Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Разработка модели крысы с подвеской маточно-крестцовой связки

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64311
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,3, 4
1Department of Chemical Engineering, University of Virginia, 2Electrophysiology Division, Abbott, 3Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Division of Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery, University of Virginia

Summary

Пролапс тазовых органов поражает миллионы женщин во всем мире, и все же некоторые распространенные хирургические вмешательства имеют частоту неудач до 40%. Отсутствие стандартных моделей на животных для исследования этого состояния препятствует прогрессу. Мы предлагаем следующий протокол в качестве модели для подвешивания маточно-крестцовой связки и испытаний на растяжение in vivo .

Abstract

Пролапс тазовых органов (POP) является распространенным заболеванием тазового дна (PFD), которое может значительно повлиять на качество жизни женщины. Примерно 10-20% женщин проходят операцию по восстановлению тазового дна для лечения пролапса в Соединенных Штатах. Только в Соединенных Штатах дела PFD приводят к общим ежегодным расходам в размере 26,3 миллиарда долларов. Это многофакторное состояние оказывает негативное влияние на качество жизни, и все же варианты лечения в недавнем прошлом только сократились. Одним из распространенных хирургических вариантов является суспензия маточно-крестцовой связки (USLS), которая обычно выполняется путем прикрепления свода влагалища к маточно-крестцовой связке в тазу. Эта операция имеет меньшую частоту осложнений по сравнению с операциями с аугментацией сетки, но отличается относительно высокой частотой отказов до 40%. Учитывая отсутствие стандартных моделей на животных для изучения дисфункции тазового дна, существует острая клиническая потребность в инновациях в этой области с акцентом на разработку экономически эффективных и доступных моделей животных. В этой рукописи мы описываем крысиную модель USLS, включающую полную гистерэктомию с последующей фиксацией оставшегося свода влагалища к маточно-крестцовой связке. Цель этой модели состоит в том, чтобы имитировать процедуру, выполняемую на женщинах, чтобы иметь возможность использовать модель для последующего исследования репаративных стратегий, которые улучшают механическую целостность прикрепления связок. Важно отметить, что мы также описываем разработку процедуры испытания на растяжение in situ для характеристики целостности интерфейса в выбранные моменты времени после хирургического вмешательства. В целом, эта модель станет полезным инструментом для будущих исследований, в которых изучаются варианты лечения восстановления СОЗ с помощью USLS.

Introduction

Пролапс тазовых органов (POP) является распространенным заболеванием тазового дна, поражающим миллионы женщин во всем мире и способным существенно повлиять на многие аспекты жизни женщины, особенно в возрасте1 года. Примечательно, что примерно 13% женщин в Соединенных Штатах подвергнутся хирургическому вмешательству по поводу пролапса или недержания мочи2. Состояние, наиболее распространенное после беременности и родов, пролапс характеризуется опущением органов малого таза, преимущественно различных отделов влагалища и/или матки, за пределы их нормального положения в брюшной полости. Это приводит к надоедливым симптомам выпуклости влагалища или давления, кишечника, мочевого пузыря и сексуальной дисфункции, а также к общему снижению качества жизни. Другие факторы риска развития СОЗ включают ожирение, употребление табака, хронический кашель и запоры3.

У здоровых женщин органы тазового дна поддерживаются мышцами-леваторами ани, маточно-крестцовыми связками (УЗЛ), кардинальными связками, соединительнотканными прикреплениями к боковой стенке таза и дистальными структурами тела промежности 4,5. USL являются одними из наиболее важных апикальных поддерживающих структур как для матки, так и для апикального влагалища и, таким образом, часто используются при хирургической коррекции POP (рис. 1). Структурная поддержка USL проистекает из плотной коллагеновой соединительной ткани в крестцовой области, которая переходит в плотно упакованные гладкие мышцы. Из-за этого композиционного градиента USL переплетается с мускулатурой матки и влагалища, обеспечивая прочную поддержку органов малого таза 6,7. В суспензии маточно-крестцовых связок (USLS) USL прикрепляются к своду влагалища после гистерэктомии, восстанавливая влагалище и окружающие структуры в их анатомическом положении в брюшном отделении. Однако, независимо от трансвагинального или лапароскопического пути, процедура USLS страдает от относительно высокой частоты неудач до 40% в некоторых исследованиях 8,9. Частота рецидивов надоедливых симптомов выпуклости влагалища через 5 лет после восстановления пролапса апикального компартмента, такого как USL, составила примерно 40% в большом многоцентровом рандомизированном контролируемом исследовании9. В том же исследовании повторное лечение рецидивирующего пролапса через 5 лет составило примерно 10%. Механизм такой высокой частоты отказов не изучался, но восстановление влагалища и окружающих структур в их анатомическом положении требует наложения швов в плотную коллагеновую область USL10,11, а не в область гладких мышц. Таким образом, высокая частота неудач может быть связана с механическим и композиционным несоответствием хирургически сформированного интерфейса влагалища-USL по сравнению с полной интеграцией, наблюдаемой в нативном прикреплении шейки матки и USL.

Экономический эффект от лечения этих расстройств также заметен: в США ежегодно тратится около 300 миллионов долларов на амбулаторнуюпомощь12 и более 1 миллиарда долларов ежегодно расходуется на прямые расходы на хирургические процедуры13. Несмотря на огромные экономические ресурсы, выделяемые на лечение этих состояний, осложнения, возникающие в результате многих операций по поводу пролапса, остаются обескураживающими. Например, восстановление апикального пролапса на основе полипропиленовой сетки, такое как сакрокольпопексия, обеспечивает более высокие показатели успеха по сравнению с восстановлением нативных тканей14, но за счет потенциальных осложнений, таких как обнажение сетки или эрозия. Только в период с 2008 по 2010 год FDA получило около 3000 жалоб, связанных с осложнениями сетки. Кульминацией этого стал приказ FDA о прекращении производства и продажи всех трансвагинально размещенных сетчатых продуктов для СОЗ в апреле 2019года 15. Таким образом, существует сильная клиническая потребность в материалах, отличных от полипропилена, и моделях, с помощью которых их можно тестировать, которые могут усилить восстановление пролапса нативных тканей и повысить показатели успеха по сравнению с традиционными методами с наложением швов в одиночку.

С момента объявления FDA в 2019 году большинство тазовых хирургов прекратили использовать трансвагинально размещенную сетку для восстановления пролапса, что побудило исследователей искать новые подходы к тканевой инженерии для усиления восстановления нативных тканей16,17,18, таких как мезенхимальные стромальные клетки (МСК)9,20 . В связи с этим смещением акцента существует острая необходимость в уточнении моделей животных, которые могут помочь в разработке новых материалов; Задача в этом процессе состоит в том, чтобы сбалансировать клиническую значимость с затратами. С этой целью фундаментальная наука и клинические исследователи, изучающие пролапс тазовых органов, до сих пор использовали несколько моделей на животных, включая крыс, мышей, кроликов, овец, свиней и нечеловекообразных приматов19. Процесс определения оптимальной модели животных является сложным, поскольку люди двуногие, не имеют хвоста и имеют травматический процесс рождения по сравнению с другими видами млекопитающих20. Свиньи21 были использованы для моделирования роботизированной сакрокольпопексии, в то время как овцы использовались для моделирования восстановления вагинального пролапса22. Эти модели на животных, хотя и клинически значимы, ограничены в осуществимости стоимостью и обслуживанием. Нечеловекообразные приматы использовались для изучения патогенеза пролапса; Беличьи обезьяны, в частности, являются одним из немногих видов, кроме людей, у которых может развиться спонтанный пролапс, что делает их одной из наиболее актуальных моделей животных20. Нечеловеческие приматы также использовались для изучения гинекологических хирургических процедур, таких как сакрокольпопексия23 и трансплантация матки24. Как и в случае с овцами и свиньями, основным ограничением нечеловеческих приматов как животной модели пролапса является стоимость содержания, ухода и содержания19.

Хотя таз грызунов ориентирован горизонтально с гораздо меньшим соотношением размеров головы к родовому каналу по сравнению с людьми19, крысы подходят для исследований хирургии USLS на мелких животных, поскольку они имеют аналогичную анатомию USL, клеточность, гистологическую архитектуру и состав матрицы по сравнению с человеческим USL25. Кроме того, они выгодны с точки зрения обслуживания и посадки. Несмотря на эти полезные свойства, нет опубликованных сообщений о крысиной модели восстановления USLS. Таким образом, цель состоит в том, чтобы описать протокол гистерэктомии и USLS у многородящей крысы Льюиса. Этот протокол будет полезен для исследователей, которые стремятся изучить патофизиологию и хирургические компоненты СОЗ с использованием этой доступной модели животных.

Figure 1
Рисунок 1: Опущение тазовых органов. (А) Нормальная ориентация органов в брюшной полости и (Б) резкое снищение органа при пролапсе. После гистерэктомии (C) суспензия маточно-крестцовой связки восстанавливает влагалище и окружающие структуры в их правильном анатомическом положении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

Следуйте всем рекомендациям Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC), получив одобрение на все процедуры с животными перед началом. Требования к технике асептической хирургии можно найти в Руководстве26 и Правилах защиты животных27. Исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Вирджинии по протоколу No 4332-11-20. Получают повторнородящих (два помета) самки заводчиков. Крысы должны быть размещены в парном виварии, аккредитованном Американской ассоциацией по аккредитации ухода за лабораторными животными, и обеспечены кормом и водой ad libitum. Животные в этом исследовании были крысами Льюиса, полученными из Чарльз-Ривер, и были в возрасте от 4 до 6 месяцев, чтобы удовлетворить потребность в двух пометах. Животные содержались в 12-часовом цикле свет-темнота.

1. Коррекция пролапса тазовых органов с помощью подвески маточно-крестцовой связки

  1. Оборудование и подготовка хирургического кабинета к операции на живых животных
    1. Подготовьте операционную область таким образом, чтобы хирургическая доска нагрелась до 37 °C, используя рециркуляционные грелки с горячей водой вместе со стерильной водонепроницаемой прокладкой. Обеспечьте стерильность хирургической доски и хирургической области с помощью дезинфицирующего средства для поверхностей, не содержащего отбеливателя, а затем протрите 70% этанолом.
    2. Используйте термостерилизацию в автоклаве для стерилизации всех безопасных для автоклава материалов, включая хирургические инструменты, хирургические губки (марлю), ватные палочки и одноразовую простыню. Приобретите стерильные упакованные хирургические перчатки.
    3. Возьмите электрические машинки для стрижки, офтальмологическую мазь, салфетки с этанолом, ватные палочки и раствор йода, а также стерильное упакованное лезвие скальпеля и швы и положите на верстак.
  2. Подготовка животных к операции на живых животных
    1. Осторожно поместите животное в анестезиологическую камеру, снабженную 2% изофлураном, и взвесьте животное после того, как будет достигнута надлежащая плоскость анестезии. Надлежащая анестезия подтверждается, когда животное не реагирует на защемление пальца ноги.
    2. Поместите животное на операционную доску в положении лежа, надежно поместив нос в конус для анестезии, снабженный 2% изофлураном. Нанесите офтальмологическую мазь на каждый из глаз животного.
    3. Подкожно вводят опиоидный анальгетик и анальгетик НПВП (таблица материалов).
    4. Поместите животное в положение лежа на спине, как показано на рисунке 2, и срежьте брюшную шерсть от мечевидного отростка до отверстия уретры (8 см х 4 см). Стерилизуйте брюшную полость тремя зарядами йода и спирта, чтобы подготовить место разреза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если бритье приводит к кровотечению, добейтесь гемостаза с помощью давления, прежде чем подготавливать кожу с помощью йода и спирта. Удерживайте йод на коже в течение 30 с.
    5. Если ассистента хирурга нет, положите стерильные принадлежности и инструменты на стерильный лоток для инструментов, включая стерильные ватные тампоны, простыни, губки (марлю), хирургическое лезвие, швы и хирургический маркер (необязательно). Если ассистент хирурга доступен, то этот шаг можно пропустить, и ассистент может предоставить стерильные инструменты после шага 1.3.1.
  3. Гистерэктомия и суспензия маточно-крестцовой связки (USLS)
    1. Наденьте хирургический халат, головной убор, маску и стерильные перчатки. Задрапируйте животное стерильным полем, оставив открытым только брюшко.
    2. Сделайте разрез на 7 см вниз по белой линии от чуть ниже мечевидного отростка до нижней линии соска с помощью лезвия скальпеля. Разрез должен заканчиваться на расстоянии ~0,5-1,0 см от устья уретры. Затем сделайте надрез через мышечный слой под ним. Избегайте кровеносных сосудов брюшной стенки, чтобы предотвратить кровотечение.
    3. Соберите брюшной ретрактор и осмотрите брюшную полость (рис. 3А). С помощью щипцов радужной оболочки аккуратно найдите левый рог матки. Матка находится глубоко внутри кишечника, который часто является структурой, впервые встречающейся при попадании в брюшную полость. Полезно сначала определить яичник (рис. 3B) и связанный с ним жировой пакет яичников.
    4. Осторожно поднимите левый рог матки с помощью захвата или зажима от комаров и начните гистерэктомию, перевязав рог ниже яичника и яйцевода с помощью зажима от комара. Яичники представляют собой нежные структуры и легко повреждаются или деваскуляризируются с помощью манипуляций. Будьте осторожны при поднятии рогов матки; Для этого возьмитесь за рог на безопасном расстоянии от яичника.
    5. Продолжайте гистерэктомию, зажимая и обрезая соседнюю сосудистую сеть, соединительную ткань и жир из рога матки с помощью микроножниц. Зажмите соединительную ткань перед удалением, чтобы уменьшить кровотечение. Поместите зажимы как можно ближе к границе раздела матки, вплоть до маточно-цервикального соединения (также называемого бифуркацией рогов).
    6. Зажмите рог матки возле точки бифуркации с помощью щипцов от комаров (рис. 4A-C). Иссеките ипсилатеральный рог только головным мозгом до зажима, чтобы избежать кровотечения. Он расположен между маточно-цервикальным соединением (только ростральным к шейке матки) и точкой перевязки маточных труб. Свод влагалища останется после гистерэктомии (рис. 4D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за небольшого калибра сосудов крысы для этой операции было достаточно перевязки культи матки временным зажимом. Тем не менее, эта техника может быть изменена по мере необходимости либо с герметизацией ножек электрокоагуляцией, либо с перевязкой швов.
    7. Повторите шаги 1.3.3-1.3.6 на правом роге матки, чтобы выполнить тотальную гистерэктомию.
    8. Отрегулируйте брюшной ретрактор, чтобы обнажить нижнюю часть таза. Осмотрите открытый свод влагалища и поддерживающие тазовое дно связочные и соединительные ткани, которые можно увидеть прикрепленными к влагалищу и шейке матки. Если возможно, определите мочеточник с обеих сторон, который является как раз медиальным по отношению к яичникам.
    9. Определите маточно-крестцовые связки28,29, показанные на рисунке 5А, которые можно найти прикрепленными к шейке матки чуть ниже оставшихся культей рогов матки (свод влагалища). Связка прослеживается в цефаладно-медиальной ориентации по направлению к крестцу.
    10. Используя полидиаксаноновый шов 3-0 на небольшой конической игле, наложите шов через левую маточно-крестцовую связку. Наложите шов высоко на связку, близко к крестцу.
    11. Потяните за шов, чтобы убедиться, что он захватил маточно-крестцовую связку - структура USL вставляется в шейку матки, а начало ныряет за прямую кишку, где она прикрепляется к крестцу. Опять же, определите мочеточник, чтобы убедиться, что он не был включен или перекручен маточно-крестцовым швом.
    12. Затем проведите левый полидиаксаноновый шов через левую часть свода влагалища (рис. 5B), стараясь охватить как переднюю, так и заднюю стороны влагалищной манжеты. Повторите шаги, чтобы завершить процедуру USLS с правой стороны. При желании можно наложить несколько швов на двусторонней основе.
    13. После того, как маточно-крестцовые швы наложены на двусторонней основе, надежно завяжите шов квадратным узлом, как показано на рисунке 5C, так, чтобы свод влагалища был поднят головой к крестцу; На этом суспензия маточно-крестцовой связки завершается.
  4. Закрытие операционной раны
    1. Замените содержимое брюшной полости обратно в его анатомическое положение в брюшной полости. Закрывают глубокие слои брюшной стенки (брюшину, фасцию, мышцу) непрерывным швом от 4-0 до 6-0 полиглактином 910 или полидиаксаноновым швом.
    2. Закройте кожу бегущим подкожным (или прерывистым) швом полидиаксанона или полиглактина 910 от 4-0 до 6-0. Вводите антибиотик подкожно по мере необходимости для профилактики инфекции в области хирургического вмешательства.
    3. Проводите послеоперационный мониторинг до тех пор, пока животное не придет в сознание в достаточном сознании для поддержания лежачего положения грудины. Не возвращайте животное в социальное жилье до полного выздоровления.

Figure 2
Рисунок 2: Подготовка животных к операции в реальном времени. Удаление шерсти с области, окружающей место разреза, необходимо для правильной асептической техники. Области, показанные на панелях (А) и (В), являются ориентировочными. Исследователи должны удалить достаточное количество волос, чтобы стерильные инструменты не соприкасались с волосами во время операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Сохранение яичников. Рога матки обычно не видны при первом открытии брюшной полости, как показано в (А). После того, как рог обнаружен и проследите, чтобы найти (B) яичник и яйцевод, где они соединяются с рогом, верхнюю часть рога можно зажать, а рог отделить, чтобы начать гистерэктомию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Удаление рогов матки. Гистерэктомия у крысы включает (А) оба рога матки (В), зажатые в маточно-цервикальном соединении, и (В) иссеченные. Свод влагалища от каждого рога остается с (D) шейной/маточной культей (стрелка), соединяющей их. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Суспензия маточно-крестцовой связки. (А) Ориентация маточно-крестцовых связок по отношению к созданным структурам свода влагалища. При наложении швов для восстановления подвески маточно-крестцовой связки (USLS) (B) швы захватывают маточно-крестцовую связку, а затем проходят как через переднюю, так и через заднюю стороны влагалищной манжеты. (C) Закрепленный на маточно-крестцовой связке, свод влагалища теперь поднят головой к крестцу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Одноосное испытание на растяжение

ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая испытательная система и программное обеспечение эксплуатировались в соответствии с рекомендациями производителя по калибровке и тестированию. Все испытания проводились при температуре 22 °C.

  1. Подготовка образцов
    1. Усыпьте крысу с помощью фармакологической процедуры, одобренной IACUC. Обеспечьте смерть вторичным физическим методом. Здесь применялась ингаляцияСО2 с последующей пункцией сердца. Обнажите свод влагалища при подготовке к механическим испытаниям на растяжение. В настоящем исследовании проводят испытания на растяжение нативных маточно-крестцовых связок (контроль), а также животных, подвергшихся суспензии маточно-крестцовой связки, как описано выше (POP).
    2. Тестирование связок in situ через 24 недели после операции. Рекомендуется конечный срок не менее 8 недель, чтобы обеспечить полную реабсорбцию швов.
      1. После гуманной эвтаназии сделайте разрез по белой линии, чтобы обнажить брюшную полость.
      2. Начните рассекать жировую ткань до тех пор, пока не станет виден свод влагалища. Продолжайте рассекать абдоминальные жировые подушечки до тех пор, пока не станут отчетливо видны неповрежденные USL (контрольные животные, рис. 6A) или не будет видно соединение между маточно-крестцовой связкой и сводом влагалища (животные POP, рис. 6C). Будьте осторожны, чтобы не тянуть за соединение для удаления жировой ткани, а лучше использовать аккуратные разрезы микроножницами, чтобы сохранить согласованность между образцами.
      3. С помощью гибкой линейки измерьте расстояние между маточно-крестцовым введением (позади прямой кишки) и сводом влагалища. Это значение является исходной длиной ткани.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная длина ткани, калибровочная длина, для контрольных USL составляла 13,4 ± 0,5 мм, в то время как длина датчика для восстановления USL составляла 12,8 ± 0,4 мм.
      4. Проденьте пупочную ленту за неповрежденным USL (контроль, рис. 6B) или соединением USLS (POP, рис. 6D) таким образом, чтобы ткань была центрирована на пуповинной ленте. Измерьте высоту и ширину ткани в месте ее пересечения с пупочной лентой с помощью цифровых штангенциркулей. Эти значения будут использоваться для расчета площади поперечного сечения.
      5. Прикрепите большую компрессионную пластину (таблица материалов) через базовый адаптер и расположите животное сверху так, чтобы образец находился по центру под держателем захвата.
  2. Испытание на растяжение
    1. Запрограммируйте режим испытаний на растяжение в программном обеспечении: предварительная нагрузка, предварительное условие, тяга до отказа. Это следует за предыдущими протоколами механических испытаний тазового дна29 и репродуктивной ткани30 .
    2. Настройте прибор при подготовке к испытанию на растяжение. Для текущего исследования используйте тензодатчик 10 Н, рукоятку, напечатанную на 3D-принтере, и базовый адаптер для крепления компрессионной плиты, как показано на рисунке 7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любая базовая установка, которая может поддерживать полный размер животного, приемлема. Используйте любой захват, который может надежно удерживать пупочную ленту. В этом тестировании использовались изготовленные на 3D-принтере держатель и рукоятка из предыдущих исследований31,32. Файлы STL были включены в качестве дополнительных файлов.
      1. Расположите животное так, чтобы образец находился по центру под рукояткой (рис. 8A). Иммобилизуйте область таза, окружающую образец, закрепив животное на рабочей поверхности (рис. 8B).
      2. Опустите тензодатчик так, чтобы хвосты пупочной ленты легко доставали до захвата. Закрепите пуповинную ленту в захвате, оставив ленту слабой, чтобы избежать манипуляций с образцом.
    3. Откройте тест предварительного кондиционирования в программном интерфейсе и пометьте тест именем образца. Убедитесь, что метод предварительного кондиционирования включает этап предварительной загрузки.
    4. Нажмите, чтобы начать испытание на предварительную подготовку, в ходе которого образец будет предварительно загружен при давлении 0,015 Н. Как только усилие предварительной нагрузки стабилизируется, испытание подготавливает образец со скоростью удлинения 0,1 мм/с в течение 30 с. Дайте салфетке отдохнуть в течение 1 минуты. Во время ожидания загрузите режим тестирования на вытягивание до отказа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Усилие предварительной нагрузки может варьироваться в зависимости от ограничений прибора и условий испытаний. Обратитесь к предыдущим исследованиям, в которых сообщаемая предварительная нагрузка колеблется от 0,015 Н до 0,1 Н 29,33,34,35,36.
    5. Откройте режим тестирования, который запрограммирован на вытягивание до отказа. Пометьте тест именем образца и нажмите «ОК», чтобы перейти к следующему окну. Введите длину датчика образца и нажмите « Далее », чтобы перейти на страницу теста.
    6. Сбалансируйте все и нажмите « Пуск». Дайте тесту работать со скоростью удлинения 0,1 мм / с до тех пор, пока ткань не будет вытянута до отказа. В ходе испытания будут получены данные о перемещении нагрузки.
  3. Расчет напряжения, деформации и модуля упругости упругости при испытании на растяжение
    1. Используя данные о перемещении нагрузки, площади поперечного сечения и калибровочной длины образца, рассчитайте напряжение (МПа) и деформацию (%) в соответствии с ранее сообщенными 37,38,39,40,41. Используйте уравнения 1 и 2, показанные ниже. Обратите внимание, что растяжение ленты во время тестирования также должно быть учтено в этих расчетах.
      Equation 1     Уравнение 1
      Equation 2     Уравнение 2
      1. На основе кривой нагрузки-смещения (рис. 9A, D) рассчитайте жесткость (линейный наклон, Н/мм) и предельную нагрузку. На основе кривой деформации напряжений рассчитайте модуль касательной (линейный наклон, МПа) и предельное напряжение. Линейная область кривой деформации напряжений отмечена на рисунке 9B,E с рассчитанным модулем касательной из этой области, показанным на рисунке 9C,F для обеих экспериментальных групп.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Как для жесткости, так и для модуля касательной определите линейную часть, выбрав окно точек, которое максимизирует значение R2 для линейной регрессии37,41.

Figure 6
Рисунок 6: Подготовка образца к испытанию на одноосное растяжение. (А) Открытые контрольные USL до (B) пупочная лента продевается за тканью. (C) соединение USL-свода влагалища после полного растворения швов с (B) пупочной лентой, продетой за тканью при подготовке к испытанию на растяжение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Система механических испытаний . (A) Испытательная система в режиме испытания на растяжение, используемая с (B) держателем для 3D-печати и (C) захватом образца, напечатанным на 3D-принтере, в комплекте с текстурированной полосой для улучшения сцепления. Конфигурация деталей показана на панели (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Настройка испытания на растяжение . (A) Образец находится по центру под рукояткой и держателем. (B) Животное и ткани, окружающие образец, удерживаются в неподвижном состоянии до начала испытания на растяжение. Как показано на врезке, закрепление окружающей ткани необходимо для изоляции интересующей ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Пример вывода и анализа данных испытаний на растяжение. (А) Кривая нагрузки-смещения для контрольного образца с последующим (B) анализ напряженной деформации и (C) наклон уравнения подгонки линейной кривой, показывающий касательный модуль в МПа. (D-F) показывает тот же процесс для образца USLS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Representative Results

Хирургическая целесообразность и наложение маточно-крестцового шва
Ни у одного из животных не было интраоперационных осложнений, связанных с гистерэктомией или подвешиванием маточно-крестцовой связки. Во время удаления рогов матки наблюдалось минимальное кровотечение, при условии, что соседняя сосудистая сеть была пережата перед удалением. Ограниченное кровотечение позволило хорошо визуализировать маточно-крестцовые связки для наложения швов и предотвратило интраоперационное повреждение кишечника, прямой кишки, мочеточника или мочевого пузыря. После наложения швов новообразованное соединение USL-влагалищного свода предотвращало движение культи шейки матки / матки, как показано на рисунке 5C. В течение первых трех послеоперационных дней животных проверяли ежедневно, а затем раз в две недели до конца эксперимента. При введении опиоидов и анальгетиков НПВП с пролонгированным высвобождением во время операции дополнительные анальгетики оказались ненужными. Основываясь на нашем опыте с 16 операциями на животных (n = 8 как для контрольной группы, так и для группы USLS), следует ожидать снижения веса в первую неделю после операции со средней потерей веса на 5,7 ± 1,4% от веса в день операции. Как и ожидалось, крысы медленно набирали вес в течение последующих 23 недель, со средним увеличением веса на 15,1 ± 4,5% в ходе эксперимента.

Механические испытания ремонта УСЛС
Для демонстрации функциональности ремонта USLS были проведены одноосные испытания на растяжение. После эвтаназии животного в выбранный послеоперационный момент, 24 недели в этом исследовании, хирургическая область должна быть тщательно рассечена, чтобы визуализировать соединение USL-влагалищного свода, как показано на рисунке 6A. По сравнению с другими методологиями тестирования USL крыс вместе с другими поддерживающими структурами и органами малого таза29,42, описанный здесь метод является первым, в котором USL крыс тестируется изолированным образом. Пупочная лента, используемая в этом исследовании, была стратегически выбрана из-за ее гибкости, поскольку податливость ленты позволяла свести к минимуму разрушение ткани во время подготовки к испытанию на растяжение. Поэтому данные о смещении нагрузки должны быть скорректированы с учетом небольшого растяжения, вносимого пуповинной лентой. На рисунке 9 приведен пример данных, полученных в результате испытаний на растяжение, а на рисунке 9А приведен пример типичного графика напряжений-деформаций. Рекомендуется сообщать данные о напряженно-деформированном состоянии, поскольку эта информация нормализована и не зависит от размера образцов34 и может быть лучше сопоставлена между исследованиями. Для интактной маточно-крестцовой связки мы сообщаем о структурных свойствах, таких как предельная нагрузка (2,9 ± 0,5 Н) и жесткость (0,4 ± 0,1 Н/мм), а также нормализованные свойства материала, такие как предельное напряжение (2,1 ± 0,4 МПа), предельная деформация (1,6 ± 0,5) и модуль касательной (4,0 ± 1,1 МПа). В одноосных тестах, проведенных на репродуктивных органах крыс и всех их поддерживающих тканевых соединениях Moalli et al., они сообщили о предельной нагрузке при отказе (13,2 ± 1,1 Н) и жесткости (2,9 ± 0,9 Н/мм) выше, чем у изолированного USL29. В работе, проделанной Moalli et al. и другой литературе34,35, упоминается высокая вариабельность между испытуемыми образцами, как показано в представленных здесь данных. Для восстановления подвески маточно-крестцовой связки мы обнаружили, что все свойства конструкционного материала (жесткость 0,33 ± 0,13 Н/мм; предельная нагрузка 2,6 ± 1,3 Н) и нормализованные свойства материала (предельное напряжение 1,8 ± 0,7 МПа; предельная деформация 1,3 ± 0,3; модуль касательной 3,0 ± 0,9 МПа) ниже, чем у родного USL.

Discussion

Протокол примечателен рядом преимуществ. Насколько нам известно, это первое опубликованное описание USLS в модели крысы, которое предоставит будущим исследователям воспроизводимые шаги для выполнения этой процедуры в исследовательских условиях. Во-вторых, мы включили новый протокол для испытаний на растяжение нативного и хирургического интерфейса USL. Протокол испытаний на растяжение может быть использован в аналогичных исследованиях, в которых исследуются новые подходы к тканевой инженерии для усиления восстановления нативных тканей, таких как USLS. Кроме того, сама модель крысы полезна для изучения заболеваний тазового дна из-за простоты обращения / посадки, короткого срока службы и экономической эффективности по сравнению с более крупными моделями животных. Ограничения протокола включают невозможность оценить одно из основных осложнений USLS, перегиб мочеточника. Несмотря на это, в этом исследовании у нас не было случаев предполагаемого повреждения мочеточника. Еще одно соображение заключается в том, что горизонтальная ориентация таза, отношение головы маленького плода к родовому каналу и отсутствие спонтанного пролапса в модели крысы ограничивают некоторую применимость результатов к людям. Тем не менее, использование повторнородящих крыс является сильной стороной этого исследования, поскольку это является ведущим фактором риска развития СОЗ3.

Создание успешного протокола гистерэктомии и USLS у крыс Льюиса станет полезным инструментом для будущих исследователей, исследующих хирургические компоненты СОЗ, сводя к минимуму вариабельность при тестировании механического поведения USL. Хирургические модели на животных полезны тем, что они позволяют исследователям разрабатывать клинически значимые эксперименты, которые контролируют паритет, массу тела, болезни ипитание34, одновременно снижая этический риск первоначального исследования на людях. Кроме того, стандартизированные модели для СОЗ позволяют исследователям обходить ограничения сбора тканей человека. В частности, методы испытаний на растяжение, описанные в настоящем протоколе, обеспечат согласованность между исследованиями. Предыдущие модели грызунов проверяли механические свойства всей тазовой области, включая шейку матки, влагалище и множественные опорные связки таза 29,42. Описанные здесь методы позволяют измерять USL таким образом, чтобы поддерживать естественные спинальные и шейные прикрепления. Следует отметить, что методы испытаний на растяжение оценивают не только USL, но и USL в сочетании с его введением в крестец и шейку матки. Это сильная сторона исследования, поскольку оно отражает обычные силы in situ, которым подвергается связка. Мы признаем, что механическое поведение изолированной связки было бы другим, если бы она была протестирована ex vivo без ее собственных прикреплений. Это особенно верно, поскольку структуры крыс невелики и ограничивают возможность сбора образца, подходящего для тестирования ex vivo. USL действительно испытывают нагрузку в нескольких направлениях in situ, поэтому одноосный характер теста является ограничением, но использование этого метода позволяет проводить значимые сравнения между предыдущими исследованиями механики USLкрыс 29,42. Хотя в настоящее время не существует общепринятого стандартного протокола механических испытаний, эта модель станет полезным инструментом для будущих исследований в области тканевой инженерии в этой области.

Несколько этапов, описанных в этом протоколе, имеют решающее значение для здоровья и благополучия животных, а также для воспроизводимости операции USLS и последующих испытаний на растяжение. Во-первых, важно получить как анальгетик, так и противовоспалительные препараты, описанные как один только анальгетик, который оказался недостаточным для лечения боли. Профилактический антибиотик снижает риск инфекции в области хирургического вмешательства и является стандартом лечения в хирургии человека. Что касается хирургической процедуры USLS, предотвращение повреждения яичников и минимизация кровопотери имеют важное значение для успешной операции. Этапы 1.3.3 и 1.3.4 описывают отделение верхней части рога матки от соседнего яичника; Следует позаботиться о том, чтобы сохранить это рассечение на стороне рога матки, чтобы предотвратить нарушение работы нежных сосудов вокруг яичника, что может привести к чрезмерному кровотечению. Следует отметить, что другие исследователи показали, что функция яичников сохраняется после удаления рогов матки43. Более того, если яичники будут нарушены или удалены, общая архитектура коллагеновой фибриллы будет нарушена, что изменит механические свойства ее тканей44,45. После того, как рог матки безопасно отделен от яичника, существует четкая плоскость рассечения, позволяющая изолировать рог матки от окружающих жировых пакетов и сосудистой сети. Несмотря на четкую плоскость рассечения, ножки вдоль рога матки перед пересечением следует закрепить зажимом микроножницами. В отличие от хирургической практики у людей, мы обнаружили, что перевязка швов ножки гистерэктомии не нужна, так как зажим ножки перед пересечением обеспечивает адекватный гемостаз. На шаге 1.3.6 протокола описан этот тщательный процесс минимизации кровопотери. Во время гистерэктомии следует проявлять большую осторожность при идентификации мочеточников, как указано на этапах 1.3.6 и 1.3.8. Понимание анатомической близости мочеточника имеет решающее значение, поскольку одним из наиболее распространенных осложнений, связанных с USL у людей, является повреждение мочеточника46.

В заключение мы представляем новый протокол для выполнения гистерэктомии, суспензии маточно-крестцовой связки и испытания USL на растяжение на крысиной модели. Мы ожидаем, что наши результаты помогут будущим исследователям фундаментальной науки, предоставив четкое, воспроизводимое описание этих процедур и, таким образом, позволят продвинуть исследования пролапса тазовых органов.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Мы благодарим профессора Сильвию Блемкер за использование ее Instron и профессора Джорджа Христа за использование его хирургического пространства, а также держателя и рукоятки, напечатанных на 3D-принтере. Эта работа была поддержана Партнерством трансляционных исследований UVA-Coulter и Министерством обороны США (W81XWH-19-1-0157).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol prep pad BD 326895
Artificial Tear Ointment American Health Service Sales Corp PH-PARALUBE-O
Bluehill software Instron Bluehill 3
Cavicide 1 disinfectant Fisher Scientific 22 998 800
Compression platean Instron 2501-163
Cotton swabs Puritan Medical 806-WC
Gauze Sponge, 8-Ply VWR 95038-728
Mosquito Forceps Medline Industries MMDS1222115
Needle Holder Medline Industries DYND04045
Operating Scissors, 5½", Sharp American Health Service Sales Corp 4-222
Opioid Analgesic (Buprenorphine XR) Fidelis Animal Health Ethiqa XR 0.65 mg/kg SC Q72
NSAID Analgesic (Meloxicam SR) Wildlife Pharmaceuticals, LLC Meloxicam SR 1 mg/kg SC q72
PDS II, 3-0 Polydioxanone Suture, SH-1 Ethicon Z316H
PDS II, 5-0 P olydioxanone Suture, RB-1 Ethicon Z303H
Retractor Medline Industries MDS1862107
Scalpel Blade Stainless Surgical #10 Miltex 4-310
Scalpel Handle Medline Industries MDS15210
Scissor, Micro, Curved, 4.5" Westcott MDS0910311
Single Column Universal Testing System Instron 5943 S3873 1 kN force capacity, 10 N load cell
Sterile Natural Rubber Latex Gloves Accutech 91225075
Suture,Vicryl,6-0,P-3 Ethicon J492G
Tape,Umbilical,Cotton,1/8X18" Ethicon U10T
Tension and Compression Load Cell Instron 2530-10N 10N load cell (1 kgf, 2 lbf)
Veterinary surgical adhesive (skin glue) Covetrus 31477

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olsen, A. L., et al. Epidemiology of surgically managed pelvic organ prolapse and urinary incontinence. Obstetrics and Gynecology. 89 (4), 501-506 (1997).
  2. Wu, J. M., et al. Lifetime risk of stress urinary incontinence or pelvic organ prolapse surgery. Obstetrics and Gynecology. 123 (6), 1201-1206 (2014).
  3. Kenton, K., Mueller, E. R. The global burden of female pelvic floor disorders. BJU International. 98, 1-7 (2006).
  4. Herschorn, S. Female pelvic floor anatomy The pelvic floor, supporting structures, and pelvic organs. Reviews in Urology. 6, 2-10 (2004).
  5. Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D. Pelvic organ prolapse. The Lancet. 369 (9566), 1027-1038 (2007).
  6. Campbell, R. M. The anatomy and histology of the sacrouterine ligaments. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 59 (1), 1-12 (1950).
  7. Reisenauer, C., et al. The role of smooth muscle in the pathogenesis of pelvic organ prolapse - An immunohistochemical and morphometric analysis of the cervical third of the uterosacral ligament. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 19 (3), 383-389 (2008).
  8. Lavelle, R. S., Christie, A. L., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Risk of prolapse recurrence after native tissue anterior vaginal suspension procedure with intermediate to long-term followup. Journal of Urology. 195 (4), 1014-1020 (2016).
  9. Jelovsek, J. E., et al. Effect of uterosacral ligament suspension vs sacrospinous ligament fixation with or without perioperative behavioral therapy for pelvic organ vaginal prolapse on surgical outcomes and prolapse symptoms at 5 years in the OPTIMAL randomized clinical trial. JAMA - Journal of the American Medical Association. 319 (15), 1554-1565 (2018).
  10. Bradley, M. S., et al. Vaginal uterosacral ligament suspension: A retrospective cohort of absorbable and permanent suture groups. Female Pelvic Medicine & Reconstructive Surgery. 24 (3), 207-212 (2018).
  11. Cola, A., et al. Native-tissue prolapse repair: Efficacy and adverse effects of uterosacral ligaments suspension at 10-year follow up. International Journal of Gynecology and Obstetrics. , (2022).
  12. Sung, V. W., Washington, B., Raker, C. A. Costs of ambulatory care related to female pelvic floor disorders in the United States. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 202 (5), 1-4 (2010).
  13. Subak, L. L., et al. Cost of pelvic organ prolapse surgery in the United States. Obstetrics and Gynecology. 98 (4), 646-651 (2001).
  14. Siddiqui, N. Y., et al. Mesh sacrocolpopexy compared with native tissue vaginal repair: A systematic review and meta-analysis. Obstetrics & Gynecology. 125 (1), 44-55 (2015).
  15. FDA takes action to protect women's health, orders manufacturers of surgical mesh intended for transvaginal repair of pelvic organ prolapse to stop selling all devices. FDA News Release. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-takes-action-protect-womens-health-orders-manufacturers-surgical-mesh-intended-transvaginal (2019).
  16. Brincat, C. A. Pelvic organ prolapse reconsidering treatment, innovation, and failure. JAMA - Journal of the American Medical Association. 322 (11), 1047-1048 (2019).
  17. Cundiff, G. W. Surgical innovation and the US Food and Drug Administration. Female Pelvic Medicine & Reconstructive Surgery. 25 (4), 263-264 (2019).
  18. Luchristt, D., Weidner, A. C., Siddiqui, N. Y. Urinary basement membrane graft-augmented sacrospinous ligament suspension: a description of technique and short-term outcomes. International Urogynecology Journal. 33 (5), 1347-1350 (2022).
  19. Couri, B. M., et al. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics and Gynecology. 7 (3), 249-260 (2012).
  20. Mori da Cunha, M. G. M. C., et al. Animal models for pelvic organ prolapse: systematic review. International Urogynecology Journal. 32 (6), 1331-1344 (2021).
  21. Kasabwala, K., Goueli, R., Culligan, P. J. A live porcine model for robotic sacrocolpopexy training. International Urogynecology Journal. 30 (8), 1371-1375 (2019).
  22. Mansoor, A., et al. Development of an ovine model for training in vaginal surgery for pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 28 (10), 1595-1597 (2017).
  23. Liang, R., et al. Impact of prolapse meshes on the metabolism of vaginal extracellular matrix in rhesus macaque. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 212 (2), 1-7 (2015).
  24. Johannesson, L., et al. Preclinical report on allogeneic uterus transplantation in non-human primates. Human Reproduction. 28 (1), 189-198 (2013).
  25. Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
  26. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , National Academies Press. (2011).
  27. Federal Animal Welfare Regulations. National Archives. , Available from: https://www.ecfr.gov/current/title-9/chapter-l/subchapter-A/part-2/subpart-C/section-2.31 (2022).
  28. Ma, Y., et al. Knockdown of Hoxa11 in vivo in the uterosacral ligament and uterus of mice results in altered collagen and matrix metalloproteinase activity. Biology of Reproduction. 86 (4), 100 (2012).
  29. Moalli, P. A., et al. A rat model to study the structural properties of the vagina and its supportive tissues. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (1), 80-88 (2005).
  30. Yoshida, K., et al. Mechanics of cervical remodelling: Insights from rodent models of pregnancy. Interface Focus. 9 (5), 20190026 (2019).
  31. Christ, G. J., Sharma, P., Hess, W., Bour, R. Modular biofabrication platform for diverse tissue engineering applications and related method thereof. , (2020).
  32. Smith, K., Christ, G. J. Incorporation of in vitro double seeding for enhanced development of tissue engineered skeletal muscle implants. , University of Virginia. (2019).
  33. Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
  34. Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
  35. Baah-Dwomoh, A., McGuire, J., Tan, T., De Vita, R. Mechanical properties of female reproductive organs and supporting connective tissues: A review of the current state of knowledge. Applied Mechanics Reviews. 68 (6), 1-12 (2016).
  36. Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
  37. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical testing of murine tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  38. Griffin, M., et al. Biomechanical characterization of human soft tissues using indentation and tensile testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
  39. Feola, A., et al. Parity negatively impacts vaginal mechanical properties and collagen structure in rhesus macaques. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 203 (6), 1-8 (2010).
  40. Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
  41. Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology. 144, Suppl 1 146-158 (2009).
  42. Lowder, J. L., et al. Adaptations of the rat vagina in pregnancy to accommodate delivery. Obstetrics and Gynecology. 109 (1), 128-135 (2007).
  43. Koebele, S. V., et al. Hysterectomy uniquely impacts spatial memory in a rat model: A role for the nonpregnant uterus in cognitive processes. Endocrinology. 160 (1), 1-19 (2019).
  44. Kafantari, H., et al. Structural alterations in rat skin and bone collagen fibrils induced by ovariectomy. Bone. 26 (4), 349-353 (2000).
  45. Daghma, D. E. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers in bone matrix indicates bone quality in ovariectomized rat spine. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36 (3), 297-306 (2018).
  46. Manodoro, S., Frigerio, M., Milani, R., Spelzini, F. Tips and tricks for uterosacral ligament suspension: how to avoid ureteral injury. International Urogynecology Journal. 29 (1), 161-163 (2018).

Tags

Медицина выпуск 186 крыса механика тканей тазовое дно матка хирургия
Разработка модели крысы с подвеской маточно-крестцовой связки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, B. J., Jones, B. K., Turner, … More

Miller, B. J., Jones, B. K., Turner, J. S., Caliari, S. R., Vaughan, M. H. Development of a Uterosacral Ligament Suspension Rat Model. J. Vis. Exp. (186), e64311, doi:10.3791/64311 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter