Summary
골반 장기 탈출증은 전 세계 수백만 명의 여성에게 영향을 미치지만 일부 일반적인 외과 적 개입은 실패율이 40 %에 이릅니다. 이 상태를 조사하기 위한 표준 동물 모델의 부족은 진행을 방해합니다. 우리는 uterosacral ligament suspension 및 in vivo tensile testing의 모델로 다음 프로토콜을 제안합니다.
Abstract
골반 장기 탈출증(POP)은 여성의 삶의 질에 상당한 영향을 미칠 가능성이 있는 일반적인 골반저 장애(PFD)입니다. 미국에서 약 10%-20%의 여성이 탈출증을 치료하기 위해 골반저 수리 수술을 받습니다. PFD 사례는 미국에서만 연간 총 263억 달러의 비용을 초래합니다. 이 다인성 상태는 삶의 질에 부정적인 영향을 미치지만 치료 옵션은 최근에 줄어들었습니다. 한 가지 일반적인 수술 옵션은 자궁천골 인대 서스펜션(uterosacral ligament suspension, USLS)으로, 일반적으로 골반의 자궁천골 인대에 질 금고를 부착하여 시행됩니다. 이 수리는 메쉬 확대술에 비해 합병증 발생률이 낮지만 최대 40%의 비교적 높은 실패율이 특징입니다. 골반저 기능 장애를 연구하기 위한 표준 동물 모델의 부족을 고려할 때, 비용 효율적이고 접근 가능한 동물 모델 개발에 중점을 둔 이 분야의 혁신에 대한 시급한 임상적 요구가 있습니다. 이 원고에서, 우리는 완전한 자궁적출술 후 나머지 질 저장고를 자궁천골 인대에 고정하는 USLS의 쥐 모델을 설명합니다. 이 모델의 목표는 모델을 사용하여 인대 부착의 기계적 무결성을 개선하는 회복 전략을 조사할 수 있도록 여성에게 수행되는 절차를 모방하는 것입니다. 중요한 것은 외과적 개입 후 선택한 시점에서 계면 무결성을 특성화하기 위한 현장 인장 시험 절차의 개발도 설명한다는 것입니다. 전반적으로, 이 모델은 USLS를 통한 POP 복구를 위한 치료 옵션을 조사하는 향후 연구에 유용한 도구가 될 것입니다.
Introduction
골반 장기 탈출증(POP)은 전 세계 수백만 명의 여성에게 영향을 미치는 흔한 골반저 장애로, 특히1세부터 여성의 삶의 여러 측면에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 특히, 미국 여성의 약 13%가 탈출증 또는 요실금 수술을 받는다2. 임신과 출산 후 가장 흔한 상태인 탈출증은 골반 장기, 주로 질 및/또는 자궁의 다양한 구획이 복강의 정상 위치를 넘어서는 것이 특징입니다. 이것은 질 팽창 또는 압력, 장, 방광 및 성기능 장애의 성가신 증상과 전반적인 삶의 질 저하로 이어집니다. POP의 다른 위험 요소로는 비만, 흡연, 만성 기침, 변비등이 있다 3.
건강한 여성의 경우 골반저 장기는 거근, 자궁천골 인대(USL), 추기경 인대, 골반 측벽에 부착된 결합 조직 및 회음부의 원위 구조에 의해 지지됩니다 4,5. USL은 자궁과 질의 치근단 모두에서 가장 중요한 치근단 지지 구조 중 하나이며, 따라서 POP의 외과적 교정에 자주 사용됩니다(그림 1). USL의 구조적 지지는 천골 부위의 조밀한 콜라겐 결합 조직에서 비롯되며, 이 결합 조직은 밀집된 평활근으로 전환됩니다. 이러한 조성 구배로 인해, USL은 자궁 및 질 근육과 얽혀 골반 장기를 견고하게 지지한다 6,7. 자궁천추 인대 서스펜션(uterosacral ligament suspension, USLS)에서 USL은 자궁적출술 후 질 저장고에 고정되어 질과 주변 구조물을 복부 구획의 해부학적 위치로 복원합니다. 그러나, 경질 또는 복강경 경로와 상관없이, USLS 시술은 일부 연구에서 최대 40%의 비교적 높은 실패율로 어려움을 겪고 있다 8,9. USL과 같은 정점 구획 탈출증에 대한 수리 후 5년 후 성가신 질 팽창 증상의 재발률은 대규모 다기관 무작위 대조 시험에서 약 40%였다9. 같은 시험에서 5년 후 재발성 탈출증에 대한 재치료는 약 10%였다. 이 높은 실패율의 메커니즘은 연구되지 않았지만 질과 주변 구조를 해부학적 위치로 복원하려면 평활근 영역이 아닌 USL10,11의 조밀한 콜라겐 영역에 봉합사 배치가 필요합니다. 따라서 높은 실패율은 기본 자궁경부-USL 부착물에서 볼 수 있는 완전한 통합과 비교하여 외과적으로 형성된 질-USL 인터페이스의 기계적 및 구성적 불일치 때문일 수 있습니다.
이러한 질환 치료의 경제적 영향 또한 주목할 만한데, 미국에서는 외래 진료에 연간 약 3억 달러가 지출되고12, 수술 절차에 대한 직접 비용으로 연간 10억 달러 이상이 지출된다13. 이러한 상태를 치료하는 데 전념하는 막대한 경제적 자원에도 불구하고 많은 탈출증 수술로 인해 발생하는 합병증은 여전히 낙담합니다. 예를 들어, 천골질고정술(sacrocolpopexy)과 같은 폴리프로필렌 메쉬 기반 치근단 탈출증 복구는 천연 조직 복구에 비해 더 높은 성공률을 제공하지만14, 그물망 노출이나 침식과 같은 잠재적인 합병증을 희생시킨다. FDA는 2008 년과 2010 년 사이에만 메쉬 합병증과 관련된 거의 3,000 건의 불만을 접수했습니다. 이는 2019년 4월 FDA가 POP용으로 질식으로 배치된 모든 메쉬 제품의 제조 및 판매를 중단하라는 명령으로 절정에 달했습니다15. 따라서 폴리프로필렌 이외의 재료와 이를 테스트하는 모델에 대한 임상적 요구가 강하며, 이는 봉합사만 사용하는 기존 기술에 비해 천연 조직 탈출증 복구를 증가시키고 성공률을 높일 수 있습니다.
2019년 FDA 발표 이후, 대부분의 골반 외과 의사들은 탈출증 수리를 위해 질식으로 배치된 메쉬 사용을 중단했으며, 이에 따라 연구자들은 중간엽 기질 세포(MSC)9,20와 같은 천연 조직 복구를 보강하기 위한 새로운 조직 공학적 접근 방식을 모색하게 되었습니다 . 이러한 초점의 변화로 인해 신소재 개발을 지원할 수 있는 동물 모델의 개선이 시급합니다. 이 과정에서 과제는 임상적 관련성과 비용의 균형을 맞추는 것입니다. 이를 위해 골반 장기 탈출증을 연구하는 기초 과학 및 임상 연구자들은 지금까지 쥐, 생쥐, 토끼, 양, 돼지 및 비인간 영장류를 포함한 여러 동물 모델을 활용했습니다19. 최적의 동물 모델을 식별하는 과정은 다른 포유류 종에 비해 이족보행이고, 꼬리가 없으며, 외상성 출생 과정을 가지고 있기 때문에 도전적이다20. 돼지(Swine)21는 로봇 천골고정술(sacrocolpopexy)을 시뮬레이션하는 데 사용되었고, 양(sheep)은 질 탈출증 복구(22)를 시뮬레이션하는 데 사용되었다. 이러한 동물 모델은 임상적으로 관련이 있지만 비용 및 유지 관리로 인해 실현 가능성이 제한적입니다. 인간이 아닌 영장류는 탈출증의 발병 기전을 연구하는 데 사용되었습니다. 특히 다람쥐 원숭이는 인간을 제외하고 자발적인 탈출증이 발생할 수 있는 유일한 종 중 하나로, 가장 관련성이 높은 동물 모델 중 하나이다20. 인간이 아닌 영장류는 또한 천골질고정술(sacrocolpopexy)23 및 자궁 이식(uterine transplantation)24과 같은 부인과 수술 절차를 연구하는 데 사용되어 왔다. 양과 돼지의 경우와 마찬가지로, 탈출증의 동물 모델로서 인간이 아닌 영장류의 주요 한계는 유지, 관리 및 탑승 비용이다19.
설치류의 골반은 인간에 비해 훨씬 작은 두부 대 산도 크기 비율로 수평으로 배향되어 있지만19), 쥐는 인간 USL25에 비해 유사한 USL 해부학, 세포성, 조직학적 구조 및 기질 구성을 가지고 있기 때문에 USLS 수술에 대한 소동물 연구에 적합합니다. 또한 유지 보수 및 탑승 측면에서 유리합니다. 이러한 유익한 특성에도 불구하고, USLS 수리의 쥐 모델에 대한 발표된 보고서는 없습니다. 그러므로, 목표는 다태 Lewis 쥐에서 자궁적출술 및 USLS를 위한 프로토콜을 설명하는 것입니다. 이 프로토콜은 이 접근 가능한 동물 모델을 사용하여 POP의 병태생리학 및 외과적 구성 요소를 연구하는 것을 목표로 하는 연구자에게 유용할 것입니다.
그림 1: 골반 장기 탈출증. (A) 복강 내 장기의 정상적인 방향 및 (B) 탈출이 발생할 때 극적인 장기 하강. 자궁적출술 후 (C) 자궁천골 인대 현탁액은 질과 주변 구조를 적절한 해부학적 위치로 복원합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
모든 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 지침을 준수하고 시작하기 전에 모든 동물 절차에 대한 승인을 받으십시오. 무균 수술 기술에 대한 요구 사항은 가이드26 및 동물 복지 규정27에서 찾을 수 있습니다. 이 연구는 버지니아 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회 프로토콜 번호 4332-11-20에 의해 승인되었습니다. 여러 마리의 (두 마리의 깔짚) 암컷 육종가를 구하십시오. 쥐는 미국 실험 동물 관리 인증 협회(American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care)의 인증을 받은 동물 사육장에 쌍으로 수용되어야 하며 음식과 물이 임의로 제공되어야 합니다. 이 연구의 동물은 Charles River에서 얻은 Lewis 쥐였으며 두 마리의 새끼 요구 사항을 수용하기 위해 4 개월에서 6 개월 사이였습니다. 동물들은 12시간의 명암 주기로 유지되었다.
1. 자궁천골 인대 현탁액을 이용한 골반 장기 탈출증 복구
- 살아있는 동물 수술을 위한 장비 및 수술 부위 준비
- 멸균 방수 패드와 함께 재순환 온수 가열 패드를 사용하여 수술 보드가 37°C로 가열되도록 수술 부위를 준비합니다. 표백제가 없는 표면 소독제와 70% 에탄올 물티슈를 사용하여 수술 보드와 수술 부위의 무균 상태를 보장합니다.
- 오토클레이브 열 살균을 사용하여 수술 도구, 수술용 스폰지(거즈), 면봉 및 일회용 드레이프를 포함한 모든 오토클레이브 안전 용품을 멸균하십시오. 멸균 포장된 수술용 장갑을 구하십시오.
- 전기 가위, 안과용 연고, 에탄올 물티슈, 면봉, 요오드 용액, 멸균 포장된 메스 블레이드 및 봉합사를 구하여 작업대에 놓습니다.
- 살아있는 동물 수술을 위한 동물 준비
- 동물을 2% 이소플루란이 공급된 마취실에 조심스럽게 넣고 적절한 마취면에 도달한 후 동물의 무게를 잰다. 동물이 발가락 꼬집음에 반응하지 않을 때 적절한 마취가 확인됩니다.
- 2% 이소플루란이 공급되는 마취 원뿔에 코를 단단히 고정한 상태에서 엎드린 자세로 수술 보드에 동물을 놓습니다. 각 동물의 눈에 안과 용 연고를 바르십시오.
- 오피오이드 진통제 및 NSAID 진통제를 피하 투여합니다(재료 표).
- 그림 2와 같이 동물을 앙와위 자세로 놓고 xiphoid 과정에서 요도 구멍 (8cm x 4cm)까지 복부 털을 면도합니다. 절개 부위를 준비하기 위해 요오드와 알코올을 세 번 충전하여 복부를 소독하십시오.
알림: 면도로 인해 출혈이 발생하면 요오드와 알코올 준비 패드로 피부를 준비하기 전에 압력을 가하여 지혈하십시오. 피부에 요오드를 30 초 동안 유지하십시오. - 사용할 수 있는 수술 보조자가 없는 경우 멸균 면봉, 커튼, 스폰지(거즈), 수술용 칼날, 봉합사 및 수술용 마커(선택 사항)를 포함하여 멸균 용품 및 기구를 멸균 기구 트레이에 보관합니다. 수술 보조자를 사용할 수 있는 경우 이 단계를 생략할 수 있으며 보조자는 1.3.1단계에 따라 멸균 기구를 제공할 수 있습니다.
- 자궁적출술 및 자궁천골 인대 현탁액 (USLS)
- 수술 가운, 머리 덮개, 마스크 및 멸균 장갑을 착용하십시오. 무균 필드로 동물을 감싸고 복부 만 노출시킵니다.
- 메스 칼날을 사용하여 검상돌기 바로 아래에서 아래쪽 젖꼭지 라인까지 linea alba를 7cm 절개합니다. 절개는 요도 구멍에서 ~0.5-1.0cm 주둥이로 끝나야 합니다. 그런 다음 아래의 근육층을 통해 절개하십시오. 출혈을 예방하기 위해 복벽 혈관을 피하십시오.
- 복부 견인기를 조립하고 복강을 검사합니다(그림 3A). 홍채 집게를 사용하여 왼쪽 자궁 뿔을 부드럽게 찾습니다. 자궁은 장 깊숙이 있으며, 이는 종종 복강에 들어갈 때 처음 접하는 구조입니다. 먼저 난소(그림 3B)와 관련 난소 지방 패드를 식별하는 것이 좋습니다.
- 집게 또는 모기 클램프로 왼쪽 자궁 뿔을 부드럽게 들어 올리고 모기 클램프를 사용하여 난소와 난관 아래에 뿔을 결찰하여 자궁 적출술을 시작합니다. 난소는 섬세한 구조이며 조작으로 쉽게 손상되거나 혈관이 손상됩니다. 자궁 뿔을 올릴 때주의하십시오. 이를 위해 난소에서 안전한 거리를 두고 뿔을 잡으십시오.
- 미세 가위를 사용하여 자궁 뿔에서 인접한 혈관 구조, 결합 조직 및 지방을 클램핑하고 다듬어 자궁 적출술을 계속합니다. 출혈을 줄이기 위해 제거하기 전에 결합 조직을 고정하십시오. 클램프를 가능한 한 자궁 경계면에 가깝게, 자궁 경부 접합부(뿔 분기라고도 함)까지 배치합니다.
- 모기 집게를 사용하여 분기 지점 근처의 자궁 뿔을 가로질러 고정합니다(그림 4A-C). 출혈을 피하기 위해 동측 뿔을 클램프에 두부로 절제하십시오. 이것은 자궁-자궁 경부 접합부 (자궁 경부에 대한 주둥이)와 자궁 - 난관 결찰 지점 사이에 위치합니다. 질 금고는 자궁 적출술 후에도 남아 있습니다(그림 4D).
참고: 쥐 혈관의 구경이 작기 때문에 임시 클램프로 자궁 그루터기를 결찰하는 것으로 이 수술에 충분했습니다. 그러나 이 기술은 전기 소작 또는 봉합사 결찰로 척추경을 밀봉하여 필요에 따라 수정할 수 있습니다. - 오른쪽 자궁 경적에서 1.3.3-1.3.6 단계를 반복하여 전체 자궁 적출술을 수행합니다.
- 복부 견인기를 조정하여 하부 골반을 노출시킵니다. 노출된 질 저장고와 골반저가 질과 자궁경부에 부착된 것을 볼 수 있는 인대 및 결합 조직을 지지하는 것을 검사합니다. 가능하면 난소의 내측인 양측으로 요관을 확인하십시오.
- 그림 5A에 표시된 자궁천골 인대28,29를 식별하면 자궁 뿔의 나머지 그루터기(질 금고) 바로 아래 자궁경부에 부착되어 있는 것을 볼 수 있습니다. 인대는 천골을 향한 두부 - 내측 방향으로 추적됩니다.
- 작고 가늘어지는 바늘에 3-0 폴리 디아 사논 봉합사를 사용하여 왼쪽 자궁 천골 인대를 통해 바늘을 꿰매십시오. 천골에 가까운 인대에 바늘을 높게 놓습니다.
- 봉합을 잡아당겨 자궁천골 인대를 포착했는지 확인합니다 - USL 구조는 자궁경부에 삽입되고 원점은 천골에 부착되는 직장 뒤에서 잠수합니다. 다시 말하지만, 요관이 자궁천골 봉합에 통합되거나 꼬이지 않았는지 확인하기 위해 요관을 식별합니다.
- 그런 다음 왼쪽 폴리디아사논 스티치를 질 금고의 왼쪽 측면을 통해 통과시킵니다(그림 5B), 질 커프의 앞쪽과 뒤쪽 측면을 모두 통합하도록 주의합니다. 오른쪽에서 USLS 절차를 완료하기 위한 단계를 반복합니다. 원하는 경우 여러 바늘을 양측으로 배치할 수 있습니다.
- 자궁천골 바늘이 양측으로 배치되면 그림 5C와 같이 정사각형 매듭을 사용하여 봉합사를 단단히 묶어 질 금고가 천골 쪽으로 두부로 올라가도록 합니다. 이것으로 자궁천골 인대 현탁액이 완료됩니다.
- 수술 상처 봉합
- 복부 내용물을 복강 내의 해부학적 위치로 다시 교체합니다. 복벽(복막, 근막, 근육)의 깊은 층을 4-0에서 6-0의 연속 봉합 패턴으로 닫습니다.
- 4-0에서 6-0 폴리디아사논 또는 폴리글락틴 910의 피하(또는 중단된) 스티치로 피부를 닫습니다. 수술 부위 감염 예방을 위해 필요에 따라 항생제를 피하 투여합니다.
- 동물이 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 수술 후 모니터링을 수행하십시오. 완전히 회복 될 때까지 동물을 사회 주택으로 돌려 보내지 마십시오.
그림 2: 생체 수술을 위한 동물 준비. 절개 부위 주변 지역에서 털을 제거하는 것은 적절한 무균 기술을 위해 필요합니다. 패널 (A)와 (B)에 표시된 영역은 지침입니다. 연구원은 수술 중에 멸균 기구가 모발에 닿지 않도록 충분한 모발을 제거해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 난소 보존. 자궁 뿔은 일반적으로 (A)와 같이 복부가 처음 열렸을 때 보이지 않습니다. 뿔을 찾아 (B) 난소와 난관이 뿔에 연결되는 곳을 찾으면 뿔의 상단을 고정하고 뿔을 분리하여 자궁 적출술을 시작할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 자궁 뿔 제거. 쥐의 자궁적출술은 (A) 양쪽 자궁 뿔, (B) 자궁경부 접합부에 고정되고 (C) 절제됩니다. 각 뿔의 질 금고에는 (D) 자궁경부/자궁 그루터기(화살표)가 연결되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 자궁 인대 현탁액. (A) 생성된 질 둥근 천장 구조와 관련된 자궁천골 인대의 방향. 자궁천골 인대 서스펜션(USLS) 수리를 위해 봉합사를 배치할 때 (B) 봉합사는 자궁천골 인대를 포획한 다음 질 커프의 전방 및 후방 측면을 모두 통과합니다. (C) 자궁천골 인대에 고정된 질 금고는 이제 천골 쪽으로 두부로 올라갑니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 단축 인장 시험
알림: 사용된 테스트 시스템 및 소프트웨어는 교정 및 테스트에 대한 제조업체의 지침에 따라 작동되었습니다. 모든 시험은 22°C에서 일어났다.
- 시편 준비
- IACUC가 승인한 약리학적 절차를 사용하여 쥐를 안락사시킵니다. 2 차 물리적 방법을 통해 죽음을 보장합니다. 여기서,CO2 흡입에 이어 심장 천자를 사용하였다. 인장 기계적 테스트를 준비하기 위해 질 금고를 노출시킵니다. 현재 연구에서는 천연 자궁천골 인대(대조군)와 위에서 설명한 바와 같이 자궁천골 인대 정지를 받은 동물(POP)에 대한 인장 테스트를 수행합니다.
- 수술 후 24주 동안 제자리 인대를 테스트합니다. 봉합사의 완전한 재흡수를 허용하기 위해 최소 8주의 최종 시점이 제안됩니다.
- 인도적 안락사 후, linea alba 아래를 절개하여 복부를 노출시킵니다.
- 질 금고가 보일 때까지 지방 조직을 해부하기 시작합니다. 손상되지 않은 USL이 명확하게 보이거나(대조군 동물, 그림 6A) 자궁천추 인대와 질 금고 사이의 접합부가 보일 때까지(POP 동물, 그림 6C) 복부 지방 패드를 계속 해부합니다. 지방 조직을 제거하기 위해 접합부를 당기지 않도록 주의하고, 샘플 간의 일관성을 유지하기 위해 미세 가위로 조심스럽게 절단하십시오.
- 유연한 자를 사용하여 자궁 천골 삽입(직장 후방)과 질 금고 사이의 거리를 측정합니다. 이 값은 조직의 원래 길이입니다.
참고: 대조군 USL의 원래 조직인 표점 거리는 13.4mm± 0.5mm로 측정된 반면 USL 수리의 표점 거리는 12.8mm± 0.4mm로 측정되었습니다. - 조직이 탯줄 테이프의 중앙에 오도록 온전한 USL(대조군, 그림 6B) 또는 USLS 접합부(POP, 그림 6D) 뒤에 탯줄 테이프를 끼웁니다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 탯줄 테이프와 교차하는 조직의 높이와 너비를 측정합니다. 이 값은 단면적을 계산하는 데 사용됩니다.
- 베이스 어댑터를 통해 대형 압축판(재료 표)을 부착하고 시편이 그립 홀더 아래 중앙에 오도록 동물을 위에 놓습니다.
- 인장 시험
- 인장 시험 체제를 소프트웨어에 프로그래밍: 예압, 사전 컨디셔닝, 당김 실패 이는 이전의 골반저(29 ) 및 생식 조직(30 )의 기계적 테스트 프로토콜을 따른다.
- 인장 시험을 준비하기 위해 기기를 설정합니다. 현재 스터디에서는 그림 7과 같이 10N 로드셀, 3D 프린팅 그립 및 베이스 어댑터를 사용하여 압축 시험판을 부착합니다.
알림: 동물의 전체 크기를 지탱할 수 있는 모든 기본 설정이 허용됩니다. 탯줄 테이프를 단단히 고정할 수 있는 그립을 사용하십시오. 이전 연구의 맞춤형 3D 프린팅 홀더와 그립31,32가 이 테스트에 사용되었습니다. STL 파일은 추가 파일로 포함되었습니다.- 표본이 그립 아래 중앙에 오도록 동물을 배치합니다(그림 8A). 동물을 플래튼에 고정하여 표본을 둘러싼 골반 부위를 고정합니다(그림 8B).
- 탯줄 테이프의 꼬리가 그립에 쉽게 닿도록 로드셀을 내립니다. 탯줄 테이프를 그립에 고정하고 테이프를 느슨하게 하여 표본 조작을 방지합니다.
- 소프트웨어 인터페이스에서 사전 컨디셔닝 테스트를 열고 샘플 이름으로 테스트에 레이블을 지정합니다. 사전 컨디셔닝 방법에 사전 로드 단계가 포함되어 있는지 확인합니다.
- 0.015N에서 샘플을 사전 로드하는 사전 컨디셔닝 테스트를 시작하려면 클릭합니다. 예하중이 안정되면 테스트는 30초 동안 0.1mm/s의 연신율로 샘플을 전처리합니다. 조직을 1분 동안 그대로 두십시오. 기다리는 동안 pull-to-failure 테스트 체제를 로드합니다.
알림: 예압력은 기기 제한 사항 및 테스트 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 보고된 예압 범위가 0.015N에서 0.1N 29,33,34,35,36인 이전 연구를 참조하십시오. - 실패하도록 프로그래밍된 테스트 체제를 엽니다. 샘플 이름으로 테스트에 레이블을 지정하고 확인을 클릭하여 다음 창으로 이동합니다. 샘플의 표점 거리를 입력하고 다음을 클릭하여 테스트 페이지로 전환합니다.
- 모두 균형을 맞추고 시작을 클릭하십시오. 조직이 파손될 때까지 0.1mm/s의 연신율로 테스트를 실행합니다. 이 테스트는 하중 변위 데이터를 생성합니다.
- 인장 시험을 위한 응력, 변형률 및 계수 계산
- 하중 변위 데이터, 단면적 및 샘플의 표점 거리를 사용하여 이전에 보고된 37,38,39,40,41과 같이 응력(MPa) 및 변형률(%)을 계산합니다. 아래 표시된 수식 1과 수식 2를 사용합니다. 테스트 중 테이프의 스트레칭도 이러한 계산에서 고려되어야 합니다.
방정식 1
방정식 2- 하중-변위 곡선(그림 9A,D)에서 강성(선형 기울기, N/mm)과 최종 하중을 계산합니다. 응력 변형률 곡선에서 탄젠트 계수(선형 기울기, MPa)와 극한 응력을 계산합니다. 응력 변형률 곡선의 선형 영역은 그림 9B, E에 나와 있으며 이 영역에서 계산된 접선 계수는 두 실험 그룹 모두에 대해 그림 9C, F에 나와 있습니다.
참고: 강성과 탄젠트 계수 모두에 대해 선형 회귀37,41에 대한 R2 값을 최대화하는 점 창을 선택하여 선형 부분을 식별합니다.
- 하중-변위 곡선(그림 9A,D)에서 강성(선형 기울기, N/mm)과 최종 하중을 계산합니다. 응력 변형률 곡선에서 탄젠트 계수(선형 기울기, MPa)와 극한 응력을 계산합니다. 응력 변형률 곡선의 선형 영역은 그림 9B, E에 나와 있으며 이 영역에서 계산된 접선 계수는 두 실험 그룹 모두에 대해 그림 9C, F에 나와 있습니다.
- 하중 변위 데이터, 단면적 및 샘플의 표점 거리를 사용하여 이전에 보고된 37,38,39,40,41과 같이 응력(MPa) 및 변형률(%)을 계산합니다. 아래 표시된 수식 1과 수식 2를 사용합니다. 테스트 중 테이프의 스트레칭도 이러한 계산에서 고려되어야 합니다.
방정식 1
방정식 2
그림 6: 단축 인장 시험을 위한 시편 준비. (A) (B) 탯줄 테이프가 조직 뒤에 끼워지기 전에 노출된 대조군 USL. (C) 인장 시험을 준비하기 위해 조직 뒤에 탯줄 테이프를 끼운 (B) 봉합사가 완전히 용해된 후 USL-질 금고 접합부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 기계적 테스트 시스템 . (A) (B) 3D 프린팅 홀더 및 (C) 3D 프린팅 샘플 그립과 함께 사용되는 인장 시험 모드의 시험 시스템은 그립을 개선하기 위해 질감이 있는 스트립으로 완성됩니다. 패널 (D)에 표시된 조각의 구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 인장 시험의 설정 . (A) 시편은 그립과 홀더 아래 중앙에 위치합니다. (B) 인장 시험이 시작되기 전에 시편을 둘러싼 동물과 조직을 고정시킵니다. 삽입 이미지에서 볼 수 있듯이 주변 조직을 고정하는 것은 관심 조직을 분리하는 데 필수적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 인장 시험 데이터 출력 및 분석의 예. (A) 대조군 샘플에 대한 하중-변위 곡선에 이어 (B) 응력 변형률 분석 및 (C) 접선 계수를 MPa 단위로 나타내는 선 곡선 맞춤 방정식의 기울기. (D-F)는 USLS 샘플에 대한 동일한 과정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
수술 타당성 및 자궁천골 봉합사 배치
어떤 동물에서도 자궁적출술 또는 자궁천골 인대 현탁액과 관련된 수술 중 합병증은 없었습니다. 자궁 뿔을 제거하는 동안 출혈이 최소화되었으며, 제거하기 전에 인접한 혈관 구조가 고정되었습니다. 제한된 출혈은 봉합사 배치를 위한 자궁천골 인대의 좋은 시각화를 허용하고 수술 중 장, 직장, 요관 또는 방광 손상을 예방했습니다. 봉합사를 배치한 후 새로 형성된 USL-질 볼트 접합부는 그림 5C와 같이 자궁경부/자궁 그루터기의 움직임을 방지했습니다. 수술 후 처음 3일 동안, 동물을 매일 검사한 다음, 실험이 끝날 때까지 격주로 검사하였다. 수술 시 연장 방출 오피오이드 및 NSAID 진통제를 투여하면 추가 진통제가 불필요한 것으로 밝혀졌습니다. 16건의 동물 수술에 대한 우리의 경험에 비추어 볼 때(대조군과 USLS 그룹 모두에서 n = 8), 수술 후 첫 주에 수술 당일 체중에서 평균 5.7% ± 1.4%의 체중 감소가 예상되어야 합니다. 예상대로, 쥐는 이후 23 주 동안 서서히 체중이 증가했으며 실험 과정에서 평균 체중이 15.1 ± 4.5 % 증가했습니다.
USLS 수리의 기계적 테스트
USLS 수리의 기능을 입증하기 위해, 단축 인장 시험이 수행되었습니다. 이 연구에서 선택한 수술 후 시점인 24주에 동물을 안락사시킨 후 그림 6A와 같이 USL-질 금고 접합부를 시각화하기 위해 수술 부위를 주의 깊게 해부해야 합니다. 다른 지지 구조 및 골반 장기와 함께 쥐 USL을 테스트하기 위한 다른 방법론과 비교하여29,42, 여기에 설명된 방법은 쥐 USL을 분리된 방식으로 테스트하는 최초의 방법입니다. 이 연구에 사용된 탯줄 테이프는 테이프 컴플라이언스로 인해 인장 시험 준비 중 조직의 파괴를 최소화할 수 있기 때문에 유연성을 위해 전략적으로 선택되었습니다. 따라서 하중 변위 데이터는 탯줄 테이프에 의해 기여되는 작은 양의 신축성을 고려하여 조정되어야 합니다. 그림 9는 인장 시험을 통해 얻은 데이터의 예를 제공하며, 그림 9A는 일반적인 응력-변형률 플롯의 예를 제공합니다. 응력-변형률 데이터의 보고는 이 정보가 정규화되고 시편(34)의 크기와 무관하며 연구 전반에 걸쳐 더 잘 비교될 수 있기 때문에 권장됩니다. 온전한 자궁천골 인대의 경우 극한 하중(2.9 ± 0.5 N) 및 강성(0.4 ± 0.1 N/mm)과 같은 구조적 특성과 극한 응력(2.1 ± 0.4 MPa), 극한 변형률(1.6 ± 0.5) 및 접선 계수(4.0 ± 1.1 MPa)와 같은 정규화된 재료 특성을 보고합니다. Moalli et al.이 쥐의 생식 기관과 모든 지지 조직 연결에 대해 수행한 단축 테스트에서 그들은 고립된 USL29보다 높은 고장 시 최종 하중(13.2 ± 1.1 N) 및 강성(2.9 ± 0.9 N/mm)을 보고했습니다. Moalli et al. 및 기타 문헌34,35는 여기에 제시된 데이터에서 볼 수 있듯이 테스트 된 표본 간의 높은 변동성을 언급합니다. 자궁천골 인대 서스펜션 수리의 경우 모든 구조적 재료 특성(강성, 0.33 ± 0.13N/mm, 극한 하중, 2.6 ± 1.3N) 및 정규화된 재료 특성(극한 응력, 1.8 ± 0.7MPa, 극한 변형률 1.3 ± 0.3, 접선 계수, 3.0 ± 0.9MPa)이 기본 USL보다 낮습니다.
Discussion
이 프로토콜은 몇 가지 장점이 있습니다. 우리가 아는 한, 이것은 쥐 모델에서 USLS에 대한 첫 번째 발표된 설명이며, 미래의 연구자들에게 연구 환경에서 이 절차를 수행하기 위한 재현 가능한 단계를 제공할 것입니다. 둘째, USL의 기본 및 외과 인터페이스의 인장 시험을 위한 새로운 프로토콜을 포함합니다. 인장 시험 프로토콜은 USLS와 같은 천연 조직 복구를 보강하기 위한 새로운 조직공학적 접근법을 조사하는 유사한 연구에서 활용될 수 있습니다. 또한, 쥐 모델 자체는 대형 동물 모델에 비해 취급/탑승 용이성, 짧은 수명 및 비용 효율성으로 인해 골반저 질환 연구에 유용합니다. 프로토콜의 한계는 USLS의 주요 합병증 중 하나인 요관 꼬임을 평가할 수 없다는 것입니다. 그럼에도 불구하고 이 연구에서 추정되는 요관 손상 사례는 없었습니다. 또 다른 고려 사항은 골반의 수평 방향, 작은 태아 두두 대 산도 비율 및 쥐 모델에서 자발적인 탈출증의 부족이 인간에 대한 결과의 일부 적용 가능성을 제한한다는 것입니다. 그러나 다산 쥐의 사용은 POP3 발병의 주요 위험 요소를 설명하기 때문에 이 연구의 강점입니다.
루이스 쥐의 자궁적출술 및 USLS에 대한 성공적인 프로토콜의 확립은 USL의 기계적 거동을 테스트할 때 가변성을 최소화하면서 POP의 외과적 구성 요소를 조사하는 미래의 연구자들에게 유용한 도구가 될 것입니다. 수술용 동물 모델은 연구자들이 인간에 대한 초기 연구의 윤리적 위험을 완화하면서 동등성, 체질량, 질병 및 영양을 조절하는 임상적으로 관련된 실험을 설계할 수 있다는 점에서 유익하다.34 또한 POP에 대한 표준화된 모델을 통해 연구자는 인체 조직 수집의 한계를 우회할 수 있습니다. 특히, 이 프로토콜에 설명된 인장 시험 방법은 연구 간의 일관성을 가능하게 합니다. 이전의 설치류 모델은 자궁 경부, 질 및 다발성 골반 지지 인대를 포함하는 전체 골반 부위의 기계적 특성을 테스트하였다29,42. 여기에 설명된 방법을 사용하면 기본 척추 및 경추 부착물을 유지하는 방식으로 USL을 측정할 수 있습니다. 인장 시험 방법은 USL 단독으로 평가하는 것이 아니라 천골과 자궁경부에 삽입하는 것과 함께 USL을 평가한다는 점에 유의해야 합니다. 이것은 인대가 받는 일반적인 현장 힘을 반영하기 때문에 연구의 강점입니다. 우리는 분리된 인대의 기계적 거동이 기본 부착물 없이 생체 외에서 테스트되는 경우 다를 수 있음을 인정합니다. 쥐 구조가 작고 생체 외 테스트에 적합한 샘플을 수집할 수 있는 가능성을 제한하기 때문에 특히 그렇습니다. USL은 현장에서 여러 방향으로 하중을 가하는 것을 경험하므로 테스트의 일축 특성은 한계가 있지만 이 방법을 사용하면 쥐 USL 역학에 대한 이전 연구 간의 의미 있는 비교가 가능합니다29,42. 현재 널리 인정되는 표준 기계적 테스트 프로토콜은 없지만 이 모델은 해당 분야의 향후 조직 공학 연구에 유용한 도구가 될 것입니다.
이 프로토콜에 기술된 몇 가지 단계들은 동물들의 건강과 웰빙 뿐만 아니라 USLS 수술과 후속 인장 시험의 재현성에 매우 중요합니다. 첫째, 진통제와 진통제를 모두 얻는 것이 필수적이며 진통제만으로는 통증 관리에 부적합한 것으로 밝혀졌다. 예방적 항생제는 수술 부위 감염의 위험을 감소시키며 인간 수술의 표준 치료입니다. USLS 수술 절차와 관련하여, 난소 손상을 피하고 출혈을 최소화하는 것은 성공적인 수술을 위해 필수적입니다. 1.3.3 단계와 1.3.4 단계는 인접한 난소에서 자궁 뿔의 상단을 분리하는 것을 설명합니다. 과도한 출혈을 초래할 수 있는 난소 주변의 섬세한 혈관이 파괴되는 것을 방지하기 위해 자궁 뿔 측면에서 이 절개를 유지하도록 주의해야 합니다. 주목할 점은, 다른 연구자들은 난소 기능이 자궁 뿔을 제거한 후에도 보존된다는 것을 보여주었다43. 또한, 난소가 파괴되거나 제거되면 전체 콜라겐 원섬유 구조가 교란되어 조직의 기계적 특성이 변경됩니다44,45. 자궁 뿔이 난소에서 안전하게 분리되면 주변의 지방 패드 및 혈관 구조에서 자궁 뿔을 분리할 수 있는 명확한 해부면이 있습니다. 명확한 해부면에도 불구하고 자궁 뿔을 따라 있는 작은 꽃자루는 미세 가위로 절개하기 전에 클램프로 고정해야 합니다. 인간의 외과적 관행과 달리, 우리는 절개 전에 척추경을 조이면 적절한 지혈을 보장하기 때문에 자궁적출술 척추경의 봉합 결찰이 불필요하다는 것을 발견했습니다. 프로토콜의 1.3.6 단계는 혈액 손실을 최소화하기 위한 이 신중한 과정을 설명합니다. 자궁 적출술을 시행할 때 1.3.6 및 1.3.8 단계에서 언급한 대로 요관을 식별하는 데 세심한 주의를 기울여야 합니다. 인간의 USL과 관련된 가장 흔한 합병증 중 하나가 요관 손상이기 때문에 요관의 해부학적 근접성을 이해하는 것이 중요합니다46.
결론적으로, 우리는 쥐 모델에서 자궁적출술, 자궁천골 인대 서스펜션 및 USL의 인장 테스트를 수행하기 위한 새로운 프로토콜을 제시합니다. 우리는 우리의 연구 결과가 이러한 절차에 대한 명확하고 재현 가능한 설명을 제공함으로써 미래의 기초 과학 연구자들에게 도움이 될 것으로 기대하며, 이를 통해 골반 장기 탈출증 연구의 발전을 가능하게 할 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Instron을 사용해 주신 Silvia Blemker 교수님과 수술 공간과 3D 프린팅 홀더 및 그립을 사용해주신 George Christ 교수님께 감사드립니다. 이 연구는 UVA-Coulter Translational Research Partnership과 DoD(W81XWH-19-1-0157)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pad | BD | 326895 | |
| Artificial Tear Ointment | American Health Service Sales Corp | PH-PARALUBE-O | |
| Bluehill software | Instron | Bluehill 3 | |
| Cavicide 1 disinfectant | Fisher Scientific | 22 998 800 | |
| Compression platean | Instron | 2501-163 | |
| Cotton swabs | Puritan Medical | 806-WC | |
| Gauze Sponge, 8-Ply | VWR | 95038-728 | |
| Mosquito Forceps | Medline Industries | MMDS1222115 | |
| Needle Holder | Medline Industries | DYND04045 | |
| Operating Scissors, 5½", Sharp | American Health Service Sales Corp | 4-222 | |
| Opioid Analgesic (Buprenorphine XR) | Fidelis Animal Health | Ethiqa XR | 0.65 mg/kg SC Q72 |
| NSAID Analgesic (Meloxicam SR) | Wildlife Pharmaceuticals, LLC | Meloxicam SR | 1 mg/kg SC q72 |
| PDS II, 3-0 Polydioxanone Suture, SH-1 | Ethicon | Z316H | |
| PDS II, 5-0 P olydioxanone Suture, RB-1 | Ethicon | Z303H | |
| Retractor | Medline Industries | MDS1862107 | |
| Scalpel Blade Stainless Surgical #10 | Miltex | 4-310 | |
| Scalpel Handle | Medline Industries | MDS15210 | |
| Scissor, Micro, Curved, 4.5" | Westcott | MDS0910311 | |
| Single Column Universal Testing System | Instron | 5943 S3873 | 1 kN force capacity, 10 N load cell |
| Sterile Natural Rubber Latex Gloves | Accutech | 91225075 | |
| Suture,Vicryl,6-0,P-3 | Ethicon | J492G | |
| Tape,Umbilical,Cotton,1/8X18" | Ethicon | U10T | |
| Tension and Compression Load Cell | Instron | 2530-10N | 10N load cell (1 kgf, 2 lbf) |
| Veterinary surgical adhesive (skin glue) | Covetrus | 31477 |
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