अनुक्रमण26।

वर्तमान विधि सरल संपादन योजनाओं (चित्रा 3) के लिए सबसे उपयुक्त है, जैसे सम्मिलन / विलोपन (इंडेल), एक्सॉन-आकार के विलोपन 500-2000 बीपी के क्रम पर, और बिंदु उत्परिवर्तन और सी- या एन-टर्मिनल टैग (जैसे, फ्लैग, एचए, या वी 5) 9,16,27 जैसे छोटे सम्मिलन का वितरण। फ्लोरोसेंट टैग या सशर्त एलील के बड़े सम्मिलन की तरह जटिल जीनोम संपादन की क्षमता अनिश्चित बनी हुई है और आगामी सुधारों का वर्तमान फोकस है।

इस विधि को आसानी से महारत हासिल है और इसका उपयोग 1 सप्ताह9 (चित्रा 1) में सुसंस्कृत माउस भ्रूण में एसजीआरएनए का जल्दी से परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। इस काम में प्रस्तुत एक छह-चरण प्रोटोकॉल है, जिसमें 1) एसजीआरएनए डिजाइन शामिल है; 2) एसजीआरएनए संश्लेषण; 3) सुपरोव्यूलेशन और संभोग; 4) भ्रूण संस्कृति, संग्रह और प्रसंस्करण; 5) आरएनपी असेंबली और इलेक्ट्रोपोरेशन; 6) भ्रूण संस्कृति और जीनोटाइपिंग। उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों के बारे में जानकारी प्रदान की गई है (सामग्री की तालिका)। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, टायरोसिनेस (टायर) लोकस 9,16 को संपादित करने के लिए अभिकर्मकों को पूरक तालिका 1 में शामिल किया गया है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल के दौरान सभी पशु देखभाल और उपयोग ने पशु कल्याण अधिनियम नीतियों का पालन किया प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए आईएलएआर गाइड और इच्छामृत्यु के लिए एवीएमए और पेंसिल्वेनिया संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय (आईएसीयूसी) के दिशानिर्देशों और नीतियों का पालन किया। पशु देखभाल और उपयोग प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और इस परियोजना के लिए पेंसिल्वेनिया आईएसीयूसी विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया। अनुपालन और सावधानी के मामले के रूप में, कृपया इस प्रोटोकॉल का प्रयास करने से पहले सभी आवश्यक प्राधिकरणों की तलाश करें।

1. एसजीआरएनए और वैकल्पिक दाता ऑलिगो डिजाइन

  1. SgRNA डिजाइन
    1. किसी भी व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले ऑनलाइन एल्गोरिदम से उम्मीदवार एसजीआरएनए का चयन करें, जैसे कि सीआरआईएसपीआर के लिए अनुक्रम स्कैन (एसएससी; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 या क्रिसपिक (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29। जैसा कि प्रत्येक प्लेटफ़ॉर्म अद्वितीय है, कृपया आदर्श एसजीआरएनए डिजाइन करने के लिए उपयोगकर्ता निर्देशों को ध्यान से पढ़ें। इन/डेल प्रयोगों के लिए, परीक्षण करने के लिए दो से तीन एसजीआरएनए का चयन करें। विलोपन के लिए, एसजीआरएनए जो लक्ष्य क्षेत्र को फ्लैंक करते हैं, का सुझाव दिया जाता है, उदाहरण के लिए, लक्ष्य के ऊपर दो एसजीआरएनए और लक्ष्य के डाउनस्ट्रीम में दो एसजीआरएनए।
      नोट: जबकि विभिन्न ऑनलाइन एसजीआरएनए एल्गोरिदम त्रुटिपूर्ण एसजीआरएनए डिजाइनों से बचने के लिए ऑफ-टारगेट में कारक हैं, एनसीबीआई का ब्लास्ट टूल चयनित एसजीआरएनए अनुक्रमों की गुणवत्ता की पुष्टि करने में सहायक है।
    2. पिछले चरण (1.1.1) से निर्धारित 19-20 न्यूक्लियोटाइड्स (एनटी) को एसजीआरएनए ऑलिगो (पूरक तालिका 1) के चर क्षेत्र में डालें और कस्टम डीएनए ऑलिगोस के रूप में संश्लेषित एसजीआरएनए खरीदें।
      नोट: पृष्ठ शुद्धिकरण की आवश्यकता नहीं है।
  2. (वैकल्पिक) होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) -मध्यस्थ नॉक-इन के लिए दाता ऑलिगो डिजाइन।
    1. वांछित प्रयोगात्मक परिणाम (सटीक बिंदु उत्परिवर्तन, लोक्सपी सम्मिलन, छोटे टैग सम्मिलन, आदि) के आधार पर उपयुक्त एकल-फंसे हुए ऑलिगोडीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड (एसएसओडीएन) को डिजाइन करें, जिसमें केंद्रीय क्षेत्र में 50 एनटी या उससे अधिक की होमोलॉजी भुजाओं के साथ कुल लंबाई 100-200 एनटी तक रखी जाए।
    2. उच्च नॉक-इन दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, एसजीआरएनए को एसएसओडीएन30 के पूरक के रूप में डिजाइन करें, और कैस 9 एंजाइम द्वारा आवर्ती काटने को रोकने के लिए प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) अनुक्रम को एक मूक उत्परिवर्तन के साथ बदलें।
    3. कस्टम ऑलिगो विकल्प का उपयोग करके एसएसओडीएन ऑर्डर करें।

2. एसजीआरएनए संश्लेषण

  1. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) के लिए टेम्पलेट उत्पादन
    1. पीसीआर के माध्यम से एसजीआरएनए आईवीटी के लिए डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए, एक पीसीआर स्ट्रिप ट्यूब में एक आईवीटी प्रतिक्रिया तैयार करें जो आरएनएस-मुक्त है। ( अनुपूरक तालिका 2 देखें)।
    2. निम्न थर्मल चक्रीय स्थितियों का उपयोग करें:
      2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 10 सेकंड के लिए 57 डिग्री सेल्सियस और 10 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; फिर 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
    3. एसजीआरएनए डीएनए टेम्पलेट पीसीआर प्रतिक्रिया की सफलता को सत्यापित करने के लिए, उत्पाद के वैद्युतकणसंचलन 5 μL को 2% (wt / vol) अगारोस जेल पर 6x लोडिंग डाई के 1 μL के साथ जोड़ा जाता है।
      नोट: प्रत्याशित उत्पाद का आकार 127 बीपी है। किसी भी शेष पीसीआर प्रतिक्रिया को 5 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. एसजीआरएनए का इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी)
    1. एसजीआरएनए उत्पन्न करने के लिए, पीसीआर ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण (निर्माता निर्देशों के अनुसार टी 7 आईवीटी) तैयार करें और अभिकर्मकों को मिलाने के लिए फ्लिक करें।
      नोट: प्रतिक्रिया सेटअप उदाहरण के लिए पूरक तालिका 3 देखें। आईवीटी प्रतिक्रिया आरएनएस संदूषण संवेदनशील है; इसलिए, एक RNase-मुक्त वातावरण प्रदान करने के लिए हर संभव प्रयास करें।
    2. प्रतिक्रिया को शुरू करने और आगे बढ़ने की अनुमति देने के लिए, आईवीटी प्रतिक्रिया मिश्रण को थर्मल साइक्लर या हीट ब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर >18 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. मूल डीएनए टेम्पलेट (चरण 2.1.3) को नीचा दिखाने के लिए, DNase I (प्रति प्रतिक्रिया 2 इकाइयाँ) के 1 μL का परिचय दें और कमरे के तापमान (RT) पर 20 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
    4. चुंबकीय शुद्धि करण मोतियों के लिए आरएनए बाइंडिंग को बढ़ावा देने के लिए, प्रतिक्रिया में 100% इथेनॉल के 129 μL को संयोजित करें, जो अब 150 μL होगा।
    5. शुद्धिकरण मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए, जो भंडारण के दौरान व्यवस्थित हो जाते हैं, कम से कम 10 सेकंड के लिए एलिकोट को भंवर करते हैं।
    6. एसजीआरएनए को शुद्ध करने के लिए, आईवीटी प्रतिक्रिया (चरण 2.2.4) में पुन: निलंबित मोतियों (चरण 2.2.5) का 100 μL जोड़ें और धीरे से 10x ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
    7. बाइंडिंग की अनुमति देने के लिए, मिश्रण को 5 मिनट के लिए आरटी पर आराम करने की अनुमति दें।
    8. अनिगमित प्रतिक्रिया उत्पादों से एसजीआरएनए को अलग करने के लिए, आरटी पर 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर प्रतिक्रिया रखें और एक छोटे से गोली बनने तक प्रतीक्षा करें।
    9. एसजीआरएनए को धोने के लिए, पहले सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक छोड़ दें और फिर गोली से दूर 80% इथेनॉल का 200 μL जोड़ें।
      नोट: 80% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) इथेनॉल धोने के चरण के दौरान, पिपेटिंग द्वारा गोली को परेशान करने से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि इससे एसजीआरएनए सांद्रता काफी कम हो जाएगी। इसके बजाय, धीरे से 80% इथेनॉल को पिपेट करें ताकि गोली जलमग्न हो जाए, और धीरे से एक पिपेट के साथ मात्रा को हटा दें।
    10. पिछले चरण (चरण 2.2.9) को दोहराएं और गोली को 5-6 मिनट से अधिक समय तक हवा से सुखाएं या एसजीआरएनए मोतियों के साथ स्थायी रूप से जुड़ा होगा।
    11. 20 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ एसजीआरएनए को पेलेट 10x पर पाइप करके, 2 मिनट (RT) के लिए इनक्यूबेट करके, और फिर अब शुद्ध एसजीआरएनए से मोतियों को अलग करने के लिए चुंबकीय स्टैंड पर वापस रखें।
    12. एसजीआरएनए की गुणवत्ता और मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या बायोएनालाइज़र जैसे उपकरण का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, 2% अगारोस जेल पर, चरण 2.1.3 के समान 2 μL sgRNA चलाएं।
      नोट: गुणवत्ता की पुष्टि एकल स्पष्ट बैंड द्वारा की जाती है। एसजीआरएनए के शेष या तो तुरंत उपयोग किया जा सकता है या -80 डिग्री सेल्सियस स्थितियों में संग्रहीत किया जा सकता है।

3. सुपर ओव्यूलेशन

  1. प्रत्येक एसजीआरएनए डिजाइन का परीक्षण करने के लिए पर्याप्त भ्रूण प्रदान करने के लिए, दो से तीन सी 57बीएल / 6 जे महिलाओं को सुपरोवुलेट करें जो 3-5 सप्ताह के बीच हैं, जैसा कि पहले वर्णित9 है। प्रभावशीलता की पुष्टि करने के लिए पर्याप्त परिणाम उत्पन्न करने के लिए प्रति एसजीआरएनए 20-30 भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेटिंग की सिफारिश की जाती है।
    नोट: यदि निषेचन सफल है, तो प्रति संभोग 10-20 भ्रूण की उम्मीद करें।
  2. ओव्यूलेशन को प्रेरित करने के लिए, इस हार्मोन इंजेक्शन अनुसूची का पालन करें:
    1. दिन 1: 3-5 सप्ताह की मादा चूहों में 26 जी सिरिंज का उपयोग करके इंट्रापरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के माध्यम से गर्भवती घोड़ी सीरम गोनाडोट्रोपिन (पीएमएसजी) (100 μL) के 5 आईयू का उपयोग करें।
    2. दिन 3: पीएमएसजी इंजेक्शन के 46-48 घंटे के बाद, ओव्यूलेशन को प्रेरित करने के लिए आईपी इंजेक्शन के माध्यम से मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) (100 μL) के 5 आईयू इंजेक्ट करें।
    3. प्रजनन स्थापित करने के लिए, एचसीजी इंजेक्शन के ठीक बाद विश्वसनीय प्रजनन के नर के साथ मादाओं को 1: 1 जोड़ा।
      नोट: हार्मोन को कम करने और गतिविधि खोने से रोकने के लिए, पिघलने के 30 मिनट से कम इंजेक्शन करें।

4. भ्रूण संग्रह और प्रसंस्करण

  1. भ्रूण संग्रह
    1. महिलाओं को इच्छामृत्यु करने और आवश्यक सामग्री को पुनः प्राप्त करने के लिए, जैसा कि पहले वर्णित31 था, पहले संस्थागत नीतियों के अनुसार उपयुक्त विधि की पुष्टि करना सुनिश्चित करें। उदाहरण के लिए, सीओ2 श्वासावरोध, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था, और / या अन्य अनुमोदित तरीकों का उपयोग करें।
      नोट: आम तौर पर, हार्मोन-उत्तेजित महिलाओं के >75% मैथुन प्लग प्रदर्शित करते हैं, जो सफल संभोग का संकेत देते हैं।
    2. बालों को ऊतक संग्रह को मुश्किल बनाने से रोकने के लिए, इच्छामृत्यु वाली महिलाओं को उनकी पीठ पर रखें और शल्य चिकित्सा से खोलने के लिए पेट क्षेत्र पर 70% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) इथेनॉल स्प्रे करें।
      नोट: इस बिंदु से, एक सड़न रोकनेवाला वातावरण बनाए रखने और संदूषण की संभावना को कम करने के लिए हवादार हुड में सर्जिकल चरणों का प्रदर्शन करने की सलाह दी जाती है।
    3. पेट की गुहा को खोलने और डिंबवाहिनी को हटाने के लिए, सर्जिकल कैंची के साथ त्वचा / बाल (चमड़े के नीचे) परत काटें, और अंडाशय (चित्रा 4) का पता लगाएं, जो गुर्दे के पास पाए जाते हैं और वसा पैड के एक हिस्से को साझा करते हैं। अंडाकार अंडाशय के समीपस्थ स्थित होते हैं (चित्रा 4)। शल्य चिकित्सा द्वारा मादा से दोनों डिंबवाहिनी को हटा दें और उन्हें एम 2 + बीएसए (4 मिलीग्राम / एमएल बीएसए) माध्यम (चित्रा 5 ए) की व्यक्तिगत 50 μL बूंदों में रखें।
      नोट: प्रक्रिया के इस खंड के लिए विस्तृत निर्देशों को पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल का उपयोग करके नेत्रहीन31 या चरणवार9 का पालन किया जा सकता है।
    4. ओओसाइट्स युक्त क्यूमुलस-ओसाइट कॉम्प्लेक्स (सीओसी) को जारी करने के लिए (चित्रा 4), स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के माध्यम से देखते समय ओविडक्ट के एम्पुला को बाहर निकालने के लिए विच्छेदन बल का उपयोग करें।
    5. मलबे (रक्त, वसा, ऊतक) की मात्रा को कम करने के लिए, मलबे के ले जाने से बचने के लिए प्रत्येक सीओसी को एम 2 + बीएसए मीडिया की एकल 50 μL बूंद में 20-30 μL तक हैंडहेल्ड पिपेट सेट के साथ स्थानांतरित और संयोजित करें।
  2. क्यूमुलस कोशिकाओं को हटाना
    1. युग्मनज (चित्रा 4) से क्यूमुलस कोशिकाओं को हटाने की शुरुआत करने के लिए, 100 μL M2 + hyaluronidase (चित्रा 5B) की एक बूंद में जितना संभव हो उतना कम अतिरिक्त मीडिया के साथ CoCs को स्थानांतरित करें, और धीरे से CoCs को पाइप करके मिलाएं जब तक कि भ्रूण बहुत छोटे क्यूमुलस कोशिकाओं से स्पष्ट रूप से अलग न हो जाएं। भ्रूण के लिए एम 2 + हायलूरोनिडेस के जोखिम को कम से कम रखना सुनिश्चित करें, क्योंकि यह व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है।
      नोट: यदि भ्रूण 2 मिनट के भीतर क्यूमुलस कोशिकाओं से अलग नहीं हो रहे हैं तो कोई या तो प्रीहीट (37 डिग्री सेल्सियस) या एम 2 + हायलूरोनिडेस का अतिरिक्त 50 μL जोड़ सकता है।
    2. हायलूरोनिडेस को पतला करने और युग्मकों से ढीली क्यूमुलस कोशिकाओं को दूर करने के लिए, युग्मनज को एक ताजा 50 μL M2 + BSA बूंद में ले जाने के लिए मुंह से संचालित पिपेट का उपयोग करें।
      नोट: इस बिंदु से परे अधिकांश चरणों में मुंह से संचालित पिपेट के उपयोग की आवश्यकता होती है जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया जाए। जबकि उपयोगकर्ता से संदूषण का जोखिम कम है, एक सड़न रोकनेवाला वातावरण बनाए रखने के लिए इनलाइन एयर फिल्टर के उपयोग की सिफारिश की जाती है। कृपया इस उपकरण 9,31 को तैयार करने और उपयोग करने के लिए पहले वर्णित विधियों को देखें।
    3. एक मुंह पिपेट का उपयोग करके, क्यूमुलस कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए भ्रूण को कम से कम चार से पांच और 50 μL M2 + बीएसए बूंदों के माध्यम से पारित करें।
  3. (वैकल्पिक) एसिड टायरोड (एटी) समाधान के साथ ज़ोना पेलुसीडा का पतला होना।
    1. भ्रूण के ज़ोना पेलुसीडा को नष्ट करने और अभिकर्मक वितरण के लिए अतिरिक्त शारीरिक बाधाओं को कम करने के लिए, भ्रूण को 60 मिमी प्लेट (चित्रा 5 सी) पर एटी समाधान की पूर्वनिर्मित (37 डिग्री सेल्सियस) 100 μL बूंद में स्थानांतरित करें। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके युग्मनज का लगातार निरीक्षण करें जब तक कि ज़ोना पेलुसीडा का लगभग 30% नष्ट न होजाए। कुल एटी एक्सपोजर 60-90 एस होना चाहिए। एटी के लंबे समय तक संपर्क पूरी तरह से ज़ोना पेलुसीडा को भंग कर सकता है और भ्रूण की व्यवहार्यता को खतरे में डाल सकता है।
      नोट: प्रक्रिया के इस खंड के विस्तृत निर्देशों और छवियों के लिए, कृपया पहले प्रकाशित विधियों 9,16 को देखें।
    2. एटी को पतला करने के लिए, एम 2 + बीएसए की कम से कम चार 50 μL बूंदों के माध्यम से भ्रूण को पारित करने के लिए एक मुंह पिपेट का उपयोग करें।
    3. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या भ्रूण की उचित संख्या संसाधित की गई है, भ्रूण की गणना के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें। उपयोग की जाने वाली मादा चूहों की संख्या के आधार पर, प्रति महिला लगभग 10-20 व्यवहार्य युग्मकों की उम्मीद की जा सकती है।
      नोट: इस स्तर पर, भ्रूण मलबे से अपेक्षाकृत मुक्त होना चाहिए जो मात्रा और गुणवत्ता के मूल्यांकन को रोक देगा। उदाहरण के लिए, यदि पांच महिलाओं का उपयोग किया जाता है, तो अपेक्षित युग्मनज संख्या संभवतः 50-100 के बीच होगी, और भ्रूण का ट्रैक रखने के लिए एक यांत्रिक सेल काउंटर उपयुक्त होगा। निषेचित करने में विफलता या कम गुणवत्ता वाले अंडाणुओं के अंडाणुओं के कारण लगभग 10% -20% भ्रूण खोना आम है। अगले चरण के दौरान, संक्षेप में भ्रूण को एम 2 + बीएसए के 50 μL में एक इनक्यूबेटर में 30 मिनट से अधिक समय तक स्टोर करें।

5. आरएनपी असेंबली और इलेक्ट्रोपोरेशन

  1. आरएनपी विधानसभा
    1. आरएनपी कॉम्प्लेक्स को इकट्ठा करने के लिए, एनएनपी बफर में वांछित संपादन रणनीति के आधार पर उपयुक्त प्रतिक्रिया मिश्रण को संयोजित करने के लिए संलग्न उदाहरण तालिकाओं का उपयोग करें (100 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.5, 750 एमएम केसीएल, 5 एमएम एमजीसीएल2, 50% ग्लिसरॉल, और 100 एमएम ट्राइस (2-कार्बोक्सीथिल) फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड [टीसीईपी] न्यूक्लियस-मुक्त पानी में)
      नोट: टीसीईपी एक सुविधाजनक कम करने वाला एजेंट है लेकिन जलीय समाधानों में एक छोटा आधा जीवन है; इसलिए, आरएनपी कॉम्प्लेक्स असेंबली से ठीक पहले टीसीईपी जोड़ें।
      1. गैर-समरूप अंत जुड़ने (NHEJ) -मध्यस्थता वाले इंडेल के लिए, पूरक तालिका 4 देखें।
      2. होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) -मध्यस्थता संपादन के लिए, पूरक तालिका 5 देखें।
      3. युग्मित एसजीआरएनए का उपयोग करके इंजीनियरिंग विलोपन के लिए, पूरक तालिका 6 देखें।
        1. रणनीति के बावजूद, पीसीआर ट्यूब में आरटी पर वांछित अभिकर्मकों को मिलाएं।
        2. आरएनपी कॉम्प्लेक्स गठन की अनुमति देने के लिए, मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
          नोट: आरएनपी कॉम्प्लेक्स को आरटी में 1 घंटे तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. विद्युतीकरण
    1. इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले बीएसए को पतला करने के लिए, भ्रूण को कम सीरम मीडिया के 50 μL की कम से कम दो बूंदों के माध्यम से पारित करें।
      नोट: बीएसए इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान प्रतिरोध बढ़ाता है और युग्मनज को नुकसान पहुंचा सकता है।
    2. इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए आरएनपी कॉम्प्लेक्स (चरण 5.1.1.2) के साथ युग्मनज (चरण 4.3.2) को तैयार करने और मिलाने के लिए, मुंह पिपेट 25-30 भ्रूण को कम सीरम मीडिया की 10 μL बूंद में बदल देता है, और फिर RNP कॉम्प्लेक्स (चरण 5.1.1.2) के 10 μL को जोड़ने के लिए एक हैंडहेल्ड पिपेट का उपयोग करता है।
    3. आरएनपी कॉम्प्लेक्स से चिपचिपा ग्लिसरॉल को पतला करने और नमूने को समरूप करने के लिए, 10x पिपेट करके मिलाएं या जब तक मिश्रण अब स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके चिपचिपाहट (ज़ुल्फ़ पैटर्न) के लक्षण न दिखाए।
    4. इलेक्ट्रोपोरेटर में सम्मिलन के लिए नमूना तैयार करने के लिए, बुलबुले से बचते हुए भ्रूण + आरएनपी मिश्रण के इस 20 μL को 0.1 सेमी इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में बदलें।
    5. युग्मनज में संपादन अभिकर्मकों को वितरित करने के लिए, इन शर्तों के साथ एक वर्ग-तरंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके भ्रूण को इलेक्ट्रोपोरेट करें: 30 वी, 4-6 दालें, 3 एमएस पल्स लंबाई और 100 पल्स अंतराल।
    6. क्यूवेट से युग्मनज को पुनः प्राप्त करने के लिए, 50 μL KSOM + BSA (1mg / mL BSA) को कुवेट के शीर्ष में वितरित करने के लिए एक हाथ पिपेट का उपयोग करें ताकि उन भ्रूणों को फ्लश किया जा सके जो नीचे तक बस गए हो सकते हैं। धीरे से इस मिश्रण को बाहर निकालें और 60 मिमी प्लेट पर रखें।
    7. चरण 5.2.6 को कम से कम 2x-3x दोहराएं और प्रत्येक फ्लश को 60 मिमी प्लेट पर मिलाएं जब तक कि अधिकांश भ्रूण पुनर्प्राप्त न हो जाएं।
      नोट: एक विशिष्ट वसूली मूल रूप से लोड किए गए भ्रूण का >90% है। भ्रूण के अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए, इनक्यूबेटर का परीक्षण करें और सभी अभिकर्मकों के लिए समाप्ति तिथियों की जांच करें। भ्रूण गैर-आदर्श संस्कृति स्थितियों जैसे तापमान, सीओ2 स्तर, आर्द्रता और पीएच के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं।

6. भ्रूण संस्कृति और जीनोटाइपिंग

  1. भ्रूण संस्कृति
    1. युग्मनज को वांछित चरण में कल्चर करने के लिए, पूर्व-समतुल्य संस्कृति प्लेट में केएसओएम + बीएसए की एक बूंद में 20-30 युग्मकों को स्थानांतरित करने के लिए मुंह के पिपेट का उपयोग करें और भ्रूण को बूंद में ले जाएं (चित्रा 5 डी)। प्लेट को 95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: तैयार 35 मिमी कल्चर प्लेट को इनक्यूबेटर में एक दिन पहले या इनक्यूबेशन से कम से कम 4 घंटे पहले रखकर पूर्व-समतुल्य करें (चित्रा 5 डी)।
    2. आदर्श विकास स्थितियों को बढ़ावा देने के लिए, अगले दिन केवल दो-सेल भ्रूण को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके केएसओएम + बीएसए मिश्रण की एक ताजा बूंद में स्थानांतरित करें और इनक्यूबेटर पर लौटें। मृत या अनफर्टिलाइज्ड भ्रूण को छोड़ना या छोड़ना सुनिश्चित करें।
      नोट: प्रोन्यूक्लियर-स्टेज भ्रूण आमतौर पर 72 घंटे की संस्कृति के बाद मोरुला में बढ़ते हैं और 84 घंटे के बाद ब्लास्टोसिस्ट होते हैं।
  2. जीनोटाइपिंग
    1. मीडिया के घटकों को पतला करने के लिए जो पीसीआर प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप कर सकते हैं, डीपीबीएस की दो बूंदों से गुजरकर मुंह के पिपेट का उपयोग करके मोरुला / ब्लास्टोसिस्ट भ्रूण को धोएं।
    2. लाइसिस के लिए एकल भ्रूण लोड करने के लिए, व्यक्तिगत भ्रूण को 1 μL पर एक पिपेट सेट करके 8-वेल पीसीआर पट्टी के एक कुएं में स्थानांतरित करें, और फिर 10 μL लाइसिस बफर (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8.5,2.5 mM MgCl 2, 0.1 mg/mL जिलेटिन, 0.45% नॉनआइडेट P-40, 0.45% ट्वीन20, 0.2mg/mL प्रोटीनेज K को न्यूक्लियस-फ्री H 2 O में जोड़ें।
      नोट: लाइसिस बफर तैयार करने से ठीक पहले प्रोटीन के जोड़ें।
    3. भ्रूण को अलग करने के लिए, 4 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस तक एक थर्मल साइक्लर प्रोग्राम करें, और फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट की इनक्यूबेशन के साथ प्रोटीन के को निष्क्रिय करें।
      नोट: विशेष रूप से पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए, टायर लोकी पर एक संपादन प्रयोग का प्रयास करें । यह वर्कफ़्लो ऑप्टिमाइज़ किया गया है और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकता है। यदि आवश्यक हो, तो भ्रूण लाइसेट को 2-3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या पीसीआर विश्लेषण से पहले 2 सप्ताह तक फ्रीजर में स्टोर करें। बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्र को रोकें।
    4. सफल जीनोटाइपिंग विश्लेषण की संभावनाओं को बढ़ाने के लिए, थोड़े लंबे डीएनए टुकड़ों को बढ़ाकर एक नेस्टेड पीसीआर रणनीति का प्रदर्शन करें जो लक्षित साइट के साथ-साथ उन क्षेत्रों को भी फ्लैंक करते हैं जिनका उपयोग अधिक सटीक डीएनए टुकड़े को बढ़ाने के लिए किया जाएगा। अनुपूरक तालिका 7 में दी गई शर्तों का पालन करें।
    5. नीचे उल्लिखित थर्मल साइकिलर स्थितियों का पालन करें:
      2 मिनट के लिए 95 °C
      30+ चक्र: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 10 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
      2 मिनट के लिए 72 °C
    6. नेस्टेड पीसीआर रणनीति के दूसरे चरण को तैयार करने के लिए, पहले पीसीआर उत्पाद (चरण 6.2.5) का 1:10 कमजोर पड़ना बनाएं और अगली पीसीआर प्रतिक्रिया में इसका 2 μL लोड करें (पिछले एम्प्लिकॉन के अंदर होने के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमरों के साथ)।
      नोट: दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया में फ्लैंकिंग प्राइमरों के कैरीओवर को कम करने के लिए पहली पीसीआर प्रतिक्रिया को पतला किया जाना चाहिए। पूरक तालिका 8 में दिए गए चरणों का पालन करके नेस्टेड पीसीआर तैयार करें।
    7. पीसीआर प्रतिक्रिया को निम्नलिखित साइकिलिंग स्थितियों का उपयोग करके थर्मल साइकिलर में रखें:
      2 मिनट के लिए 95 °C
      30 चक्र: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 10 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
      2 मिनट के लिए 72 °C
      नोट: आम तौर पर, >90% पीसीआर प्रतिक्रियाएं सफल होती हैं जब एम्प्लिकॉन का आकार 500 बीपी या उससे कम होता है।
    8. (वैकल्पिक नियंत्रण) एनएचईजे-मध्यस्थता वाले इन/डेल म्यूटेशन के लिए टायर को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करते हुए, चरण 6.2.7 से नेस्टेड पीसीआर उत्पादों के 10 μL को 20 μL प्रतिक्रिया में 10 U HnfI का उपयोग करके 4 घंटे के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करके पचाएं ( पूरक तालिका 9 देखें)। 2% अगारोस जेल पर, संपादन का मूल्यांकन करने के लिए पचे हुए उत्पाद को चलाएं और लोडिंग नियंत्रण के रूप में एक गैर-पीसीआर उत्पाद का उपयोग करें। 30 मिनट के लिए जेल को 135 वोल्ट पर चलाएं।
      नोट: एक उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम के रूप में HinfI का उपयोग एसजीआरएनए लक्ष्य क्षेत्र के भीतर मौजूद एक सुविधाजनक रूप से स्थित HinfI साइट के कारण चुना गया था जिसे एक सफल NHEJ संपादन पर लागू होने की भविष्यवाणी की गई है। एक विस्तृत विधि और परिणाम पहले 9,16 वर्णित किए गए हैं।
    9. (वैकल्पिक नियंत्रण) एचडीआर-मध्यस्थता उत्परिवर्तन के लिए टायर को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करते हुए, चरण 6.2.7 से नेस्टेड पीसीआर उत्पादों के 10 μL को 20 μL प्रतिक्रिया में इकोआरआई के 10 U का उपयोग करके 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके पचाएं ( पूरक तालिका 10 देखें)। 2% अगारोस जेल पर, संपादन का मूल्यांकन करने के लिए पचे हुए उत्पाद को चलाएं और लोडिंग नियंत्रण के रूप में एक गैर-पीसीआर उत्पाद का उपयोग करें। 30 मिनट के लिए जेल को 135 वोल्ट पर चलाएं।
      नोट: नैदानिक प्रतिबंध एंजाइम के रूप में इकोआरआई का विकल्प एसजीआरएनए लक्ष्य क्षेत्र में पाए जाने वाले मूल अनुक्रम का लाभ उठाता है, जहां, सफल एचडीआर पर, स्वाभाविक रूप से होने वाली हिंफी साइट को इकोआरआई साइट के साथ बदल दिया जाता है, और एक फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन को मजबूर किया जाता है जो टायर जीन में हस्तक्षेप करता है। एचडीआर विश्लेषण के लिए, प्रत्येक नमूने पर NHEJ (चरण 6.2.8) और HDR (चरण 6.2.9) दोनों विश्लेषण करें क्योंकि दोनों परिणाम हो सकते हैं और मोज़ेकिज़्म को निर्धारित करने में मदद कर सकते हैं। एक विस्तृत विधि और परिणाम पहले 9,16 वर्णित किए गए हैं।

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Representative Results

यह विधि कुशल कैस9/एसजीआरएनए आरएनपी असेंबली के लिए 100 μg sgRNA (> 6,000 ng/L सांद्रता पर 20 μL) उत्पन्न करती है। यहां वर्णित नियमित सुपरोव्यूलेशन विधि आमतौर पर प्रति प्लग मादा 10-20 व्यवहार्य भ्रूण का उत्पादन करती है। भ्रूण हेरफेर से जुड़ी त्रुटियों और विशिष्ट नुकसान को संभालने के कारण, अपेक्षित 80% भ्रूण निषेचित, व्यवहार्य और इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद उत्कृष्ट स्थिति में होते हैं। एक सफल प्रयोग निष्पादित करने में शोधकर्ताओं की सहायता के लिए, हमने माउस टायर लोकस को सकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 6) के रूप में लक्षित करने के लिए एक उदाहरण रणनीति प्रदान की है, जिसमें ओलिगो डिज़ाइन (चित्रा 6 ए, पूरक तालिका 1) और एनएचईजे और एचडीआर घटनाओं (चित्रा 6 बी) (चरण 6.2) दोनों के लिए जीनोटाइपिंग रणनीतियां शामिल हैं। प्रयोगात्मक सफलता और परिणामों के विस्तृत उदाहरणउपलब्ध हैं 9,16.

इस प्रोटोकॉल की तुलना माइक्रोइंजेक्शन से करने के पिछले प्रयास में, सामूहिक रूप से, माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए सात अलग-अलग प्रयोगशालाओं को शामिल करने वाले 30 से अधिक अलग-अलग संपादन प्रयास सभीसफल रहे। इसके अतिरिक्त, इस विधि का उपयोग स्तनधारी विकास27 में पहले आवश्यक रेट्रोट्रांसपोसन की जांच और रिपोर्ट करने के लिए किया गया था। एकल एसजीआरएनए देने जैसी सरल रणनीति का उपयोग करते समय, आरएनपी का वितरण सी 57बीएल /6 जे और सी 57 बीएल / 6 एन माउस उपभेदों में 100% तक था, जिसमें इन / डेल गठन 50-100% पर होता है और छोटे ऑलिगो-आधारित प्रतिस्थापन 14% -63% 9,16 तक होते हैं (तालिका 1)। जब इंजीनियरिंग जीनोमिक विलोपन होता है, तो संपादन प्रभावशीलता 3% से 100% तक भिन्न हो सकती है, जहां योगदान कारकों में जीनोमिक स्थान, एसजीआरएनए डिजाइन और विलोपन का आकार शामिल है (तालिका 2)। उदाहरण के लिए, 1,000 बीपी से छोटे विलोपन 1,000 बीपी 9,16 से बड़े लोगों की तुलना में अधिक सफल होते हैं।

इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए 60 भ्रूणों का उपयोग करते समय, यह प्रोटोकॉल संपादन प्रभावशीलता के मामले में माइक्रोइंजेक्शन को पार कर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोइंजेक्शन9 से एक संस्थापक की तुलना में 3-4 संस्थापक जानवर होते हैं। समान एसजीआरएनए का उपयोग करके सी 57बीएल /6 एन चूहों के तनाव में जीन नॉकआउट प्रयोगों के लिए, इस विधि ने माइक्रोइंजेक्शन को बेहतर प्रदर्शन किया, जिससे औसतन चार संस्थापक जानवर9 (तालिका 2) प्राप्त हुए। छोटे सम्मिलनों के लिए, जैसे कि वी 5 या एचए टैगिंग, 162 एनटी तक एसएसओडीएन का सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है, और वर्तमान में प्रयासों का उद्देश्य 1000-2000 एनटी तक बढ़ाना है। इन प्रयोगों की सफलता काफी हद तक एचडीआर परिणामों के मजबूत होने के लिए उपयोग किए जाने वाले एसजीआरएनए की प्रभावशीलता पर निर्भर करती है। लगभग सभी एचडीआर परिणाम मोज़ेक हैं, लेकिन 31% -64% भ्रूण के बीच 9,16 सम्मिलन के कुछ सबूत प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: CRISPR-EZ का अवलोकन। वर्कफ़्लो का एक ग्राफिकल अवलोकन. एक बार एक रणनीति और डिजाइन बनाने के बाद, संपादित भ्रूण लगभग 1 सप्ताह में उत्पन्न और परीक्षण किया जा सकता है। इस आंकड़े को Modzelewski et al.9 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। और चेन एट अल.16. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रक्रिया करने के लिए आदर्श समय। आरेख निषेचन के बाद पहले सेलुलर डिवीजन के दौरान प्रासंगिक विशेषताओं और समय बिंदुओं को दर्शाता है। इस दृष्टिकोण को पूरा करने के लिए, शोधकर्ताओं को कुछ दृश्यमान सुराग प्रदान किए जाते हैं, जैसे कि रूपात्मक परिवर्तन, सेल चक्र समय अनुमान, और रासायनिक मार्कर अक्सर पहले दरार से पहले देखे जाते हैं। चूंकि गर्भाधान और निषेचन का सटीक समय अज्ञात है, इसलिए एक समझदार सिफारिश यह होगी कि घंटे 0 को आधी रात के रूप में माना जाए। युग्मनज के एस-चरण में प्रवेश करने से पहले एनएचईजे या एचडीआर के लिए संपादन मशीनरी देने के लिए आदर्श क्षण है, जो सुबह 7 बजे से 11 बजे के बीच इस प्रोटोकॉल को निष्पादित करने में अनुवाद करता है। इस आंकड़े को Modzelewski et al.9 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: संपादन रणनीतियों की सफलता। एकल एसजीआरएनए जैसी सरल रणनीतियों के परिणामस्वरूप एचडीआर के माध्यम से एसएसओडीएन टेम्पलेट के साथ संयुक्त होने पर एनएचईजे मरम्मत या सटीक उत्परिवर्तन के माध्यम से एक इन / डेल होता है। एनएचईजे मरम्मत का उपयोग कई एसजीआरएनए का उपयोग करके विलोपन के लिए भी किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, रणनीति जितनी सरल होती है, अधिक प्रभावी CRISPR-EZ आगे अनुकूलन के बिना होता है। इस आंकड़े को Modzelewski et al.9 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: डिंबवाहिनी और एम्पुला का पता लगाना। शल्य चिकित्सा द्वारा प्रजनन ऊतकों को अलग करने के बाद, किसी को बल के साथ वसा पैड पर कोमल दबाव लागू करके क्षेत्र को सुरक्षित करना चाहिए। वसा पैड अंडाशय / डिंबवाहिनी को नुकसान नहीं पहुंचाने के लिए हेरफेर करने के लिए एक अपेक्षाकृत सुरक्षित क्षेत्र है। डैश किए गए वर्ग में क्षेत्र को हटा दिया जाना चाहिए और आगे विच्छेदन के लिए एम 2 की बूंद में रखा जाना चाहिए। एक कार्टून आरेख लेबल की गई प्रासंगिक शारीरिक संरचनाओं के साथ रुचि के क्षेत्र को दर्शाता है। इस आंकड़े को Modzelewski et al.9 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: सुझाए गए प्रसंस्करण और संस्कृति प्लेट सेटअप। भ्रूण प्रसंस्करण और संस्कृति दोनों के संचालन में शोधकर्ताओं की सहायता के लिए विभिन्न प्लेट सेटअप दिखाने वाले योजनाबद्ध। (ए) विशिष्ट एम 2 + बीएसए धोने की प्लेट। (बी) क्यूमुलस सेल हटाने के लिए एम 2 + हायलूरोनिडेस प्लेट। (सी) ज़ोना पतलेपन के लिए वैकल्पिक एटी समाधान प्लेट। (डी) भ्रूण संस्कृति के लिए केएसओएम + बीएसए प्लेट, पीएच, आर्द्रता और तापमान को बनाए रखने के लिए आवश्यक खनिज तेल ओवरले के साथ। इस आंकड़े को Modzelewski et al.9 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: NHEJ और HDR परिणामों के लिए जीनोटाइपिंग उदाहरण। (A) माउस जीनोम में टायर जीन के आसपास के क्षेत्र का एक कार्टून आरेख। नीचे असंपादित (डब्ल्यूटी) अनुक्रम का विवरण दिया गया है जहां एक स्वाभाविक रूप से होने वाली हिंफी प्रतिबंध साइट पाई जाती है, जो एसजीआरएनए (लाल पाठ) की लक्ष्य पहचान साइट के भीतर है। इसके नीचे CRISPR / Cas9 लक्ष्यीकरण के बाद कई संभावित परिणामों में से एक है जहां एक "in / del" बनता है। इस संपादन की सटीक प्रकृति की भविष्यवाणी करना मुश्किल है लेकिन लगभग निश्चित रूप से हिंफी साइट को बाधित करेगा। आगे नीचे दाता ऑलिगो अनुक्रम है जो हिंफी साइट को इकोआरआई मान्यता साइट में बदलने के लिए दो आधार जोड़े बदलता है। (बी) संपादन के बाद प्रतिनिधि प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) परिणाम। NHEJ (ऊपर) और HDR (नीचे) संपादन उदाहरण दिखाए गए हैं। इस आंकड़े को Modzelewski et al.9 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। इस आंकड़े को Modzelewski et al.9 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: टायर-संपादित युग्मकों और चूहों की फेनोटाइप और व्यवहार्यता। इस तालिका को Modzelewski et al.9 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: CRISPR-EZ और माइक्रोइंजेक्शन विलोपन प्रयोगों के परिणाम। इस तालिका को Modzelewski et al.9 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: ऑलिगोस और दाता एसएसओडीएन की सूची। इस तालिका को Modzelewski et al.9 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: एसजीआरएनए प्रतिक्रिया सेटअप के लिए डीएनए टेम्पलेट। इस तालिका को Modzelewski et al.9 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 3: इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन सेटअप। इस तालिका को Modzelewski et al.9 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 4: एनएचईजे गठन के लिए आरएनपी कॉम्प्लेक्स सेटअप। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 5: एचडीआर गठन के लिए आरएनपी कॉम्प्लेक्स सेटअप। इस तालिका को Modzelewski et al.9 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 6: विलोपन के लिए आरएनपी कॉम्प्लेक्स सेटअप। इस तालिका को Modzelewski et al.9 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 7: जीनोटाइपिंग पीसीआर सेटअप। इस तालिका को Modzelewski et al.9 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 8: नेस्टेड जीनोटाइपिंग पीसीआर सेटअप। इस तालिका को Modzelewski et al.9 की अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 9: हिंफी प्रतिबंध डाइजेस्ट सेटअप। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 10: इकोरी प्रतिबंध डाइजेस्ट सेटअप। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां प्रस्तुत एक सरल और अत्यधिक कुशल माउस जीनोम संपादन तकनीक है। इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग 1-2 सप्ताह (चित्रा 1) में संशोधित भ्रूण उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है और 6 सप्ताह 9 के भीतर संपादित चूहों का उत्पादन करसकता है। समकालीन रूप से विकसित इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित प्रोटोकॉल की तुलना में जो आरएनपी 7,10,11,12,13,14,15,17,32 प्रदान करते हैं, यहां वर्णित विधि वैचारिक रूप से समान है और अभिकर्मक विकास और मापदंडों में केवल मामूली अंतर के साथ एक ही सीमा में दक्षता प्रदान करती है। इसलिए, हम सुझाव देते हैं कि पाठक जरूरतों और उपकरणों तक पहुंच के आधार पर तुलना और विपरीत करें। जैसा कि नाम से ही स्पष्ट है, इस प्रोटोकॉल को "औसत माउस लैब" को ध्यान में रखते हुए विकसित किया गया था, जिसमें केवल सामान्य तरीके (आईवीटी, पीसीआर, जेल वैद्युतकणसंचलन), अभिकर्मक (मानक भ्रूण और ऊतक संस्कृति उपभोग्य), या उपकरण (इलेक्ट्रोपोरेटर और क्यूवेट आमतौर पर बैक्टीरियल अभिकर्मक के लिए उपयोग किए जाते हैं), जो संभवतः अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ हैं जो भ्रूण एकत्र करने में रुचि रखते हैं और सक्षम हैं (या कृपया पड़ोसी प्रयोगशालाओं से पूछकर)। बुनियादी भ्रूण हैंडलिंग कौशल वाले स्नातक छात्र स्तर के शोधकर्ता दक्षता के लिए एसजीआरएनए का परीक्षण कर सकते हैं या कोर सुविधा के साथ शेड्यूल करने की आवश्यकता के बिना प्रीइम्प्लांटेशन विकास की समय सीमा के भीतर कई बार डेटा-उत्पादन प्रयोग कर सकते हैं। हालांकि, यदि वांछित लक्ष्य माइक्रोइंजेक्शन या भ्रूण हेरफेर की आवश्यकता के बिना पशु मॉडल उत्पन्न करना है, तो कम घुसपैठ के तरीके उपलब्ध हैं 10,32।

कैस 9 दक्षता को प्रभावित करने वाले कई कारकों पर सक्रिय रूप से शोध किया जा रहा है, जैसे कि जीनोमिक लक्ष्य की विशिष्टता, एसजीआरएनए अनुक्रम पैरामीटर, जीनोम पहुंच और टोपोलॉजी, और, विशेष रूप से, सेल प्रकार। इसलिए, सफलता के लिए एसजीआरएनए को डिजाइन और परीक्षण करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल और अन्य स्वतंत्र रूप से विकसित इलेक्ट्रोपोरेशन विधियों को कैस 9 प्रोटीन / एसजीआरएनए आरएनपी को युग्मनज-चरण भ्रूण में जल्दी और क्षणिक रूप से वितरित करने के लिए अनुकूलित किया गया है, प्रारंभिक विकास चरण में वितरण के कारण मोज़ेकिज्म को कम करते हुए दक्षता में वृद्धि और आरएनपी 7,9,10,11,12,13,14,15 के छोटे आधे जीवन के लिए। 16,33,34.

सबसे आम जीनोम संपादन रणनीतियों और चूहों के विभिन्न उपभेदों के लिए, यह विधि लागत, दक्षता, छोटे सम्मिलन, इन / डेल म्यूटेशन, एक्सॉन विलोपन, सम्मिलन और बिंदु उत्परिवर्तन9 के मामले में माइक्रोइंजेक्शन से बेहतर प्रदर्शन कर सकती है। वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, यह विधि 2.6 केबी तक इन / डेल म्यूटेशन और विलोपन के निर्माण के लिए आदर्श है, जो 170 बीपी 35 के प्रोटीन-कोडिंग एक्सॉन की विशिष्ट लंबाई से बहुतअधिक है। लंबे विलोपन कम कुशल हैं; हालाँकि, यह सीमा इस प्रोटोकॉल के लिए अद्वितीय नहीं है। इसलिए, जैसा कि कैस 9-मध्यस्थता संपादन में सुधार हुआ है और नए सीएएस प्रोटीन वेरिएंट विकसित किए गए हैं, इस विधि की मॉड्यूलर प्रकृति इन सुधारों को सीधे हमारे प्रोटोकॉल की क्षमताओं को बढ़ाने की अनुमति देती है।

जबकि यह विधि विभिन्न प्रकार के सरल संपादन कर सकती है, बड़ी और अधिक जटिल रणनीतियों के लिए इसकी क्षमता, जैसे कि सशर्त एलील या फ्लोरोसेंट टैग डालना, वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला में परीक्षण किया जा रहा है। लंबे समय तक एसएसओडीएन जटिल जीनोम संपादन के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है और माइक्रोइंजेक्शन-आधारित भ्रूण संपादन में सफलता दिखा चुकाहै; हालांकि, लंबे समय तक एसएसओडीएन संश्लेषित करने के लिए महंगे हैं और अभी तक इलेक्ट्रोपोरेशन37 के साथ बड़े पैमाने पर परीक्षण नहीं किया गया है। 3.3 केबी दाता अनुक्रमों को पेश करने के लिए एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) के उपयोग ने सफलता भी दिखाई है, लेकिन अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ नहीं हो सकताहै। कुछ समय के लिए, हम जटिल माउस जीनोम इंजीनियरिंग के लिए मानक भ्रूण स्टेम सेल जीनोम संपादन और माइक्रोइंजेक्शन की सलाह देते हैं।

कैस 9 ऑफ-टारगेट प्रभावों के बारे मेंचिंताएं 8,38,39 बनी हुई हैं। इंजीनियर कैस 9 विविधताएं लक्ष्य विशिष्टता को बढ़ा सकती हैं, हालांकि आरएनपी भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन अध्ययनों में इसकी पूरी तरह से जांच नहीं की गई है। CRISPR-EZ जटिल आनुवंशिकी का पता लगाने के लिए यौगिक उत्परिवर्तन मॉडल बनाने के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है। जबकि माइक्रोइंजेक्टेशन ने एक साथ कई लोकी को संपादित करना संभव बना दियाहै, यहां वर्णित इलेक्ट्रोपोरेशन विधियां इसे अधिक सुविधाजनक और प्रभावी बनाती हैं।

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Disclosures

लेखकों द्वारा कोई प्रासंगिक वित्तीय घोषणा नहीं की गई है।

Acknowledgments

एजेएम ने मूल अवधारणा बनाई जिसने सीआरआईएसपीआर-ईजेड के विकास का नेतृत्व किया और आंकड़ों का उत्पादन किया। सी.के.डी. ने इस वर्तमान पांडुलिपि के लिए आंतरिक और प्रकाशित प्रोटोकॉल को संकलित और अनुकूलित किया। एजेएम एनआईएच (आर00एचडी096108) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 190
जाइगोट्स के सीआरआईएसपीआर इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा चूहों का कुशल जीनोम संपादन
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Diallo, C. K., Modzelewski, A. J.… More

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J. Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes. J. Vis. Exp. (190), e64302, doi:10.3791/64302 (2022).

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