Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

Burada, CRISPR RNP Zygotes Elektroporasyonu (CRISPR-EZ) adı verilen genetiği değiştirilmiş farelerin verimli bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış basit bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, elektroporasyon yoluyla düzenleme reaktiflerini embriyolara %100'e yaklaşan bir verimlilikle teslim eder. Bu protokol, memeli embriyolarındaki nokta mutasyonları, küçük genomik eklemeler ve delesyonlar için etkilidir.

Abstract

Olağanüstü verimlilik, doğruluk ve kolaylık ile CRISPR / Cas9 sistemi, hücre kültüründe ve laboratuar hayvanı deneylerinde genom düzenlemeyi önemli ölçüde geliştirdi. Hayvan modelleri üretilirken, zigotların elektroporasyonu, altın standart mikroenjeksiyon yöntemine alternatif olarak daha yüksek verimlilik, basitlik, maliyet ve verim sunar. Elektroporasyon aynı zamanda daha yumuşaktır, daha yüksek canlılığa sahiptir ve Cas9 / tek kılavuzlu RNA (sgRNA) ribonükleoproteinlerini (RNP'ler) % 100 teslimat verimliliğine yaklaşan yaygın laboratuvar fare suşlarının (örneğin, C57BL / 6J ve C57BL / 6N) zigotlarına güvenilir bir şekilde iletir. Bu teknik, LoxP veya FLAG, HA veya V5 gibi kısa etiketler eklemek için ekleme / delesyon (indels) mutasyonları, nokta mutasyonları, tüm genlerin veya ekzonların silinmesi ve 100-200 bp aralığında küçük eklemeler yapılmasını sağlar. Sürekli olarak geliştirilirken, burada CRISPR-EZ'nin mevcut durumunu, in vitro transkripsiyon, embriyo işleme, RNP montajı, elektroporasyon ve preimplantasyon embriyolarının genotiplemesi yoluyla sgRNA üretimini içeren bir protokolde sunuyoruz. Embriyoları manipüle etme konusunda minimum deneyime sahip yüksek lisans düzeyinde bir araştırmacı, bu protokolü kullanarak genetik olarak düzenlenmiş embriyoları 1 haftadan daha kısa sürede elde edebilir. Burada, fare embriyolarıyla kullanılabilecek basit, düşük maliyetli, verimli, yüksek kapasiteli bir yöntem sunuyoruz.

Introduction

Canlı farelerde genom düzenleme önemli ölçüde basitleştirilmiştir ve CRISPR düzenlemesinin ortaya çıkmasından bu yana erişilebilir ve daha uygun fiyatlı hale gelmiştir 1,2,3. İlk hayvan düzenleme girişimleri, CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA'yı pronükleer evre embriyolara 4,5,6 vermek için mikroenjeksiyon kullandı. Mikroenjeksiyon oldukça etkili olsa da, tam olarak ustalaşmak için gereken uygulama miktarı kursiyerler ve öğrenciler için uygun olmayabilir ve ayrıca mütevazı bir şekilde finanse edilen bir laboratuvarın karşılayamayacağı pahalı ekipman gerektirir. Mikroenjeksiyon normalde transgenik tesislerde uzman teknisyenler tarafından, birçok araştırmacı için hız sınırlayıcı olan programlar ve hizmet fiyatları ile gerçekleştirilir. Daha erişilebilir bir yaklaşım, CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA'nın pronükleer evre embriyolara verilmesi için oldukça etkili olduğu gösterilen elektroporasyondur7. CRISPR genom düzenleme ve dağıtım stratejilerindeki daha fazla gelişme, halihazırda sgRNA'larla meşgul olan önceden monte edilmiş RNP'lerin mozaikliği azaltmak için etkili bir araç olabileceğini düşündürmektedir8.

Bu protokolün geliştirilmesinin ve kullanılmasının ardındaki mantık, mikroenjeksiyonla ilişkili sınırlamaların ve engellerin çoğunu atlamaktı. Adından da anlaşılacağı gibi, test edilmemiş sgRNA tasarımlarının bir mikroenjeksiyon deneyi sırasında kullanılmaya değer olup olmayacağını hızlı bir şekilde belirleyebilecek kolay, şirket içi ve uygun maliyetli bir yöntem, çok uygun bir ilk geçiş kalite kontrol adımı olacaktır (Şekil 1). Bu yöntem, rekombinasyon tabanlı sonuçlar için uzun donör DNA dizileri tanıtmak gibi daha karmaşık stratejiler için mikroenjeksiyonun yerini alamazken, küçük silmeler veya eklemeler ve etiketleme genleri gibi daha az karmaşık stratejiler için idealdir. Bu yöntem, basit düzenleme ihtiyaçları olan, hipotezlerini preimplantasyon geliştirme süresi içinde test etmek isteyen veya bir mikroenjeksiyon uzmanıyla randevu almadan önce embriyolardaki sgRNA'ları test etmeyi tercih eden temel embriyo manipülasyon becerilerine sahip araştırmacılar için uygundur. Burada, düzenleme reaktifleri, mozaisizmi azaltırken verimliliği en üst düzeye çıkarmak için elektroporasyon (bir dizi elektrik darbesi) yoluyla Cas9 / sgRNA RNP'ler olarak pronükleer aşamadaki embriyolara geçici olarak verilir8. Bir embriyo genotipleme yöntemi kullanılarak, düzenleme sonuçları yaklaşık 1 hafta9'da elde edilebilir, böylece çeşitli mikroenjeksiyon uygulamalarına olan ihtiyaç önemli ölçüde azaltılmış bir maliyetle azalır.

Bu yöntemin etkinliği, embriyonun henüz anne ve baba pronükleisini kaynaştırmadığı veya S-fazına girmediği pronükleer embriyo aşamasında zirveye ulaşır (Şekil 2). Süperovülasyon, zigot sayısını en üst düzeye çıkarmak için kullanılır, ancak hem pronükleer zigotlar hem de döllenmemiş yumurtalar üretir. Sağlıklı zigotlar, genel verimliliği artırmak için elektroporasyondan önce önceden seçilebilir. Diğer elektroporasyon protokolleri, benzer bir adım 7,10,11,12,13,14,15'i eklemeye gerek kalmadan zigotları verimli bir şekilde düzenlediğinden, bu protokolün isteğe bağlı bir adımı, zona pellucida'nın (ZP) hafif erozyonudur. ZP, pronükleer evre embriyoları çevreleyen spermatozoa bağlanmasına, akrozom yanıtına ve döllenmeye yardımcı olan bir glikoprotein tabakasıdır. Deneyimlerimize göre, ZP'nin hafif asit bazlı erozyonunun, canlılık üzerinde sadece marjinal bir etki ile güvenilir Cas9 RNP elektroporasyon dağıtımı sağladığını gördük.

C57BL / 6J ve C57BL / 6N 9,16 gibi araştırmalarda yaygın olarak kullanılan fare suşlarında elektroporasyon yoluyla% 100'e varan RNP dağıtım oranlarını gözlemledik. Bağımsız gruplar ayrıca, mikroenjeksiyon 11,12,13,14,15,17'den daha büyük veya eşleşen verimliliklere sahip elektroporasyon tabanlı prosedürler geliştirmiştir; elektroporasyon protokolleri sıçan 18,19, domuz20,21,22 ve 23'te iyi çalışmaktadır. Bu nedenle, okuyucuların deney ve ekipman ihtiyaçlarına en uygun koşulları bulmak için protokolleri karşılaştırmalarını öneririz. Burada açıklanan sistem, sadece temel embriyo manipülasyon becerileri gerektiren ortak malzemeler ve ekipmanlar kullanmaktadır. Bu teknik, bir dizi düzenleme stratejisi için etkilidir ve bu yöntemi araştırma topluluğu için geniş çapta erişilebilir kılar.

İdeal küçük kılavuz RNA'ların (sgRNA'lar) tasarlanması, verimli düzenleme için çok önemlidir. Hedef bölge başına iki ila üç sgRNA stratejisinin doğrudan fare embriyolarında, özellikle fare çizgisi üretimi isteniyorsa taranmasını öneririz. Bir kez tasarlandıktan sonra, yüksek kaliteli sgRNA'lar üretmek için in vitro transkripsiyon (IVT) gibi klonlamasız yöntemler önerilir3. RNP'ler ve sgRNA'lar 30-50 işlenmiş pronükleer aşama embriyosu ile karıştırılır ve önce ZP'yi ve hücre zarını geçici olarak geçirgenleştirmek için bir dizi elektrik darbesine maruz bırakılır, ardından gözenekleri açık tutmak için darbeler ve zigot24 yoluyla RNP'leri elektroforez eder. Optimizasyondan sonra, dökme embriyolar için 30 V'ta altı adet 3 ms darbenin (~ 50) etkinlik ve canlılığı düzenlemek için en uygun olduğunu ve yüksek verimli Cas9 / sgRNA RNP dağıtımı 9,16,25 sağladığını bulduk. Tek tek fare morulasındaki düzenleme olayları, kısıtlama fragman uzunluğu polimorfizmi (RFLP), T7 endonükleaz sindirimi ve ilgilenilen bölgenin Sanger dizilimi gibi CRISPR düzenlemesi için yaygın olan çeşitli doğrulama stratejileri kullanılarak doğrulanabilir26.

Mevcut yöntem, ekleme/silme (indels), 500-2000 bp mertebesinde ekzon boyutlu silmeler ve nokta mutasyonlarının ve C- veya N-Terminal etiketleri (örneğin, FLAG, HA veya V5) gibi küçük eklemelerin teslimi gibi basit düzenleme şemaları (Şekil 3) için en uygun yöntemdir9,16,27. Büyük floresan etiketlerin veya koşullu alellerin eklenmesi gibi karmaşık genom düzenleme potansiyeli belirsizliğini korumaktadır ve yaklaşmakta olan gelişmelerin şu anki odak noktasıdır.

Bu yönteme kolayca hakim olunur ve kültürlenmiş fare embriyolarındaki sgRNA'ları 1 hafta9'da hızlı bir şekilde test etmek için kullanılabilir (Şekil 1). Bu çalışmada sunulan, 1) sgRNA tasarımını içeren altı adımlı bir protokoldür; 2) sgRNA sentezi; 3) süperovülasyon ve çiftleşme; 4) embriyo kültürü, toplanması ve işlenmesi; 5) RNP montajı ve elektroporasyon; 6) embriyo kültürü ve genotipleme. Kullanılan tüm malzemeler hakkında bilgi verilmektedir (Malzeme Tablosu). Pozitif bir kontrol olarak, Tyrosinase (Tyr) lokusu 9,16'yı düzenleyen reaktifler Ek Tablo 1'e dahil edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol boyunca tüm hayvan bakımı ve kullanımı, Hayvan Refahı Yasası politikalarına, ILAR Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na bağlı kalmış ve ötanazi için AVMA ve Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) kılavuz ve politikalarını izlemiştir. Hayvan bakımı ve kullanımı protokolü, bu proje için Pennsylvania Üniversitesi IACUC tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Uyum ve dikkat konusunda, lütfen bu protokolü denemeden önce gerekli tüm izinleri alın.

1. sgRNA ve isteğe bağlı donör oligo tasarımı

  1. sgRNA tasarımı
    1. CRISPR için Dizi Taraması (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 veya CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29 gibi yaygın olarak kullanılan çevrimiçi algoritmalardan aday sgRNA'ları seçin. Her platform benzersiz olduğundan, ideal sgRNA'ları tasarlamak için lütfen kullanıcı talimatlarını dikkatlice okuyun. In/del deneyleri için, test etmek üzere iki ila üç sgRNA seçin. Delesyonlar için, hedef bölgeyi çevreleyen sgRNA'lar, örneğin, hedefin yukarı yönünde iki sgRNA ve hedefin aşağı yönünde iki sgRNA önerilir.
      NOT: Çeşitli çevrimiçi sgRNA algoritmaları, hatalı sgRNA tasarımlarından kaçınmak için hedefler dışı faktörleri hesaba katarken, NCBI'nin BLAST aracı, seçilen sgRNA dizilerinin kalitesini doğrulamada yardımcı olur.
    2. Önceki adımdan (1.1.1) belirlenen 19-20 nükleotidi (nt) sgRNA oligosunun değişken bölgesine (Ek Tablo 1) yerleştirin ve sentezlenmiş sgRNA'yı özel DNA oligoları olarak satın alın.
      NOT: SAYFA saflaştırma gerekli değildir.
  2. (İsteğe bağlı) Homoloji odaklı onarım (HDR) aracılı knock-in için donör oligo tasarımı.
    1. İstenilen deneysel sonuca (hassas nokta mutasyonu, loxP yerleştirme, küçük etiket yerleştirme, vb.) dayanarak uygun tek sarmallı oligodeoksinükleotidi (ssODN) tasarlayın, toplam uzunluğu merkezi bölgeyi çevreleyen 50 nt veya daha fazla homoloji kolları ile 100-200 nt'ye kadar tutun.
    2. Daha yüksek zincirleme verimlilik sağlamak için, sgRNA'yı ssODN30'u tamamlayacak şekilde tasarlayın ve Cas9 enzimi tarafından tekrarlanan kesimi önlemek için protospacer bitişik motif (PAM) dizisini sessiz bir mutasyonla değiştirin.
    3. Özel oligo seçeneğini kullanarak ssODN sipariş edin.

2. sgRNA sentezi

  1. İn vitro transkripsiyon (IVT) için şablon oluşturma
    1. PCR yoluyla sgRNA IVT için DNA şablonunu oluşturmak için, RNAse içermeyen bir PCR şerit tüpünde bir IVT reaksiyonu hazırlayın. (bakınız Ek Tablo 2).
    2. Aşağıdaki termal döngü koşullarını kullanın:
      2 dakika boyunca 95 °C; 2 dakika boyunca 95 °C, 10 s için 57 °C ve 10 s için 72 °C'lik 30 döngü; daha sonra 2 dakika boyunca 72 °C
    3. SgRNA DNA şablonu PCR reaksiyonunun başarısını doğrulamak için, ürünün elektroforu% 2 (wt / vol) agaroz jeli üzerinde 1 μL 6x yükleme boyası ile birleştirilmiştir.
      NOT: Beklenen ürün boyutu 127 bp'dir. Kalan herhangi bir PCR reaksiyonu 5 aya kadar -20 ° C'de saklanabilir.
  2. SgRNA'nın in vitro transkripsiyonu (IVT)
    1. SgRNA'yı üretmek için, reaksiyon karışımını (üretici talimatlarına göre T7 IVT) bir PCR tüpünde hazırlayın ve reaktifleri karıştırmak için hafifçe vurun.
      NOT: Reaksiyon kurulumu örneği için Ek Tablo 3'e bakınız. IVT reaksiyonu RNaz kontaminasyonuna duyarlıdır; bu nedenle, RNase içermeyen bir ortam sağlamak için her türlü çabayı gösterin.
    2. Reaksiyonun başlamasına ve ilerlemesine izin vermek için, IVT reaksiyon karışımını bir termal döngü veya ısı bloğunda 37 ° C'de >18 saat boyunca inkübe edin.
    3. Orijinal DNA şablonunu bozmak için (adım 2.1.3), 1 μL DNaz I (reaksiyon başına 2 ünite) uygulayın ve reaksiyonu oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca inkübe edin.
    4. RNA'nın manyetik saflaştırma boncuklarına bağlanmasını teşvik etmek için, reaksiyonda 129 μL% 100 etanol birleştirin, bu şimdi 150 μL olacaktır.
    5. Depolama sırasında yerleşme eğiliminde olan arıtma boncuklarını yeniden askıya almak için, aliquot'u en az 10 s boyunca vorteksleyin.
    6. SgRNA'ları saflaştırmak için, IVT reaksiyonuna (adım 2.2.4) 100 μL yeniden askıya alınmış boncukları (adım 2.2.5) ekleyin ve 10x yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın.
    7. Bağlanmaya izin vermek için, karışımın RT'de 5 dakika dinlenmesine izin verin.
    8. SgRNA'yı dahil edilmemiş reaksiyon ürünlerinden izole etmek için, reaksiyonu RT'de 5 dakika boyunca manyetik standlara yerleştirin ve küçük bir pelet oluşana kadar bekleyin.
    9. SgRNA'ları yıkamak için, önce süpernatantı dikkatlice atın ve daha sonra peletten uzağa 200 μL% 80 etanol ekleyin.
      NOT: %80 (vol/vol) etanol yıkama adımı sırasında, pipetleme yoluyla peletin rahatsız edilmesini önlemek çok önemlidir, çünkü bu sgRNA konsantrasyonlarını önemli ölçüde azaltacaktır. Bunun yerine, pelet suya batırılmak üzere %80 etanolün hafifçe pipetlenmesini sağlayın ve hacmi bir pipetle nazikçe çıkarın.
    10. Önceki adımı tekrarlayın (adım 2.2.9) ve peleti en fazla 5-6 dakika boyunca hava ile kurutun, aksi takdirde sgRNA boncuklarla kalıcı olarak ilişkilendirilecektir.
    11. Pelet 10x'i pipetleyerek, 2 dakika boyunca (RT) inkübe ederek ve daha sonra boncukları şimdi saflaştırılmış sgRNA'dan ayırmak için manyetik standa geri yerleştirerek sgRNA'yı 20μL nükleaz içermeyen su ile süzün.
    12. sgRNA'nın kalitesini ve miktarını değerlendirmek için, spektrofotometre veya biyoanalizör gibi bir cihaz kullanın. Alternatif olarak,% 2'lik bir agaroz jeli üzerinde, adım 2.1.3'e benzer şekilde 2 μL sgRNA çalıştırın.
      NOT: Kalite tek bir şeffaf bant ile onaylanır. SgRNA'nın geri kalanı hemen kullanılabilir veya -80 °C koşullarında saklanabilir.

3. Süperovülasyon

  1. Her bir sgRNA tasarımını test etmek için yeterli embriyo sağlamak için, daha önce tarif edildiği gibi3-5 haftalık iki ila üç C57BL / 6J dişisini süperovüle edin 9. Etkinliği doğrulamak için yeterli sonuç üretmek için sgRNA başına 20-30 embriyonun elektroporasyonu önerilir.
    NOT: Döllenme başarılı olursa, çiftleşme başına 10-20 embriyo bekleyin.
  2. Yumurtlamayı indüklemek için, bu hormon enjeksiyon programını izleyin:
    1. 1. Gün: 3-5 haftalık dişi farelere 26 G'lık bir şırınga kullanılarak intraperitoneal (IP) enjeksiyon yoluyla 5 IU hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) (100 μL) uygulayın.
    2. 3. Gün: PMSG enjeksiyonunun 46-48 saatinden sonra, yumurtlamayı indüklemek için bir IP enjeksiyonundan 5 IU insan koryonik gonadotropin (hCG) (100 μL) enjekte edin.
    3. Üremeyi ayarlamak için, dişileri 1: 1'i, hCG enjeksiyonundan hemen sonra güvenilir bir üreme erkeği ile eşleştirin.
      NOT: Hormonların bozulmasını ve aktivitesini kaybetmesini önlemek için, 30 dakikalık çözülme süresinin altında enjeksiyonlar yapın.

4. Embriyo toplama ve işleme

  1. Embriyo toplama
    1. Kadınları ötenazi yapmak ve gerekli malzemeyi almak için, daha önce açıklandığı gibi31, önce kurumsal politikalara uygun olarak uygun yöntemi onayladığınızdan emin olun. Örneğin, CO2 boğulması, servikal çıkık ve / veya diğer onaylanmış yöntemleri kullanın.
      NOT: Normalde, hormonla uyarılan kadınların% >75'i, başarılı çiftleşmeyi gösteren çiftleşme tıkaçları gösterir.
    2. Kılların doku toplamayı zorlaştırmasını önlemek için, ötenazi yapılan dişileri sırtlarına yerleştirin ve cerrahi olarak açılacak karın bölgesine %70 (hacim/hacim) etanol püskürtün.
      NOT: Bu noktadan itibaren, aseptik bir ortamı korumak ve kontaminasyon potansiyelini azaltmak için cerrahi adımların ventilasyonlu bir davlumbazda yapılması tavsiye edilir.
    3. Karın boşluğunu açmak ve yumurtalıkları çıkarmak için, deri / saç (deri altı) tabakasını cerrahi makasla kesin ve böbreğin yakınında bulunan ve bir yağ yastığının bir bölümünü paylaşan yumurtalıkları (Şekil 4) bulun. Yumurtalıklar yumurtalıklara yakındadır (Şekil 4). Her iki yumurta kanalını da cerrahi olarak dişiden çıkarın ve bunları M2 + BSA (4 mg / mL BSA) ortamının bireysel 50 μL damlacıklarına yerleştirin (Şekil 5A).
      NOT: Prosedürün bu bölümü için ayrıntılı talimatlar görsel olarakgörüntülenebilir 31 veya daha önce yayınlanmış protokoller kullanılarak adımadım 9 izlenebilir.
    4. Oosit içeren kümülüs-oosit komplekslerini (CoC'ler) serbest bırakmak için (Şekil 4), bir stereomikroskoptan bakarken yumurta kanalının ampullasını nicklemek için diseksiyon forseps kullanın.
    5. Enkaz miktarını (kan, yağ, doku) azaltmak için, her bir CoC'yi, kalıntıların taşınmasını önlemek için 20-30 μL'ye ayarlanmış bir el tipi pipetle tek bir 50 μL M2 + BSA ortam damlacığına aktarın ve birleştirin.
  2. Kümülüs hücrelerinin çıkarılması
    1. Kümülüs hücrelerinin zigotlardan çıkarılmasına başlamak için (Şekil 4), CoC'leri mümkün olduğunca az ekstra medya ile 100 μL M2 + hyaluronidaz damlacığına aktarın (Şekil 5B) ve embriyolar çok daha küçük kümülüs hücrelerinden gözle görülür şekilde ayrılana kadar CoC'leri pipetleyerek hafifçe karıştırın. M2 + hyaluronidazın embriyolara maruz kalmasını minimumda tuttuğunuzdan emin olun, çünkü canlılığı etkileyebilir.
      NOT: Embriyolar 2 dakika içinde kümülüs hücrelerinden ayrılmıyorsa, önceden ısıtılabilir (37 ° C) veya ilave 50 μL M2 + hyaluronidaz eklenebilir.
    2. Hyaluronidazi seyreltmek ve gevşek kümülüs hücrelerini zigotlardan temizlemek için, zigotları taze bir 50 μL M2 + BSA damlacığına taşımak için ağızdan çalışan bir pipet kullanın.
      NOT: Bu noktanın ötesindeki adımların çoğu, aksi belirtilmedikçe ağızdan çalıştırılan bir pipet kullanılmasını gerektirir. Kullanıcıdan kaynaklanan kontaminasyon riski düşük olsa da, aseptik bir ortamı korumak için hat içi hava filtresinin kullanılması önerilir. Lütfen bu enstrümanı hazırlamak ve kullanmak için daha önce açıklanan yöntemlere bakın 9,31.
    3. Bir ağız pipeti kullanarak, kümülüs hücrelerinin sayısını azaltmak için embriyoları en az dört ila beş tane daha 50 μL M2 + BSA damlacıklarından geçirin.
  3. (İSTEĞE BAĞLI) Zona pellucida'nın asit tirot (AT) çözeltisi ile inceltilmesi.
    1. Embriyonun zona pellucida'sını aşındırmak ve reaktif dağıtımı için ek fiziksel engelleri azaltmak için, embriyoları 60 mm'lik bir plaka üzerinde önceden ısıtılmış (37 ° C) 100 μL AT çözeltisi damlacığına aktarın (Şekil 5C). Zona pellucida'nın yaklaşık% 30'u aşınana kadar bir stereomikroskop kullanarak zigotları sürekli gözlemleyin9. Toplam AT maruziyeti 60-90 s olmalıdır. AT'ye uzun süre maruz kalmak zona pellucida'yı tamamen çözebilir ve embriyo canlılığını tehlikeye atabilir.
      NOT: Prosedürün bu bölümünün ayrıntılı talimatları ve görüntüleri için lütfen daha önce yayınlanmış 9,16 yöntemlerine bakın.
    2. AT'yi seyreltmek için, embriyoları en az dört adet 50 μL M2 + BSA damlacığından geçirmek için bir ağız pipeti kullanın.
    3. Uygun sayıda embriyonun işlenip işlenmediğini belirlemek için, embriyoları saymak için bir stereomikroskop kullanın. Kullanılan dişi farelerin sayısına bağlı olarak, kadın başına yaklaşık 10-20 canlı zigot beklenebilir.
      NOT: Bu aşamada, embriyolar miktar ve kalitenin değerlendirilmesini engelleyecek döküntülerden nispeten arındırılmış olmalıdır. Örneğin, beş dişi kullanılıyorsa, beklenen zigot sayıları muhtemelen 50-100 arasında olacaktır ve embriyoları takip etmek için mekanik bir hücre sayacı uygun olacaktır. Döllenmemesi veya düşük kaliteli yumurtaların yumurtlaması nedeniyle embriyoların yaklaşık% 10-20'sini kaybetmek yaygındır. Bir sonraki adımda, embriyoları bir inkübatörde 30 dakikadan fazla olmamak üzere 50 μL M2 + BSA'da kısaca saklayın.

5. RNP montajı ve elektroporasyon

  1. RNP montajı
    1. RNP kompleksini monte etmek için, RNP tamponunda istenen düzenleme stratejisine dayalı uygun reaksiyon karışımlarını birleştirmek üzere ekli örnek tabloları kullanın (nükleaz içermeyen suda 100 mM HEPES pH 7.5, 750 mM KCl, 5 mM MgCl 2, %50 gliserol ve 100 mM Tris (2-karboksiyetil) fosfin hidroklorür [TCEP])
      NOT: TCEP kullanışlı bir indirgeyici maddedir, ancak sulu çözeltilerde kısa bir yarı ömre sahiptir; bu nedenle, TCEP'yi RNP karmaşık montajından hemen önce ekleyin.
      1. Homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) aracılı indeller için, Ek Tablo 4'e bakınız.
      2. Homoloji yönelimli onarım (HDR) aracılı düzenleme için, Ek Tablo 5'e bakın.
      3. Eşleştirilmiş sgRNA'lar kullanılarak yapılan mühendislik delesyonları için, Ek Tablo 6'ya bakınız.
        1. Stratejiden bağımsız olarak, RT'de istenen reaktifleri bir PCR tüpünde birleştirin.
        2. RNP kompleks oluşumuna izin vermek için, karışımı 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
          NOT: RNP kompleksi RT'de 1 saate kadar saklanabilir.
  2. Elektroporasyon
    1. BSA'yı elektroporasyondan önce seyreltmek için, embriyoları 50 μL indirgenmiş serum ortamının en az iki damlacığından geçirin.
      NOT: BSA, elektroporasyon sırasında direnci arttırır ve zigotlara zarar verebilir.
    2. Zigotları (adım 4.3.2) elektroporasyon için RNP kompleksi (adım 5.1.1.2) ile hazırlamak ve karıştırmak için, ağız pipeti 25-30 embriyoyu 10 μL'lik bir azaltılmış serum ortamı damlacığına karıştırın ve ardından RNP kompleksinin 10 μL'sini eklemek için bir el pipeti kullanın (adım 5.1.1.2).
    3. Viskoz gliserolü RNP kompleksinden seyreltmek ve numuneyi homojenize etmek için, 10x pipetleyerek, veya karışım artık bir stereomikroskop kullanarak viskozite belirtileri (girdap paterni) göstermeyene kadar karıştırın.
    4. Numuneyi elektroporatöre yerleştirilmeye hazırlamak için, bu 20 μL embriyo + RNP karışımını kabarcıklardan kaçınırken 0,1 cm'lik bir elektroporasyon küvetine pipetleyin.
    5. Düzenleme reaktiflerini zigot içine iletmek için, embriyoları şu koşullarla bir kare dalga protokolü kullanarak elektroporatın: 30 V, 4-6 darbe, 3 ms darbe uzunluğu ve 100 darbe aralığı.
    6. Küvetten zigotları almak için, dibe yerleşmiş olabilecek embriyoları yıkamak için küvetin üstüne 50 μL KSOM + BSA (1mg / mL BSA) vermek üzere bir el pipeti kullanın. Bu karışımı nazikçe dışarı ve 60 mm'lik bir plakaya pipetleyin.
    7. Adım 5.2.6'yı en az 2x-3x tekrarlayın ve çoğu embriyo kurtarılana kadar her bir yıkamayı 60 mm'lik bir plaka üzerinde birleştirin.
      NOT: Tipik bir iyileşme, orijinal olarak yüklenen embriyoların% >90'ıdır. Embriyonun hayatta kalmasını sağlamak için, inkübatörü test edin ve tüm reaktiflerin son kullanma tarihlerini kontrol edin. Embriyolar sıcaklık, CO2 seviyesi, nem ve pH gibi ideal olmayan kültür koşullarına karşı hassastır.

6. Embriyo kültürü ve genotipleme

  1. Embriyo kültürü
    1. Zigotları istenen bir aşamaya kadar kültürlemek için, 20-30 zigotu önceden dengelenmiş bir kültür plakasında bir KSOM + BSA damlacığına aktarmak için bir ağız pipeti kullanın ve embriyoları damlacığa taşıyın (Şekil 5D). Plakayı gece boyunca %5 CO2'de, 37 °C'de %95 nemle inkübe edin.
      NOT: Hazırlanan 35 mm'lik bir kültür plakasını, inkübasyondan bir gün önce veya en az 4 saat önce bir inkübatöre yerleştirerek ön dengeleyin (Şekil 5D).
    2. İdeal büyüme koşullarını teşvik etmek için, ertesi gün sadece iki hücreli embriyoları bir stereomikroskop kullanarak taze bir KSOM + BSA karışımı damlacığına aktarın ve inkübatöre geri dönün. Ölü veya döllenmemiş embriyoları bıraktığınızdan veya attığınızdan emin olun.
      NOT: Pronükleer evre embriyolar tipik olarak 72 saatlik kültürden sonra morulalara ve 84 saat sonra blastosistlere dönüşür.
  2. Genotipleme
    1. Bir PCR reaksiyonuna müdahale edebilecek ortamın bileşenlerini seyreltmek için, morula / blastosist embriyolarını iki damla DPBS'den geçirerek bir ağız pipeti kullanarak yıkayın.
    2. Tek embriyoları lizis için yüklemek için, bir pipeti 1 μL'ye ayarlayarak tek tek embriyoları 8 kuyucuklu bir PCR şeridinin bir kuyucuğuna aktarın ve ardından 10 μL lizis tamponu ekleyin (nükleaz içermeyen H 2'de 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8.5, 2.5 mM MgCl2, 0.1 mg / mL jelatin,% 0.45 Nonidet P-40,% 0.45 Ara 20,0.2mg / mL proteinaz K).
      NOT: Lizis tamponunu hazırlamadan hemen önce proteinaz K ekleyin.
    3. Embriyoları lize etmek için, bir termal döngücüyü 4 saat boyunca 55 ° C'ye programlayın ve ardından proteinaz K'yı 95 ° C'de 10 dakikalık bir inkübasyonla inaktive edin.
      NOT: Özellikle ilk kez kullananlar için, Tyr loci'de bir düzenleme denemesi yapmayı deneyin. Bu iş akışı optimize edilmiştir ve olumlu bir kontrol görevi görebilir. Gerekirse, embriyo lizatlarını 2-3 gün boyunca 4 ° C'de veya PCR analizinden önce 2 haftaya kadar dondurucuda saklayın. Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önleyin.
    4. Başarılı genotipleme analizi şansını artırmak için, hedeflenen bölgeyi çevreleyen biraz daha uzun DNA parçalarını ve daha kesin bir DNA parçasını yükseltmek için kullanılacak bölgeleri güçlendirerek iç içe geçmiş bir PCR stratejisi uygulayın. Ek Tablo 7'deki koşulları izleyin.
    5. Aşağıda belirtilen termal bisikletçi koşullarını takip edin:
      2 dk için 95 °C
      30+ devir: 2 dakika için 95 °C, 10 s için 60 °C ve 10 s için 72 °C
      2 dk için 72 °C
    6. İç içe geçmiş bir PCR stratejisinin ikinci aşamasını hazırlamak için, ilk PCR ürününün 1:10 seyreltilmesini yapın (adım 6.2.5) ve bunun 2 μL'sini bir sonraki PCR reaksiyonuna yükleyin (primerler önceki amplikonun içinde olacak şekilde tasarlanmıştır).
      NOT: İkinci PCR reaksiyonunda yandaki primerlerin taşınmasını azaltmak için ilk PCR reaksiyonu seyreltilmelidir. İç içe geçmiş PCR'yi Ek Tablo 8'deki adımları izleyerek hazırlayın.
    7. PCR reaksiyonunu aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak bir termal bisikletçiye yerleştirin:
      2 dk için 95 °C
      30 devir: 2 dakika için 95 °C, 10 s için 60 °C ve 10 s için 72 °C
      2 dk için 72 °C
      NOT: Normalde, PCR reaksiyonlarının% >90'ı, amplikon boyutu 500 bp veya daha az olduğunda başarılı olur.
    8. (İsteğe bağlı kontrol) Tyr'ı pozitif bir kontrol olarak kullanan NHEJ aracılı in/del mutasyonları için, 20 μL reaksiyonda 10 U HinfI kullanarak 4 saat boyunca 37 °C'de inkübe ederek iç içe geçmiş PCR ürünlerinin 10 μL'sini adım 6.2.7'den sindirin (bakınız Ek Tablo 9). % 2'lik bir agaroz jelinde, düzenlemeyi değerlendirmek için sindirilmiş ürünü çalıştırın ve sindirilmemiş bir PCR ürününü yükleme kontrolü olarak kullanın. Jeli 30 dakika boyunca 135 V'ta çalıştırın.
      NOT: HinfI'nin uygun bir kısıtlama enzimi olarak kullanılması, başarılı bir NHEJ düzenlemesi üzerine ablatlanacağı tahmin edilen sgRNA hedef bölgesinde bulunan uygun konumdaki bir HinfI bölgesi nedeniyle seçilmiştir. Ayrıntılı bir yöntem ve sonuçlar daha önce açıklanmıştır 9,16.
    9. (İsteğe bağlı kontrol) Tyr'ı pozitif kontrol olarak kullanan HDR aracılı mutasyonlar için, iç içe geçmiş PCR ürünlerinin 10 μL'sini, 20 μL'lik bir reaksiyonda 10 U EcoRI kullanarak 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe ederek adım 6.2.7'den itibaren sindirin (Ek Tablo 10'a bakınız). % 2'lik bir agaroz jelinde, düzenlemeyi değerlendirmek için sindirilmiş ürünü çalıştırın ve sindirilmemiş bir PCR ürününü yükleme kontrolü olarak kullanın. Jeli 30 dakika boyunca 135 V'ta çalıştırın.
      NOT: EcoRI'nın tanısal bir kısıtlama enzimi olarak seçilmesi, sgRNA hedef bölgesinde bulunan orijinal diziden yararlanır; burada başarılı HDR üzerine, doğal olarak oluşan HinfI bölgesi bir EcoRI bölgesi ile değiştirilir ve Tyr genine müdahale eden bir çerçeve kaydırma mutasyonu zorlanır. HDR analizi için, her iki sonuç da ortaya çıkabileceğinden ve mozaikliğin belirlenmesine yardımcı olabileceğinden, her numunede hem NHEJ (adım 6.2.8) hem de HDR (adım 6.2.9) analizleri gerçekleştirin. Ayrıntılı bir yöntem ve sonuçlar daha önce açıklanmıştır 9,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yöntem, verimli Cas9 / sgRNA RNP montajı için 100 μg'dan fazla sgRNA (>6.000 ng / L konsantrasyonunda 20 μL) üretir. Burada açıklanan rutin süperovülasyon yöntemi tipik olarak tıkanmış dişi başına 10-20 canlı embriyo üretir. Taşıma hataları ve embriyo manipülasyonu ile ilişkili tipik kayıplar nedeniyle, embriyoların beklenen %80'i elektroporasyondan sonra döllenmiş, canlı ve mükemmel durumdadır. Araştırmacıların başarılı bir deney yürütmelerine yardımcı olmak için, fare Tyr lokusunu pozitif bir kontrol olarak hedeflemek için oligo tasarımları (Şekil 6A, Ek Tablo 1) ve hem NHEJ hem de HDR olayları için genotipleme stratejileri (Şekil 6B) (adım 6.2) dahil olmak üzere örnek bir strateji sağladık. Deneysel başarı ve sonuçların ayrıntılı örnekleri mevcuttur 9,16.

Bu protokolü mikroenjeksiyonla karşılaştırmak için daha önceki bir çabada, toplu olarak, fare modelleri oluşturmak için yedi ayrı laboratuvarı içeren 30'dan fazla farklı düzenleme girişiminin hepsi başarılıoldu 9,16. Ek olarak, bu yöntem memeli gelişiminde ilk temel retrotranspozonu araştırmak ve raporlamak için kullanılmıştır27. Tek bir sgRNA vermek gibi basit bir strateji kullanıldığında, RNP'lerin dağıtımı C57BL / 6J ve C57BL / 6N fare suşlarında% 100'e kadar ve dahil olmak üzere,% 50-100'de meydana gelen in/del oluşumu ve% 14-63% 9,16 arasında değişen küçük oligo bazlı değiştirmeler ile (Tablo 1) idi. Genomik delesyonları tasarlarken, düzenleme etkinliği% 3 ila% 100 arasında değişebilir, burada katkıda bulunan faktörler genomik konum, sgRNA tasarımı ve silme boyutunu içerir (Tablo 2). Örneğin, 1.000 bp'den küçük silmeler, 1.000 bp 9,16'dan büyük olanlardan daha başarılıdır.

Elektroporasyon için 60 embriyo kullanıldığında, bu protokol düzenleme etkinliği açısından mikroenjeksiyonu aşar ve mikroenjeksiyon9'dan bir kurucuya kıyasla 3-4 kurucu hayvanla sonuçlanır. Aynı sgRNA'yı kullanan C57BL / 6N fare suşunda gen nakavt deneyleri için, bu yöntem mikroenjeksiyondan daha iyi performans gösterdi ve ortalama dört kurucu hayvan9 verdi (Tablo 2). V5 veya HA etiketleme gibi küçük eklemeler için, 162 nt'ye kadar olan ssODN'ler başarıyla test edilmiştir ve çabalar şu anda 1000-2000 nt'ye kadar ölçeklendirmeyi amaçlamaktadır. Bu deneylerin başarısı büyük ölçüde HDR sonuçlarının sağlam olması için kullanılan sgRNA'nın etkinliğine bağlıdır. Neredeyse tüm HDR sonuçları mozaiktir, ancak embriyoların% 31 ila% 64'ü arasındabazı yerleştirme kanıtları 9,16 gösterir.

Figure 1
Resim 1: CRISPR-EZ'ye genel bakış. İş akışına grafiksel bir genel bakış. Bir strateji ve tasarım yapıldıktan sonra, düzenlenmiş embriyolar yaklaşık 1 hafta içinde üretilebilir ve test edilebilir. Bu rakam Modzelewski ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. ve Chen ve ark.16. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Prosedürü gerçekleştirmek için ideal zamanlama. Diyagram, döllenmeden sonraki ilk hücresel bölünme sırasında ilgili özellikleri ve zaman noktalarını göstermektedir. Bu yaklaşımı gerçekleştirmek için, araştırmacılara morfolojik değişiklikler, hücre döngüsü süresi tahminleri ve ilk bölünmeden önce sıklıkla gözlenen kimyasal belirteçler gibi bazı görünür ipuçları verilmiştir. Döllenme ve döllenmenin kesin zamanlaması bilinmediğinden, mantıklı bir öneri 0 saatini gece yarısı olarak kabul etmek olacaktır. Zigot S-fazına girmeden önce, NHEJ veya HDR için düzenleme makineleri sunmak için ideal bir andır, bu da bu protokolün sabah 7 ile 11 saatleri arasında yürütülmesi anlamına gelir. Bu rakam Modzelewski ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Düzenleme stratejilerinin başarısı. Tek bir sgRNA gibi basit stratejiler, HDR üzerinden bir ssODN şablonuyla birleştirildiğinde NHEJ onarımı veya hassas bir mutasyon yoluyla bir in/del ile sonuçlanır. NHEJ onarımı, çoklu sgRNA'lar kullanılarak delesyonlar için de kullanılabilir. Genel olarak, strateji ne kadar basit olursa, CRISPR-EZ daha fazla optimizasyon olmadan o kadar etkili olur. Bu rakam Modzelewski ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Resim 4: Yumurta kanalının ve ampullanın yerleştirilmesi. Üreme dokuları cerrahi olarak izole edildikten sonra, forseps ile yağ yastığına hafif basınç uygulayarak bölge sabitlenmelidir. Yağ yastığı, yumurtalıklara / yumurta kanalına zarar vermemek için manipüle etmek için nispeten güvenli bir bölgedir. Kesikli karedeki alan çıkarılmalı ve daha fazla diseksiyon için bir M2 damlacığına yerleştirilmelidir. Bir karikatür diyagramı, ilgili anatomik yapıların etiketlendiği ilgi alanını gösterir. Bu rakam Modzelewski ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Önerilen işleme ve kültür plakası kurulumu. Araştırmacıların hem embriyo işleme hem de kültür yürütmelerine yardımcı olmak için çeşitli plaka kurulumlarını gösteren şemalar. (A) Tipik M2+BSA yıkama plakası. (B) Kümülüs hücresinin çıkarılması için M2 + hyaluronidaz plakası. (C) Zona inceltme için isteğe bağlı AT çözelti plakası. (D) Embriyo kültürü için KSOM+BSA plakası, pH, nem ve sıcaklığın korunması için gerekli mineral yağ kaplaması ile. Bu rakam Modzelewski ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: NHEJ ve HDR sonuçları için genotipleme örneği . (A) Fare genomundaki Tyr genini çevreleyen bölgenin karikatür diyagramı. Aşağıda, sgRNA'nın (kırmızı metin) hedef tanıma bölgesi içinde yer alan, doğal olarak oluşan bir HinfI kısıtlama bölgesinin bulunduğu düzenlenmemiş (WT) dizinin ayrıntıları verilmiştir. Bunun altında, bir "in/del" in oluşturulduğu başarılı CRISPR / Cas9 hedeflemesinden sonra birçok olası sonuçtan biri bulunmaktadır. Bu düzenlemenin tam doğasını tahmin etmek zordur, ancak neredeyse kesinlikle HinfI sitesini bozacaktır. Aşağıda, HinfI bölgesini bir EcoRI tanıma bölgesine dönüştürmek için iki baz çiftini değiştiren donör oligo dizisi bulunmaktadır. (B) Düzenlemeden sonra temsili kısıtlama parça uzunluğu polimorfizmi (RFLP) sonuçları. NHEJ (üstte) ve HDR (altta) düzenleme örnekleri gösterilmiştir. Bu rakam Modzelewski ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu rakam Modzelewski ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Tyr tarafından düzenlenmiş zigotların ve farelerin fenotipi ve yaşayabilirliği. Bu tablo Modzelewski ve ark.9'un izniyle uyarlanmıştır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: CRISPR-EZ ve mikroenjeksiyon delesyon deneylerinin sonuçları. Bu tablo Modzelewski ve ark.9'un izniyle uyarlanmıştır. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 1: Oligoların ve donör ssODN'nin listesi. Bu tablo Modzelewski ve ark.9'un izniyle uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 2: sgRNA reaksiyon kurulumu için DNA şablonu. Bu tablo Modzelewski ve ark.9'un izniyle uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 3: In vitro transkripsiyon kurulumu. Bu tablo Modzelewski ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 4: NHEJ oluşumu için RNP karmaşık kurulumu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 5: HDR oluşumu için RNP karmaşık kurulumu. Bu tablo Modzelewski ve ark.9'un izniyle uyarlanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 6: Silme için RNP karmaşık kurulumu. Bu tablo Modzelewski ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 7: Genotipleme PCR kurulumu. Bu tablo Modzelewski ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 8: İç içe genotipleme PCR kurulumu. Bu tablo Modzelewski ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 9: HinfI kısıtlaması özet kurulumu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 10: EcoRi kısıtlama özeti kurulumu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada basit ve son derece verimli bir fare genomu düzenleme teknolojisi sunulmaktadır. Elektroporasyon, 1-2 hafta içinde modifiye embriyolar üretmek için kullanılabilir (Şekil 1) ve 6 hafta içinde düzenlenmiş fareler üretebilir9. RNP'leri 7,10,11,12,13,14,15,17,32 sağlayan eşzamanlı olarak geliştirilmiş elektroporasyon tabanlı protokollerle karşılaştırıldığında, burada açıklanan yöntem kavramsal olarak benzerdir ve reaktif geliştirme ve parametrelerinde sadece küçük farklılıklarla aynı aralıkta verimlilik sunar. Bu nedenle, okuyucuların ihtiyaçlara ve ekipmana erişime göre karşılaştırmasını ve kontrast oluşturmasını öneririz. Adından da anlaşılacağı gibi, bu protokol "ortalama fare laboratuvarı" göz önünde bulundurularak, yalnızca yaygın yöntemler (IVT, PCR, jel elektroforezi), reaktifler (standart embriyo ve doku kültürü sarf malzemesi) veya ekipman (bakteriyel transfeksiyon için yaygın olarak kullanılan elektroporatör ve küvetler) ile geliştirilmiştir. Temel embriyo işleme becerilerine sahip lisansüstü öğrenci seviyesindeki araştırmacılar, sgRNA'ları verimlilik açısından test edebilir veya çekirdek bir tesisle zamanlamaya gerek kalmadan preimplantasyon geliştirme süresi içinde birçok kez veri üreten deneyler yapabilir. Bununla birlikte, istenen amaç mikroenjeksiyon veya embriyo manipülasyonuna gerek kalmadan hayvan modelleri üretmekse, daha az müdahaleci yöntemler mevcuttur10,32.

Cas9 verimliliğini etkileyen genomik hedefin özgüllüğü, sgRNA dizi parametreleri, genom erişilebilirliği ve topolojisi ve özellikle hücre tipi gibi birçok faktör aktif olarak araştırılmaktadır. Bu nedenle, sgRNA'ların tasarlanması ve test edilmesi başarı için çok önemlidir. Bu protokol ve bağımsız olarak geliştirilen diğer elektroporasyon yöntemleri, Cas9 proteini / sgRNA RNP'lerini zigot evreli embriyolara hızlı ve geçici olarak iletmek için optimize edilmiş, erken gelişim aşamasında doğum ve RNP'nin kısa yarı ömrü nedeniyle mozaikliği en aza indirirken verimliliği arttırmıştır 7,9,10,11,12,13,14,15, 16,33,34.

En yaygın genom düzenleme stratejileri ve çeşitli fare suşları için, bu yöntem maliyet, verimlilik, küçük eklemeler, in / del mutasyonları, ekzon delesyonları, eklemeler ve nokta mutasyonları açısından mikroenjeksiyonlardan daha iyi performans gösterebilir9. Mevcut protokolle, bu yöntem, 170 bp35'lik bir protein kodlayan ekzonun tipik uzunluğundan çok daha uzun olan 2.6 kb'ye kadar in/del mutasyonların ve delesyonların oluşturulması için idealdir. Uzun silme işlemleri daha az verimlidir; ancak, bu sınırlama bu protokole özgü değildir. Bu nedenle, Cas9 aracılı düzenleme iyileştirildikçe ve yeni Cas protein varyantları geliştirildikçe, bu yöntemin modüler doğası, bu iyileştirmelerin protokolümüzün yeteneklerini doğrudan artırmasına izin verir.

Bu yöntem çeşitli basit düzenlemeler yapabilse de, koşullu aleller veya floresan etiketler eklemek gibi daha büyük ve daha karmaşık stratejiler için potansiyeli şu anda laboratuvarımızda test edilmektedir. Daha uzun ssODN'ler karmaşık genom düzenleme için uygulanabilir bir yaklaşım sağlayabilir ve mikroenjeksiyon tabanlı embriyo düzenlemede başarı göstermiştir36; Bununla birlikte, daha uzun ssODN'lerin sentezlenmesi pahalıdır ve elektroporasyon37 ile henüz kapsamlı bir şekilde test edilmemiştir. 3.3 kb'ye kadar donör sekanslarını tanıtmak için adeno ilişkili virüslerin (AAV) kullanımı da başarı göstermiştir, ancak çoğu laboratuvar tarafından erişilemeyebilir25. Şimdilik, karmaşık fare genomu mühendisliği için standart embriyonik kök hücre genom düzenleme ve mikroenjeksiyon öneriyoruz.

Cas9'un hedef dışı etkileriyle ilgili endişeler 8,38,39 olmaya devam ediyor. Mühendislik Cas9 varyasyonları hedef özgüllüğünü artırabilir, ancak bu RNP embriyo elektroporasyon çalışmalarında tam olarak araştırılmamıştır. CRISPR-EZ, karmaşık genetiği keşfetmek için bileşik mutasyon modelleri oluşturmak için yararlı bir yöntem olabilir. Mikroenjeksiyonlar aynı anda birden fazla lokusun düzenlenmesini mümkünkılarken, burada tarif edilene benzer elektroporasyon yöntemleri bunu daha uygun ve etkili hale getirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar tarafından ilgili herhangi bir mali beyanname bulunmamaktadır.

Acknowledgments

A.J.M., CRISPR-EZ'in geliştirilmesine yol açan orijinal konsepti yarattı ve figürleri üretti. C.K.D. bu güncel makale için dahili ve yayınlanmış protokolleri derlemiş ve uyarlamıştır. A.J.M. NIH (R00HD096108) tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  3. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  4. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
  5. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  6. Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
  7. Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  8. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  9. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  10. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  11. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
  12. Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
  13. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  14. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  15. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  16. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  17. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  18. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  19. Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
  20. Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
  21. Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
  22. Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
  23. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
  24. Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
  25. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  26. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  27. Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
  28. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  29. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  30. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
  31. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
  32. Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
  33. Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
  34. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
  35. Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
  36. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  37. Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
  38. Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
  39. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
  40. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).

Tags

Gelişim Biyolojisi Sayı 190
Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J.… More

Diallo, C. K., Modzelewski, A. J. Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes. J. Vis. Exp. (190), e64302, doi:10.3791/64302 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter