Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

Abstract

עם יעילות, דיוק וקלות יוצאי דופן, מערכת CRISPR/Cas9 שיפרה באופן משמעותי את עריכת הגנום בתרביות תאים ובניסויים בחיות מעבדה. בעת יצירת מודלים של בעלי חיים, אלקטרופורציה של זיגוטות מציעה יעילות גבוהה יותר, פשטות, עלות ותפוקה, כחלופה לשיטת תקן הזהב של מיקרו-הזרקה. אלקטרופורציה היא גם עדינה יותר, עם כדאיות גבוהה יותר, ומספקת באופן אמין Cas9/Single guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) לתוך הזיגוטה של זני עכברי מעבדה נפוצים (למשל, C57BL/6J ו-C57BL/6N) שמתקרבים ל-100% יעילות מסירה. טכניקה זו מאפשרת החדרה/מחיקה (indels) מוטציות, מוטציות נקודתיות, מחיקה של גנים שלמים או אקסונים, והחדרות קטנות בטווח של 100-200 bp כדי להכניס LoxP או תגים קצרים כמו FLAG, HA או V5. תוך שיפור מתמיד, כאן אנו מציגים את המצב הנוכחי של CRISPR-EZ בפרוטוקול הכולל ייצור sgRNA באמצעות שעתוק חוץ גופי , עיבוד עוברים, הרכבת RNP, אלקטרופורציה וגנוטיפ של עוברים טרום השרשה. חוקר ברמת בוגר עם ניסיון מינימלי במניפולציה של עוברים יכול להשיג עוברים ערוכים גנטית תוך פחות משבוע באמצעות פרוטוקול זה. כאן, אנו מציעים שיטה פשוטה, זולה, יעילה ובעלת קיבולת גבוהה שניתן להשתמש בה עם עוברי עכבר.

Introduction

עריכת גנום בעכברים חיים פשטה במידה ניכרת והפכה לנגישה וזולה יותר מאז הופעתה של עריכת CRISPR 1,2,3. ניסיונות עריכה ראשוניים של בעלי חיים השתמשו במיקרו-הזרקה כדי להעביר CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA לעובריםבשלב הגרעיני 4,5,6. בעוד מיקרו-הזרקה יעילה למדי, כמות התרגול הנדרשת כדי לשלוט בה באופן מלא עשויה שלא להתאים למתאמנים ולסטודנטים וגם דורשת ציוד יקר שמעבדה במימון צנוע אינה יכולה להרשות לעצמה. מיקרו-הזרקה מבוצעת בדרך כלל על ידי טכנאים מומחים במתקנים טרנסגניים עם לוחות זמנים ומחירי שירות המגבילים את התעריף עבור חוקרים רבים. גישה נגישה יותר היא זו של אלקטרופורציה, אשר הוכחה כיעילה למדי להעברת CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA לעוברים בשלב גרעיני7. שיפורים נוספים באסטרטגיות העריכה והמסירה של גנום CRISPR הצביעו על כך ש-RNPs שהורכבו מראש וכבר עוסקים ב-sgRNA עשויים להיות אמצעי יעיל להפחתת פסיפס8.

הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בפרוטוקול זה היה לעקוף רבות מהמגבלות והמכשולים הקשורים למיקרו-הזרקה. כפי שהשם מרמז, שיטה קלה, פנימית וחסכונית שיכולה לקבוע במהירות אם תכנוני sgRNA שלא נבדקו יהיו כדאיים לשימוש במהלך ניסוי מיקרו-הזרקה תהיה שלב בקרת איכות מעבר ראשון נוח מאוד (איור 1). בעוד ששיטה זו אינה יכולה להחליף מיקרו-הזרקה לאסטרטגיות מורכבות יותר, כמו החדרת רצפי דנ"א ארוכים של תורמים לתוצאות מבוססות רקומבינציה, היא אידיאלית לאסטרטגיות פחות מורכבות כמו מחיקות קטנות או החדרות ותיוג גנים. שיטה זו מתאימה לחוקרים בעלי מיומנויות בסיסיות של מניפולציה בעוברים שיש להם צרכי עריכה פשוטים, המעוניינים לבחון את ההשערה שלהם במסגרת הזמן של התפתחות טרום השרשה, או מעדיפים לבדוק sgRNA בעוברים לפני קביעת פגישה עם מומחה מיקרו-הזרקה. כאן, ריאגנטים עורכים מועברים באופן זמני לעוברים בשלב הגרעיני כמו Cas9/sgRNA RNPs באמצעות אלקטרופורציה (סדרה של פולסים חשמליים) כדי למקסם את היעילות תוך הפחתת פסיפס8. בשיטת גנוטיפ עוברי, תוצאות העריכה זמינות תוך כשבוע9, ובכך מפחיתות את הצורך ביישומי מיקרו-הזרקה שונים בעלות מופחתת משמעותית.

יעילותה של שיטה זו מגיעה לשיאה בשלב העובר הפרו-גרעיני, כאשר העובר עדיין לא התיך את גרעיני האם והאב או נכנס לשלב S (איור 2). סופרביולציה משמשת למקסום מספר הזיגוטה אך מייצרת גם זיגוטות פרו-גרעיניות וגם ביציות לא מופרות. ניתן גם לבחור מראש זיגוטים בריאים לפני אלקטרופורציה כדי להגביר את היעילות הכוללת. מכיוון שפרוטוקולי אלקטרופורציה אחרים ערכו זיגוטות ביעילות ללא צורך לכלול שלב דומה 7,10,11,12,13,14,15, שלב אופציונלי בפרוטוקול זה הוא שחיקה קלה של הזונה פלוצ'ידה (ZP). ZP היא שכבת גליקופרוטאין המסייעת לקשירת זרעונים, תגובת אקרוזום והפריה סביב עוברים בשלב הגרעיני. מניסיוננו, מצאנו כי שחיקה עדינה על בסיס חומצה של ZP מספקת אספקת אלקטרופורציה Cas9 RNP אמינה עם השפעה שולית בלבד על הכדאיות.

ראינו קצבי העברת RNP של עד 100% יעילות באמצעות אלקטרופורציה בזני עכברים המשמשים בדרך כלל במחקר כמו C57BL/6J ו- C57BL/6N 9,16. קבוצות עצמאיות פיתחו גם נהלים מבוססי אלקטרופורציה עם יעילות גדולה או תואמת מיקרו-הזרקה 11,12,13,14,15,17, עם פרוטוקולי אלקטרופורציה המתפקדים היטב בחולדות18,19, חזיר 20,21,22 ופרה 23 לכן אנו מציעים לקוראים להשוות את הפרוטוקולים כדי למצוא את התנאים המתאימים ביותר לצרכי הניסוי והציוד שלהם., המערכת המתוארת כאן משתמשת בחומרים ובציוד נפוצים, הדורשים רק מיומנויות בסיסיות של מניפולציה עוברית. טכניקה זו יעילה למגוון אסטרטגיות עריכה, מה שהופך שיטה זו לנגישה באופן נרחב לקהילת המחקר.

תכנון רנ"א מדריך קטן אידיאלי (sgRNAs) חיוני לעריכה יעילה. אנו ממליצים לסנן שתיים עד שלוש אסטרטגיות sgRNA לכל אתר מטרה ישירות בעוברי עכברים, במיוחד אם רוצים ליצור קו עכבר. לאחר התכנון, שיטות ללא שיבוט כמו שעתוק חוץ גופי (IVT) לייצור sgRNA באיכות גבוהה מומלצות3. ה-RNPs וה-sgRNA מעורבבים עם 30-50 עוברים מעובדים בשלב הגרעיני ונחשפים לסדרה של פולסים חשמליים כדי לחדור תחילה באופן זמני את ה-ZP ואת קרום התא, עם פולסים עוקבים כדי לשמור על הנקבוביות פתוחות ואלקטרופורזה של ה-RNPs דרך הזיגוטה24. לאחר אופטימיזציה, מצאנו כי שישה פולסים של 3 מילישניות ב- 30 V עבור עוברים בתפזורת (~ 50) היו אופטימליים ליעילות עריכה וכדאיות, וסיפקו משלוח יעיל ביותר של Cas9/sgRNA RNP 9,16,25. ניתן לאשר עריכת אירועים במורולה של עכבר בודד באמצעות מגוון אסטרטגיות אימות נפוצות לעריכת קריספר, כגון פולימורפיזם אורך מקטע הגבלה (RFLP), עיכול אנדונוקלאז T7 וריצוף סנגר של אזור העניין26.

השיטה הנוכחית מתאימה ביותר לסכמות עריכה פשוטות (איור 3), כגון הכנסה/מחיקות (indels), מחיקות בגודל אקסון בסדר גודל של 500-2000 bp, והעברת מוטציות נקודתיות ותוספות קטנות כגון תגי C- או N-Terminal (לדוגמה, FLAG, HA או V5)9,16,27. הפוטנציאל לעריכת גנום מורכבת, כמו החדרות גדולות של תגים פלואורסצנטיים או אללים מותנים, נותר לא ברור והוא המוקד הנוכחי של שיפורים עתידיים.

קל לשלוט בשיטה הזו, וניתן להשתמש בה כדי לבדוק במהירות sgRNA בעוברי עכברים בתרבית בשבוע9 (איור 1). בעבודה זו מוצג פרוטוקול בן שישה שלבים, הכולל 1) תכנון sgRNA; 2) סינתזת sgRNA; 3) ביוץ יתר והזדווגות; 4) תרבית עוברים, איסוף ועיבוד; 5) הרכבת RNP והתחשמלות; 6) תרבית עוברים וגנוטיפ. מידע על כל החומרים בהם נעשה שימוש מסופק (טבלת חומרים). כבקרה חיובית, ריאגנטים לעריכת מוקד הטירוזינאז (Tyr) 9,16 נכללו בטבלה המשלימה 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הטיפול והשימוש בבעלי חיים לאורך פרוטוקול זה דבקו במדיניות חוק רווחת בעלי החיים, במדריך ILAR לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ועקבו אחר הנחיות AVMA להמתת חסד וההנחיות והמדיניות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פנסילבניה (IACUC). פרוטוקול הטיפול והשימוש בבעלי חיים נבדק ואושר על ידי IACUC של אוניברסיטת פנסילבניה עבור פרויקט זה. כעניין של ציות וזהירות, אנא חפש את כל האישורים הדרושים לפני שתנסה פרוטוקול זה.

1. sgRNA ועיצוב אוליגו תורם אופציונלי

  1. עיצוב sgRNA
    1. בחר sgRNA מועמדים מכל אלגוריתמים מקוונים נפוצים, כגון סריקת רצף עבור CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 או CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. מכיוון שכל פלטפורמה היא ייחודית, אנא קרא בעיון את הוראות המשתמש על מנת לעצב sgRNA אידיאלי. עבור ניסויי in/del, בחר שניים עד שלושה sgRNA לבדיקה. עבור מחיקות, sgRNA המקיפים את אזור המטרה מוצעים, למשל, שני sgRNA במעלה הזרם של המטרה ושני sgRNA במורד הזרם של המטרה.
      הערה: בעוד אלגוריתמי sgRNA מקוונים שונים לוקחים בחשבון מטרות מחוץ למטרות כדי להימנע מתכנוני sgRNA פגומים, כלי BLAST של NCBI עוזר לאשר את האיכות של רצפי sgRNA שנבחרו.
    2. הכנס 19-20 נוקלאוטידים (nt) שנקבעו מהשלב הקודם (1.1.1) לאזור המשתנה של אוליגו sgRNA (טבלה משלימה 1) ורכוש sgRNA מסונתז כאוליגוס DNA מותאם אישית.
      הערה: אין צורך בטיהור עמוד.
  2. (אופציונלי) עיצוב אוליגו תורם לתיקון מכוון הומולוגיה (HDR) בתיווך נוק-אין.
    1. תכנן את האוליגודאוקסינוקלאוטיד החד-גדילי המתאים (ssODN) בהתבסס על תוצאת הניסוי הרצויה (מוטציה מדויקת נקודתית, החדרת loxP, החדרת תג קטן וכו '), תוך שמירה על אורך כולל של 100-200 nt עם זרועות הומולוגיה של 50 nt או יותר המאגפות את אזור המרכז.
    2. כדי להבטיח יעילות דפיקה גבוהה יותר, תכננו את ה-sgRNA כך שישלים את ה-ssODN30, והחליפו את רצף המוטיב הסמוך לפרוטוספייסר (PAM) במוטציה שקטה כדי למנוע חיתוך חוזר על ידי האנזים Cas9.
    3. הזמינו ssODN באמצעות אפשרות אוליגו מותאמת אישית.

2. סינתזת sgRNA

  1. יצירת תבניות לתמלול חוץ גופי (IVT)
    1. כדי ליצור את תבנית ה-DNA עבור sgRNA IVT באמצעות PCR, הכינו תגובת IVT בצינור רצועת PCR נטול RNAse. (ראה טבלה משלימה 2).
    2. השתמש בתנאי המחזור התרמי הבאים:
      95 °C למשך 2 דקות; 30 מחזורים של 95 ° C במשך 2 דקות, 57 ° C עבור 10 שניות, ו 72 ° C עבור 10 שניות; ואז 72 °C למשך 2 דקות
    3. כדי לאמת את ההצלחה של תגובת PCR של תבנית sgRNA DNA, אלקטרופורזה 5 μL של המוצר בשילוב עם 1 μL של 6x טעינת צבע על ג'ל אגרוז 2% (wt/vol).
      הערה: גודל המוצר הצפוי הוא 127 bp. כל תגובת PCR שנותרה יכולה להיות מאוחסנת ב -20 ° C למשך עד 5 חודשים.
  2. שעתוק חוץ גופי (IVT) של sgRNA
    1. כדי ליצור את ה-sgRNA, הכינו את תערובת התגובה (T7 IVT לפי הוראות היצרן) בצינור PCR ולחצו כדי לערבב את הריאגנטים.
      הערה: ראה טבלה משלימה 3 לקבלת דוגמת הגדרת התגובה. תגובת IVT רגישה לזיהום RNase; לכן, לעשות כל מאמץ כדי לספק סביבה נטולת RNase.
    2. כדי לאפשר לתגובה להתחיל ולהמשיך, יש לדגור על תערובת תגובת IVT במשך >18 שעות ב-37°C במחזור תרמי או בבלוק חום.
    3. כדי לפרק את תבנית הדנ"א המקורית (שלב 2.1.3), הכנס 1 μL של DNase I (2 יחידות לכל תגובה) ודגור על התגובה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    4. כדי לקדם את קשירת RNA לחרוזי הטיהור המגנטיים, שלבו 129 μL של 100% אתנול בתגובה, שכעת תהיה 150 μL.
    5. כדי להשעות מחדש את חרוזי טיהור, אשר נוטים להתיישב במהלך האחסון, מערבל את aliquot לפחות 10 שניות.
    6. כדי לטהר את sgRNAs, הוסף 100 μL של חרוזים מרחפים מחדש (שלב 2.2.5) לתגובת IVT (שלב 2.2.4) וערבב בעדינות על ידי pipeting למעלה ולמטה 10x.
    7. כדי לאפשר קשירה, הניחו לתערובת לנוח על RT למשך 5 דקות.
    8. כדי לבודד את ה-sgRNA מתוצרי התגובה הלא משולבים, הניחו את התגובה על המעמדים המגנטיים למשך 5 דקות ב-RT והמתינו עד שתיווצר גלולה קטנה.
    9. כדי לשטוף את sgRNAs, תחילה בזהירות להשליך את supernatant ולאחר מכן להוסיף 200 μL של 80% אתנול מן הכדור.
      הערה: במהלך שלב שטיפת האתנול 80% (vol/vol), חיוני להימנע מהפרעה לגלולה על ידי פיפטציה, שכן זה יפחית את ריכוזי sgRNA במידה ניכרת. במקום זאת, פיפטה עדינה את 80% אתנול כך הגלולה הוא שקוע, בעדינות להסיר את נפח עם פיפטה.
    10. חזור על השלב הקודם (שלב 2.2.9) וייבוש באוויר את הגלולה במשך לא יותר מ 5-6 דקות או sgRNA יהיה קשור לצמיתות עם החרוזים.
    11. הצהירו את ה-sgRNA עם 20μL של מים נטולי נוקלאז על ידי פיפטציה של הגלולה פי 10, דגירה למשך 2 דקות ב-(RT), ולאחר מכן הנחתה בחזרה על המעמד המגנטי כדי להפריד את החרוזים מה-sgRNA המטוהר כעת.
    12. כדי להעריך את האיכות והכמות של sgRNA, השתמש במכשיר כמו ספקטרופוטומטר או ביואנלייזר. לחלופין, על ג'ל אגרוז 2%, להפעיל 2 μL של sgRNAs, בדומה לשלב 2.1.3.
      הערה: האיכות מאושרת על-ידי פס שקוף יחיד. ניתן להשתמש בשארית ה-sgRNA באופן מיידי או לאחסן בתנאים של -80°C.

3. סופרביוץ

  1. כדי לספק מספיק עוברים כדי לבדוק כל עיצוב sgRNA, סופרביוץ שתיים עד שלוש נקבות C57BL/6J בנות 3-5 שבועות, כפישתואר קודם 9. מומלץ לבצע אלקטרופורציה של 20-30 עוברים לכל sgRNA כדי לייצר מספיק תוצאות כדי לאשר את יעילותם.
    הערה: אם ההפריה מוצלחת, צפו ל-10-20 עוברים בכל הזדווגות.
  2. כדי לגרום לביוץ, בצע את לוח הזמנים הזה הזרקת הורמונים:
    1. יום 1: מתן 5 IU של גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון (PMSG) (100 μL) באמצעות הזרקה intraperitoneal (IP) באמצעות מזרק 26 G לתוך עכברות בנות 3-5 שבועות.
    2. יום 3: לאחר 46-48 שעות של הזרקת PMSG, יש להזריק 5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) (100 μL) באמצעות הזרקת IP כדי לגרום לביוץ.
    3. כדי לבסס רבייה, זיווג נקבות 1:1 עם זכר של רבייה אמינה מיד לאחר הזרקת hCG.
      הערה: כדי למנוע מהורמונים להתפרק ולאבד פעילות, יש לבצע זריקות מתחת ל-30 דקות של הפשרה.

4. איסוף עוברים ועיבודם

  1. איסוף עוברים
    1. כדי להרדים נקבות ולאחזר את החומר הדרוש, כפי שתואר קודם לכן31, הקפד לאשר תחילה את השיטה המתאימה בהתאם למדיניות המוסדית. לדוגמה, השתמש בחנק CO2 , נקע צוואר הרחם ו / או שיטות מאושרות אחרות.
      הערה: בדרך כלל, >75% מהנקבות המגורות הורמונים מציגות תקעים כפייתיים, המעידים על הזדווגות מוצלחת.
    2. כדי למנוע משערות להקשות על איסוף רקמות, הניחו את הנקבות המורדמות על גבן וריססו אתנול 70% (vol/vol) על אזור הבטן לפתיחה כירורגית.
      הערה: מנקודה זו ואילך, מומלץ לבצע את השלבים הכירורגיים במכסה מנוע מאוורר על מנת לשמור על סביבה אספטית ולהפחית את פוטנציאל הזיהום.
    3. כדי לפתוח את חלל הבטן ולהסיר את הביציות, חתכו את שכבת העור/שיער (תת עורית) עם מספריים כירורגיים, ואתרו את השחלות (איור 4), שנמצאות ליד הכליה וחולקות קטע של כרית שומן. הביציות ממוקמות פרוקסימליות לשחלות (איור 4). הסירו בניתוח את שתי האובידוקט מהנקבה והכניסו אותן לטיפות בודדות של 50 μL של M2+BSA (4 מ"ג/מ"ל BSA) בינוני (איור 5A).
      הערה: ניתן להציג הוראות מפורטות עבור חלק זה של ההליך באופן חזותי31 או לעקוב אחר שלב9 באמצעות פרוטוקולים שפורסמו בעבר.
    4. כדי לשחרר את קומפלקסי הקומולוס-ביציות (CoCs) המכילים ביציות (איור 4), השתמשו במלקחיים לדיסקציה כדי לנקב את האמפולה של האובידוקט בזמן צפייה דרך סטריאומיקרוסקופ.
    5. כדי להפחית את כמות הפסולת (דם, שומן, רקמות), העבירו ושלבו כל CoC לטיפה אחת של 50 μL של מדיה M2+BSA עם פיפטה ידנית המוגדרת ל 20-30 μL כדי למנוע נשיאה של פסולת.
  2. הסרת תאי קומולוס
    1. כדי להתחיל בהסרה של תאי קומולוס מהזיגוטות (איור 4), העבירו CoCs עם כמה שפחות מדיה נוספת לטיפה של 100 μL M2+היאלורונידאז (איור 5B), וערבבו בעדינות על-ידי פיפטציה של CoCs עד שהעוברים מופרדים באופן נראה לעין מתאי הקומולוס הקטנים בהרבה. הקפד לשמור על חשיפה מינימלית של M2+היאלורונידאז לעוברים, שכן זה עלול להשפיע על הכדאיות.
      הערה: ניתן לחמם מראש (37°C) או להוסיף 50 μL נוספים של M2+היאלורונידאז אם העוברים אינם נפרדים מתאי הקומולוס תוך 2 דקות.
    2. כדי לדלל היאלורונידאז ולפנות תאי קומולוס רופפים מהזיגוטות, השתמשו בפיפט המופעל על ידי הפה כדי להעביר את הזיגוטה לטיפה טרייה של 50 μL M2+BSA.
      הערה: רוב השלבים מעבר לנקודה זו דורשים שימוש בפיפטה המופעלת על ידי הפה, אלא אם כן צוין אחרת. בעוד הסיכון לזיהום מהמשתמש נמוך, מומלץ להשתמש במסנן אוויר מוטבע כדי לשמור על סביבה אספטית. אנא עיין בשיטות שתוארו קודם לכן כדי להכין ולהשתמש במכשיר זה 9,31.
    3. באמצעות פיפטה בפה, העבירו את העוברים דרך לפחות ארבע עד חמש טיפות נוספות של 50 μL M2+BSA כדי להפחית את מספר תאי הקומולוס.
  3. (אופציונלי) דילול של zona pellucida עם תמיסת חומצה tyrode (AT).
    1. כדי לשחוק את הזונה פלוצ'ידה של העובר ולהפחית מכשולים פיזיים נוספים ללידה ריאגנטית, העבירו את העוברים לטיפה 100 מיקרוליטר של תמיסת AT שחוממה מראש (37°C) על צלחת בקוטר 60 מ"מ (איור 5C). התבוננו ברציפות בזיגוטה באמצעות סטריאומיקרוסקופ עד שכ-30% מהזונה פלוצ'ידה נשחקת9. החשיפה הכוללת ל- AT חייבת להיות 60-90 שניות. חשיפה ממושכת ל- AT יכולה להמיס לחלוטין את הזונה פלוצ'ידה ולסכן את כדאיות העובר.
      הערה: לקבלת הוראות מפורטות ותמונות של חלק זה של הנוהל, עיין בשיטות 9,16 שפורסמו בעבר.
    2. כדי לדלל את AT, השתמש פיפטה הפה כדי להעביר את העוברים דרך לפחות ארבע טיפות 50 μL של M2 + BSA.
    3. כדי לקבוע אם מספר מתאים של עוברים עובדו, השתמש בסטריאומיקרוסקופ כדי לספור את העוברים. בהתאם למספר נקבות העכברים בהן נעשה שימוש, ניתן לצפות לכ-10-20 זיגוטים בני קיימא לכל נקבה.
      הערה: בשלב זה, העוברים צריכים להיות נקיים יחסית מפסולת שתמנע הערכת כמות ואיכות. לדוגמה, אם משתמשים בחמש נקבות, מספרי הזיגוטה הצפויים יהיו ככל הנראה בין 50-100, ומונה תאים מכני יהיה מתאים כדי לעקוב אחר עוברים. מקובל לאבד כ-10%-20% מהעוברים עקב אי הפריה או ביוץ של ביציות באיכות נמוכה. בשלב הבא, אחסנו את העוברים בקצרה ב-50 מיקרוליטר של M2+BSA למשך לא יותר מ-30 דקות באינקובטור.

5. הרכבת RNP ואלקטרופורציה

  1. הרכבת RNP
    1. כדי להרכיב את קומפלקס ה-RNP, השתמש בטבלאות לדוגמה המצורפות כדי לשלב את תערובות התגובה המתאימות בהתבסס על אסטרטגיית העריכה הרצויה במאגר RNP (100 mM HEPES pH 7.5, 750 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 50% גליצרול ו-100 mM Tris(2-carboxyethyl) פוספין הידרוכלוריד [TCEP] במים נטולי נוקלאז)
      הערה: TCEP הוא חומר מחזר נוח אך בעל זמן מחצית חיים קצר בתמיסות מימיות; לכן, הוסף TCEP ממש לפני הרכבה מורכבת RNP.
      1. עבור indels בתיווך הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), עיין בטבלה משלימה 4.
      2. לעריכה בתיווך תיקון מכוון הומולוגיה (HDR), עיין בטבלה משלימה 5.
      3. למחיקות הנדסיות באמצעות sgRNA זוגי, עיין בטבלה משלימה 6.
        1. ללא קשר לאסטרטגיה, שלב את הריאגנטים הרצויים ב- RT בצינור PCR.
        2. כדי לאפשר היווצרות קומפלקס RNP, לדגור על התערובת במשך 10 דקות ב 37 ° C.
          הערה: ניתן לאחסן קומפלקס RNP ב- RT עד שעה אחת.
  2. אלקטרופורציה
    1. כדי לדלל את BSA לפני אלקטרופורציה, להעביר את העוברים דרך לפחות שתי טיפות של 50 μL של מדיה בסרום מופחת.
      הערה: BSA מגביר את ההתנגדות במהלך אלקטרופורציה ועלול לפגוע בזיגוטים.
    2. כדי להכין ולערבב את הזיגוטה (שלב 4.3.2) עם קומפלקס RNP (שלב 5.1.1.2) עבור electroporation, פיפטה הפה 25-30 עוברים לתוך טיפה 10 μL של מדיה בסרום מופחת, ולאחר מכן להשתמש פיפטה כף יד להוסיף 10 μL של קומפלקס RNP (שלב 5.1.1.2).
    3. כדי לדלל את הגליצרול הצמיג מקומפלקס RNP ולהפוך את הדגימה להומוגנית, מערבבים על ידי פיפטינג פי 10 או עד שהתערובת כבר לא מראה סימני צמיגות (תבנית מערבולת) באמצעות סטריאומיקרוסקופ.
    4. כדי להכין את הדגימה להחדרה לתוך אלקטרופורטור, פיפטה זו 20 μL של תערובת עובר + RNP לתוך קובטת אלקטרופורציה 0.1 ס"מ תוך הימנעות בועות.
    5. כדי להעביר את ריאגנטי העריכה לזיגוטה יש לחשמל את העוברים באמצעות פרוטוקול גל מרובע בתנאים הבאים: 30 וולט, 4-6 פולסים, אורך פולס של 3 אלפיות השנייה ו-100 מרווחי פעימות.
    6. כדי לאחזר זיגוטות מהקובטה, השתמש בפיפט ידני כדי להעביר 50 μL של KSOM+BSA (1mg/mL BSA) לחלק העליון של הקובטה כדי לשטוף את העוברים שאולי התיישבו למטה. מזלפים בעדינות את התערובת החוצה ועל צלחת בקוטר 60 מ"מ.
    7. חזור על שלב 5.2.6 לפחות 2x-3x ושלב כל סומק על צלחת 60 מ"מ עד שרוב העוברים מוחזרים.
      הערה: התאוששות טיפוסית היא >90% מהעוברים שנטענו במקור. כדי להבטיח את הישרדות העובר, בדוק את האינקובטור ובדוק את תאריכי התפוגה של כל הריאגנטים. עוברים רגישים לתנאי תרבית לא אידיאליים כגון טמפרטורה, רמת CO2 , לחות ו- pH.

6. תרבית עוברים וגנוטיפ

  1. תרבית עוברים
    1. כדי לגדל זיגוטות לשלב הרצוי, השתמשו בפיפטת פה כדי להעביר 20-30 זיגוטות לתוך טיפה של KSOM+BSA בצלחת תרבית מאוזנת מראש והעבירו את העוברים לטיפה (איור 5D). יש לדגור על הצלחת למשך הלילה ב-5% CO2, בטמפרטורה של 37°C, עם 95% לחות.
      הערה: יש לבצע שיווי משקל מראש על-ידי הצבת לוח תרבית מוכן בקוטר 35 מ"מ באינקובטור יום לפני או לפחות 4 שעות לפני הדגירה (איור 5D).
    2. כדי לקדם תנאי גדילה אידיאליים, העבירו רק עוברים דו-תאיים ביום המחרת לטיפה טרייה של תערובת KSOM+BSA באמצעות סטריאומיקרוסקופ וחזרו לאינקובטור. הקפד להשאיר או להשליך את העוברים המתים או הלא מופרים.
      הערה: עוברים בשלב הגרעיני בדרך כלל גדלים למורולה לאחר 72 שעות של תרבית ובלסטוציסטים לאחר 84 שעות.
  2. גנוטיפ
    1. כדי לדלל את מרכיבי המדיה שעלולים להפריע לתגובת PCR, שטפו את עוברי המורולה/בלסטוציסט באמצעות פיפטה בפה על ידי מעבר דרך שתי טיפות של DPBS.
    2. כדי לטעון עוברים בודדים עבור ליזיס, להעביר עוברים בודדים לבאר אחת של רצועת PCR 8 באר על ידי הגדרת פיפטה ל 1 μL, ולאחר מכן להוסיף 10 μL של חיץ ליזה (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8.5, 2.5 mM MgCl 2, 0.1 מ"ג / מ"ל ג'לטין, 0.45% Nonidet P-40, 0.45% Tween 20, 0.2 מ"ג / מ"ל פרוטאינאז K ב H2 O ללא נוקלאז).
      הערה: יש להוסיף פרוטאינאז K ממש לפני הכנת מאגר הליזיס.
    3. כדי לשכב את העוברים, תכנת מחזור תרמי ל 55 ° C במשך 4 שעות, ולאחר מכן להשבית את proteinase K עם דגירה של 10 דקות ב 95 ° C.
      הערה: במיוחד עבור משתמשים בפעם הראשונה, נסה ניסוי עריכה ב- Tyr loci. זרימת עבודה זו עברה אופטימיזציה ויכולה לשמש כבקרה חיובית. במידת הצורך, לאחסן את העובר lysates ב 4 ° C במשך 2-3 ימים או במקפיא עד 2 שבועות לפני ניתוח PCR. יש למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
    4. כדי להגדיל את הסיכויים לניתוח גנוטיפ מוצלח, בצע אסטרטגיית PCR מקוננת על ידי הגברת מקטעי DNA מעט ארוכים יותר המקיפים את אתר היעד, כמו גם אזורים שישמשו להגברת מקטע DNA מדויק יותר. בהתאם לתנאים בטבלה משלימה 7.
    5. עקוב אחר תנאי המחזור התרמי שהוזכרו להלן:
      95 °C למשך 2 דקות
      30+ מחזורים: 95°C למשך 2 דקות, 60°C למשך 10 שניות ו-72°C למשך 10 שניות
      72 °C למשך 2 דקות
    6. כדי להכין את השלב השני של אסטרטגיית PCR מקוננת, בצע דילול ביחס של 1:10 של מוצר ה-PCR הראשון (שלב 6.2.5) וטען 2 מיקרוליטר מזה לתגובת ה-PCR הבאה (עם פריימרים שתוכננו להיות בתוך המגבר הקודם).
      הערה: יש לדלל את תגובת ה-PCR הראשונה כדי להפחית את הנשיאה של פריימרים צמודים בתגובת ה-PCR השנייה. הכן את ה- PCR המקונן על-ידי ביצוע השלבים בטבלה משלימה 8.
    7. מקם את תגובת ה- PCR במחזור תרמי באמצעות תנאי הרכיבה הבאים:
      95 °C למשך 2 דקות
      30 מחזורים: 95°C למשך 2 דקות, 60°C למשך 10 שניות ו-72°C למשך 10 שניות
      72 °C למשך 2 דקות
      הערה: בדרך כלל, >90% מתגובות ה-PCR מצליחות כאשר גודל האמפליקון הוא 500 bp או פחות.
    8. (פקד אופציונלי) עבור מוטציות in/del בתיווך NHEJ המשתמשות ב-Tyr כבקרה חיובית, יש לעכל 10 μL של מוצרי ה-PCR המקוננים משלב 6.2.7 על ידי דגירה ב-37°C למשך 4 שעות באמצעות 10U של HinfI בתגובה של 20 μL (ראה טבלה משלימה 9). על ג'ל אגרוז 2%, הפעל את המוצר המעוכל כדי להעריך עריכה והשתמש במוצר PCR לא מעוכל כבקרת עומס. הפעל את הג'ל ב 135 V במשך 30 דקות.
      הערה: השימוש ב-HinfI כאנזים הגבלה מתאים נבחר בשל אתר HinfI הממוקם בנוחות באזור היעד של sgRNA שצפוי לעבור עריכה מוצלחת של NHEJ. שיטה מפורטת ותוצאות תוארו בעבר 9,16.
    9. (פקד אופציונלי) עבור מוטציות בתיווך HDR המשתמשות ב-Tyr כבקרה חיובית, יש לעכל 10 μL של מוצרי PCR מקוננים משלב 6.2.7 על ידי דגירה ב-37°C למשך 4 שעות באמצעות 10U של EcoRI בתגובה של 20 μL (ראה טבלה משלימה 10). על ג'ל אגרוז 2%, הפעל את המוצר המעוכל כדי להעריך עריכה והשתמש במוצר PCR לא מעוכל כבקרת עומס. הפעל את הג'ל ב 135 V במשך 30 דקות.
      הערה: הבחירה ב-EcoRI כאנזים הגבלה אבחוני מנצלת את הרצף המקורי שנמצא באזור היעד של sgRNA, שם, עם HDR מוצלח, אתר HinfI הטבעי מוחלף באתר EcoRI, ומוטציה של frameshift מאולצת שמפריעה לגן Tyr. עבור ניתוח HDR, בצע ניתוחי NHEJ (שלב 6.2.8) ו- HDR (שלב 6.2.9) בכל דגימה, מכיוון ששתי התוצאות יכולות להתרחש ויכולות לסייע בקביעת הפסיפס. שיטה מפורטת ותוצאות תוארו בעבר 9,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטה זו מייצרת יותר מ -100 מיקרוגרם של sgRNA (20 μL בריכוז >6,000 ng/L) להרכבה יעילה של Cas9/sgRNA RNP. שיטת הסופרביוץ השגרתית המתוארת כאן מייצרת בדרך כלל 10-20 עוברים בני קיימא לכל נקבה מחוברת. בשל טעויות טיפול והפסדים אופייניים הקשורים למניפולציה של עוברים, צפוי כי 80% מהעוברים מופרים, ברי קיימא ובמצב מצוין לאחר התחשמלות. כדי לסייע לחוקרים לבצע ניסוי מוצלח, סיפקנו אסטרטגיה לדוגמה למיקוד מוקד הצמיג של העכבר כבקרה חיובית (איור 6), כולל עיצובי אוליגו (איור 6A, טבלה משלימה 1) ואסטרטגיות גנוטיפ עבור אירועי NHEJ ו-HDR (איור 6B) (שלב 6.2). דוגמאות מפורטות של הצלחה ותוצאות ניסוי זמינות 9,16.

במאמץ קודם להשוות פרוטוקול זה למיקרו-הזרקה, ביחד, יותר מ-30 ניסיונות עריכה שונים שכללו שבע מעבדות נפרדות ליצירת מודלים של עכברים היו כולם מוצלחים 9,16. בנוסף, שיטה זו שימשה כדי לחקור ולדווח על רטרוטרנספוזון חיוני הראשון בהתפתחות יונקים27. בעת שימוש באסטרטגיה פשוטה כגון אספקת sgRNA יחיד, אספקת RNPs הייתה עד וכולל 100% בזני עכברי C57BL/6J ו- C57BL/6N, עם היווצרות in/del המתרחשת ב- 50-100% ותחליפים קטנים מבוססי אוליגו הנעים בין 14%-63% 9,16 (טבלה 1). בעת הנדסת מחיקות גנומיות, יעילות העריכה יכולה לנוע בין 3% ל-100%, כאשר הגורמים התורמים כוללים מיקום גנומי, תכנון sgRNA וגודל המחיקה (טבלה 2). לדוגמה, מחיקות קטנות מ- 1,000bp מוצלחות יותר ממחיקות גדולות מ- 1,000 bp 9,16.

כאשר משתמשים ב-60 עוברים לצורך אלקטרופורציה, פרוטוקול זה עולה על מיקרו-הזרקה מבחינת יעילות העריכה, והתוצאה היא 3-4 בעלי חיים מייסדים לעומת מייסד אחד ממיקרו-הזרקה9. עבור ניסויי נוקאאוט גנטי בזן עכברי C57BL/6N באמצעות sgRNA זהה, שיטה זו השיגה ביצועים טובים יותר ממיקרו-הזרקה, והניבה בממוצע ארבעה בעלי חיים מייסדים9 (טבלה 2). עבור תוספות קטנות, כגון תיוג V5 או HA, ssODN עד 162 nt נבדקו בהצלחה, והמאמצים מכוונים כעת לקנה מידה של עד 1000-2000 nt. הצלחתם של ניסויים אלה תלויה במידה רבה ביעילות של sgRNA המשמש לתוצאות HDR להיות חזקות. כמעט כל תוצאות HDR הן פסיפס, אך בין 31%-64% מהעוברים מציגים עדות כלשהי להחדרה 9,16.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של CRISPR-EZ. מבט כולל גרפי על זרימת העבודה. לאחר ביצוע אסטרטגיה ועיצוב, ניתן ליצור ולבדוק עוברים ערוכים תוך כשבוע. נתון זה שונה באישור Modzelewski et al.9. וכן חן ואח' 16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תזמון אידיאלי לביצוע ההליך. התרשים מציג תכונות ונקודות זמן רלוונטיות במהלך החלוקה התאית הראשונה לאחר ההפריה. כדי ליישם גישה זו, החוקרים מקבלים כמה רמזים גלויים, כגון שינויים מורפולוגיים, הערכות זמן מחזור התא, וסמנים כימיים שנצפו לעתים קרובות לפני המחשוף הראשון. מכיוון שהעיתוי המדויק של ההזרעה וההפריה אינו ידוע, המלצה הגיונית תהיה להתייחס לשעה 0 כחצות. לפני שהזיגוטה נכנסת שלב S הוא הרגע האידיאלי לספק מכונות עריכה עבור NHEJ או HDR, אשר מתורגם לביצוע פרוטוקול זה בין השעות 7 בבוקר ל 11 בבוקר. נתון זה שונה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הצלחת אסטרטגיות עריכה. אסטרטגיות פשוטות כגון sgRNA יחיד גורמות ל-in/del באמצעות תיקון NHEJ או מוטציה מדויקת בשילוב עם תבנית ssODN באמצעות HDR. תיקון NHEJ יכול לשמש גם למחיקות באמצעות sgRNA מרובים. באופן כללי, ככל שהאסטרטגיה פשוטה יותר, כך CRISPR-EZ יעיל יותר ללא אופטימיזציה נוספת. נתון זה שונה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: איתור האובידוקט והאמפולה. לאחר בידוד כירורגי של רקמות הרבייה, יש לאבטח את האזור על ידי הפעלת לחץ עדין על כרית השומן עם מלקחיים. כרית השומן היא אזור בטוח יחסית למניפולציה כדי לא לפגוע בשחלות/ביצית. יש להסיר את האזור בריבוע המקווקו ולהכניס אותו לטיפה של M2 לדיסקציה נוספת. דיאגרמת קריקטורה מציגה את אזור העניין עם המבנים האנטומיים הרלוונטיים מסומנים. נתון זה שונה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: עיבוד מוצע והגדרת לוחות תרבית. סכמות המציגות תצורות שונות של לוחות כדי לסייע לחוקרים בביצוע עיבוד עוברים ותרבית. (A) צלחת כביסה טיפוסית M2+BSA. (B) צלחת M2+היאלורונידאז להסרת תאי קומולוס. (C) צלחת תמיסת AT אופציונלית לדילול Zona. (D) צלחת KSOM+BSA לתרבית עוברים, עם שכבת שמן מינרלי הנחוצה לשמירה על pH, לחות וטמפרטורה. נתון זה שונה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: דוגמה לגנוטיפ עבור תוצאות NHEJ ו-HDR . (A) תרשים מצויר של האזור הסובב את הגן Tyr בגנום העכבר. להלן פרטים על הרצף הלא ערוך (WT) שבו נמצא אתר הגבלת HinfI טבעי, שנמצא בתוך אתר זיהוי היעד של sgRNA (טקסט אדום). להלן אחת מתוצאות אפשריות רבות לאחר מיקוד מוצלח של CRISPR/Cas9 שבו נוצר "in/del". קשה לחזות את טבעה המדויק של עריכה זו, אך קרוב לוודאי שהיא תשבש את אתר HinfI. בהמשך מופיע רצף אוליגו התורם המשנה שני זוגות בסיסים כדי להפוך את אתר HinfI לאתר זיהוי EcoRI. (B) תוצאות פולימורפיזם אורך מקטע הגבלה מייצג (RFLP) לאחר עריכה. מוצגות דוגמאות עריכה מסוג NHEJ (למעלה) ו- HDR (למטה). נתון זה שונה באישור Modzelewski et al.9. נתון זה שונה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: פנוטיפ וכדאיות של זיגוטות ועכברים ערוכים על ידי צור. טבלה זו הותאמה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: תוצאות ניסויי CRISPR-EZ ומחיקת מיקרו-הזרקות. טבלה זו הותאמה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 1: רשימת אוליגוס ו- ssODN תורם. טבלה זו הותאמה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: תבנית DNA עבור מערך תגובת sgRNA. טבלה זו הותאמה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 3: הגדרת תמלול חוץ גופי . טבלה זו שונתה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 4: הגדרת קומפלקס RNP ליצירת NHEJ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 5: הגדרת קומפלקס RNP ליצירת HDR. טבלה זו הותאמה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 6: הגדרת קומפלקס RNP למחיקה. טבלה זו שונתה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 7: הגדרת PCR גנוטיפית. טבלה זו שונתה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 8: הגדרת PCR גנוטיפית מקוננת. טבלה זו שונתה באישור Modzelewski et al.9. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 9: הגדרת תקציר הגבלת HinfI. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 10: הגדרת תקציר הגבלת EcoRi. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מוצגת כאן טכנולוגיה פשוטה ויעילה ביותר לעריכת גנום עכבר. אלקטרופורציה יכולה לשמש ליצירת עוברים שעברו שינוי תוך שבוע-שבועיים (איור 1) ויכולה לייצר עכברים ערוכים תוך 6 שבועות9. בהשוואה לפרוטוקולים מבוססי אלקטרופורציה שפותחו במקביל ומספקים RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32, השיטה כפי שתוארה כאן דומה מבחינה קונספטואלית ומציעה יעילות באותו טווח, עם הבדלים קלים בלבד בפיתוח מגיבים ופרמטרים. לכן, אנו מציעים לקוראים להשוות ולהנגיד על בסיס צרכים וגישה לציוד. כפי שהשם מרמז, פרוטוקול זה פותח מתוך מחשבה על "מעבדת העכבר הממוצעת", עם שיטות נפוצות בלבד (IVT, PCR, אלקטרופורזה בג'ל), ריאגנטים (עובר סטנדרטי ותרבית רקמות מתכלים), או ציוד (אלקטרופורטור וקוביות המשמשות בדרך כלל להעברת חיידקים), אשר ככל הנראה נגישים לרוב המעבדות המעוניינות ומסוגלות לאסוף עוברים (או על ידי פנייה חביבה למעבדות שכנות). חוקרים ברמת סטודנט לתואר שני עם מיומנויות בסיסיות לטיפול בעוברים יכולים לבדוק sgRNA ליעילות או לבצע ניסויים בהפקת נתונים מספר פעמים במסגרת הזמן של פיתוח טרום השרשה ללא צורך לתזמן עם מתקן הליבה. עם זאת, אם המטרה הרצויה היא ליצור מודלים של בעלי חיים ללא צורך במיקרו-הזרקה או מניפולציה עוברית, שיטות פחות פולשניות זמינות10,32.

גורמים רבים המשפיעים על יעילות Cas9 נחקרים באופן פעיל, כגון הספציפיות של מטרה גנומית, פרמטרים של רצף sgRNA, נגישות גנום וטופולוגיה, ובמיוחד, סוג התא. לכן, תכנון ובדיקה של sgRNA הוא קריטי להצלחה. פרוטוקול זה ושיטות אלקטרופורציה אחרות שפותחו באופן עצמאי עברו אופטימיזציה כדי לספק חלבון Cas9 / sgRNA RNPs במהירות ובאופן ארעי לעוברים בשלב הזיגוטה תוך שיפור היעילות תוך מזעור פסיפס עקב לידה בשלב התפתחותי מוקדם ומחצית החיים הקצרה של RNP 7,9,10,11,12,13,14,15, 16,33,34.

עבור אסטרטגיות עריכת הגנום הנפוצות ביותר וזנים שונים של עכברים, שיטה זו יכולה להשיג ביצועים טובים יותר ממיקרו-הזרקות במונחים של עלות, יעילות, החדרות קטנות, מוטציות in/del, מחיקות אקסון, החדרות ומוטציות נקודתיות9. עם הפרוטוקול הנוכחי, שיטה זו אידיאלית ליצירת מוטציות in/del ומחיקות עד 2.6 kb, שהוא הרבה יותר ארוך מהאורך הטיפוסי של אקסון מקודד חלבון של 170 bp35. מחיקות ארוכות פחות יעילות; עם זאת, מגבלה זו אינה ייחודית לפרוטוקול זה. לכן, ככל שהעריכה בתיווך Cas9 משתפרת ומפתחים גרסאות חדשות של חלבון Cas, האופי המודולרי של שיטה זו מאפשר שיפורים אלה כדי להגדיל ישירות את יכולות הפרוטוקול שלנו.

בעוד שיטה זו יכולה לבצע מגוון עריכות פשוטות, הפוטנציאל שלה לאסטרטגיות גדולות ומורכבות יותר, כגון הכנסת אללים מותנים או תגים פלואורסצנטיים, נבדק כעת במעבדה שלנו. ssODN ארוכים יותר יכולים לספק גישה מעשית לעריכת גנום מסובכת והראו הצלחה בעריכת עוברים מבוססת מיקרו-הזרקה36; עם זאת, ssODN ארוכים יותר הם יקרים לסנתז ועדיין לא נבדקו בהרחבה עם אלקטרופורציה37. השימוש בווירוסים הקשורים לאדנו (AAV) כדי להציג רצפי תורמים של עד 3.3 קילו-בתים הראה הצלחה גם כן, אך ייתכן שלא יהיה נגיש לרוב המעבדות25. לעת עתה, אנו ממליצים על עריכת גנום תאי גזע עובריים סטנדרטיים ומיקרו-הזרקה להנדסת גנום עכבר מורכבת.

הדאגות לגבי השפעות Cas9 מחוץ למטרה נותרו 8,38,39. וריאציות מהונדסות של Cas9 עשויות להגדיל את ספציפיות המטרה, אם כי זה לא נחקר במלואו במחקרי אלקטרופורציה של עוברי RNP. CRISPR-EZ יכולה להיות שיטה שימושית ליצירת מודלים של מוטציות מורכבות לחקר גנטיקה מורכבת. בעוד מיקרו-הזרקות הפכו עריכה בו זמנית של מספר מוקדים לאפשרית40, שיטות אלקטרופורציה כמו זו המתוארת כאן הופכות את זה לנוח ויעיל יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין הצהרות כספיות רלוונטיות של המחברים.

Acknowledgments

איי.ג'.אם יצר את הקונספט המקורי שהוביל לפיתוח CRISPR-EZ והפיק את הדמויות. סי.קיי.די ליקט והתאים את הפרוטוקולים הפנימיים והמפורסמים לכתב היד הנוכחי. A.J.M. נתמך על ידי NIH (R00HD096108).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  3. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  4. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
  5. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  6. Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
  7. Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  8. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  9. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  10. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  11. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
  12. Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
  13. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  14. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  15. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  16. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  17. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  18. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  19. Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
  20. Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
  21. Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
  22. Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
  23. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
  24. Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
  25. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  26. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  27. Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
  28. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  29. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  30. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
  31. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
  32. Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
  33. Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
  34. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
  35. Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
  36. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  37. Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
  38. Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
  39. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
  40. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 190
עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J.… More

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J. Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes. J. Vis. Exp. (190), e64302, doi:10.3791/64302 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter