Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Utvikling av en uterosacral ligament suspensjon rotte modell

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64311
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,3, 4
1Department of Chemical Engineering, University of Virginia, 2Electrophysiology Division, Abbott, 3Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Division of Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery, University of Virginia

Summary

Bekkenorganprolaps påvirker millioner av kvinner over hele verden, og likevel har noen vanlige kirurgiske inngrep feilfrekvenser så høye som 40%. Mangelen på standard dyremodeller for å undersøke denne tilstanden hindrer fremgang. Vi foreslår følgende protokoll som modell for uterosacral ligament suspensjon og in vivo strekkprøving.

Abstract

Pelvic organ prolaps (POP) er en vanlig bekkenbunnslidelse (PFD) med potensial til å påvirke kvinnens livskvalitet betydelig. Omtrent 10% -20% av kvinnene gjennomgår bekkenbunnsreparasjonskirurgi for å behandle prolaps i USA. PFD-tilfeller resulterer i en samlet årlig kostnad på 26.3 milliarder dollar bare i USA. Denne multifaktorielle tilstanden har en negativ innvirkning på livskvaliteten, og likevel har behandlingsalternativene bare gått ned i den siste tiden. Et vanlig kirurgisk alternativ er uterosacral ligament suspensjon (USLS), som vanligvis utføres ved å feste vaginalhvelvet til uterosacral ligament i bekkenet. Denne reparasjonen har en lavere forekomst av komplikasjoner sammenlignet med de med maskeforstørrelse, men er kjent for en relativt høy feilrate på opptil 40%. Tatt i betraktning mangelen på standard dyremodeller for å studere bekkenbunnsdysfunksjon, er det et presserende klinisk behov for innovasjon på dette feltet med fokus på å utvikle kostnadseffektive og tilgjengelige dyremodeller. I dette manuskriptet beskriver vi en rottemodell av USLS med komplett hysterektomi etterfulgt av fiksering av gjenværende vaginalhvelv til uterosakralligamentet. Målet med denne modellen er å etterligne prosedyren som utføres på kvinner for å kunne bruke modellen til å undersøke reparative strategier som forbedrer den mekaniske integriteten til ligamentfestet. Det er viktig at vi også beskriver utviklingen av en in situ strekkprøvingsprosedyre for å karakterisere grensesnittintegritet ved utvalgte tidspunkter etter kirurgisk inngrep. Samlet sett vil denne modellen være et nyttig verktøy for fremtidige studier som undersøker behandlingsalternativer for POP-reparasjon via USLS.

Introduction

Pelvic organ prolaps (POP) er en vanlig bekkenbunnslidelse som påvirker millioner av kvinner over hele verden med potensial til å påvirke mange aspekter av en kvinnes liv betydelig, spesielt med1 år. Spesielt vil ca 13% av kvinnene i USA gjennomgå kirurgi for prolaps eller urininkontinens2. En tilstand som er mest vanlig etter graviditet og fødsel, prolaps er preget av nedstigning av bekkenorganer, hovedsakelig de forskjellige delene av skjeden og / eller livmoren, utover deres normale posisjon i bukhulen. Dette fører til plagsomme symptomer på vaginal bule eller trykk, tarm, blære og seksuell dysfunksjon, og generelt redusert livskvalitet. Andre risikofaktorer for POP inkluderer fedme, tobakksbruk, kronisk hoste og forstoppelse3.

Hos friske kvinner støttes bekkenbunnsorganene av levator ani-musklene, uterosacral ligaments (USL), kardinalleddbånd, bindevevsfester til bekkensideveggen og de distale strukturer i perineallegemet 4,5. USL er blant de viktigste apikale støttestrukturene for både uterus og apikal vagina, og brukes derfor ofte i kirurgisk korreksjon av POP (figur 1). Strukturell støtte fra USL stammer fra det tette kollagenøse bindevevet i sakralområdet som overgår til tett pakket glatt muskulatur. På grunn av denne kompositoriske gradienten blir USL sammenvevd med livmor- og vaginalmuskulaturen for å gi solid støtte til bekkenorganene 6,7. I uterosacral ligament suspensjon (USLS), er USL festet til vaginalhvelvet etter en hysterektomi, gjenopprette skjeden og de omkringliggende strukturer til sin anatomiske posisjon i bukrommet. Imidlertid, uavhengig av en transvaginal eller laparoskopisk rute, er USLS-prosedyren plaget av en relativt høy feilrate på opptil 40% i noen studier 8,9. Tilbakefallsraten av plagsomme vaginale bulesymptomer 5 år etter reparasjon for apikal romprolaps, som USL, var ca. 40 % i en stor multisenter randomisert kontrollert studie9. I samme studie var rebehandling for tilbakevendende prolaps ved 5 år ca. 10%. Mekanismen bak denne høye feilraten er ikke studert, men å gjenopprette skjeden og de omkringliggende strukturene til deres anatomiske posisjon krever suturplassering i det tette kollagenøse området av USL10,11 i stedet for glatt muskelregion. Derfor kan den høye feilraten skyldes den mekaniske og kompositoriske feilpasningen av det kirurgisk dannede vagina-USL-grensesnittet sammenlignet med den komplette integrasjonen sett i det opprinnelige cervikal-USL-vedlegget.

Den økonomiske effekten av å behandle disse lidelsene er også bemerkelsesverdig, med omtrent $ 300 millioner brukt årlig i USA på ambulant omsorg12, og mer enn $ 1 milliard brukt årlig i direkte kostnader for kirurgiske prosedyrer13. Til tross for de enorme økonomiske ressursene som er dedikert til å behandle disse forholdene, forblir komplikasjonene som oppstår fra mange prolapsoperasjoner nedslående. For eksempel tilbyr polypropylennettbaserte apikale prolapsreparasjoner, som sacrocolpopexy, høyere suksessrate sammenlignet med innfødte vevsreparasjoner14, men på bekostning av potensielle komplikasjoner som maskeeksponering eller erosjon. FDA mottok nesten 3000 klager relatert til maskekomplikasjoner mellom 2008 og 2010 alene. Dette kulminerte i en ordre fra FDA om å stoppe produksjon og salg av alle transvaginalt plasserte mesh-produkter for POP i april 201915. Derfor er det et sterkt klinisk behov for andre materialer enn polypropylen, og modeller for å teste dem, som kan øke reparasjoner av vevsprolaps og øke suksessraten sammenlignet med tradisjonelle teknikker med sutur alene.

Siden FDA-kunngjøringen i 2019 har de fleste bekkenkirurger sluttet å bruke transvaginalt plassert nett for prolapsreparasjoner, noe som får etterforskere til å søke nye vevstekniske tilnærminger for å øke innfødte vevsreparasjoner16,17,18 som med mesenkymale stromale celler (MSC)9,20 . Med dette skiftet i fokus er det et presserende behov for foredling av dyremodeller som kan bistå med utvikling av nye materialer; Utfordringen i denne prosessen er å balansere klinisk relevans med kostnad. For dette formål har grunnleggende vitenskap og kliniske etterforskere som studerer bekkenorganprolaps benyttet seg av flere dyremodeller så langt, inkludert rotter, mus, kaniner, sauer, svin og ikke-menneskelige primater19. Prosessen med å identifisere en optimal dyremodell er utfordrende, da mennesker er tobente, ikke har hale og har en traumatisk fødselsprosess sammenlignet med andre pattedyrarter20. Svin21 har blitt brukt til å simulere robotisk sacrocolpopexy, mens sauer har blitt brukt til å simulere vaginal prolaps reparasjoner22. Selv om disse dyremodellene er klinisk relevante, er de begrenset i gjennomførbarhet av kostnader og vedlikehold. Ikke-menneskelige primater har blitt brukt til å studere patogenesen av prolaps; Spesielt ekornaper er en av de eneste andre artene enn mennesker som kan utvikle spontan prolaps, noe som gjør dem til en av de mest relevante dyremodellene20. Ikke-menneskelige primater har også blitt brukt til å studere gynekologiske kirurgiske prosedyrer som sacrocolpopexy23 og livmortransplantasjon24. I likhet med deres saue- og svinekolleger er den primære begrensningen for ikke-menneskelige primater som en dyremodell for prolaps kostnaden for vedlikehold, stell og ombordstigning19.

Selv om gnagerbekkenet er orientert horisontalt med et mye mindre hode-til-fødsel-kanalstørrelsesforhold sammenlignet med mennesker19, er rotter egnet for små dyrestudier av USLS-kirurgi siden de har lignende USL-anatomi, cellularitet, histologisk arkitektur og matrisesammensetning sammenlignet med den menneskelige USL25. Videre er de fordelaktige når det gjelder vedlikehold og ombordstigning. Til tross for disse fordelaktige egenskapene, er det ingen publiserte rapporter om en rottemodell for USLS-reparasjon. Derfor er målet å beskrive en protokoll for hysterektomi og USLS hos flergangsfødende Lewis-rotte. Denne protokollen vil være gunstig for etterforskere som tar sikte på å studere patofysiologi og kirurgiske komponenter av POP ved hjelp av denne tilgjengelige dyremodellen.

Figure 1
Figur 1 Bekkenorganprolaps. (A) Den normale orienteringen av organer i bukhulen og (B) den dramatiske organnedstigningen når prolaps oppstår. Etter hysterektomi, (C) uterosacral ligament suspensjon gjenoppretter skjeden og omkringliggende strukturer til riktig anatomisk posisjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Følg alle retningslinjer fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), og få godkjenning for alle dyreprosedyrer før du begynner. Krav til aseptisk kirurgisk teknikk finnes i veilederen26 og dyrevelferdsforskriften27. Studien ble godkjent av University of Virginia Institutional Animal Care and Use Committee protokollnummer 4332-11-20. Få flergangsfødende (to kull) kvinnelige oppdrettere. Rotter skal være plassert i et vivarium akkreditert av American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care og utstyrt med mat og vann ad libitum. Dyrene i denne studien var Lewis-rotter hentet fra Charles og var mellom 4 og 6 måneder gamle for å imøtekomme kravet om to kull. Dyrene ble opprettholdt på en 12 timers lys-mørk syklus.

1. Bekkenorgan prolaps reparasjon ved hjelp av uterosacral ligament suspensjon

  1. Utstyr og kirurgisk område forberedelse for levende dyr kirurgi
    1. Forbered operasjonsområdet slik at operasjonsavdelingen varmes opp til 37 °C ved hjelp av resirkulerende varmtvannsvarmeputer sammen med en steril vanntett pute. Sørg for sterilitet i operasjonsstyret og operasjonsområdet ved hjelp av et blekemiddelfritt overflatedesinfeksjonsmiddel etterfulgt av 70% etanolserviett.
    2. Bruk autoklavvarmesterilisering for å sterilisere alle autoklavsikre forsyninger, inkludert kirurgiske instrumenter, kirurgiske svamper (gasbind), bomullspinne og engangsdrapering. Få sterile pakkede kirurgiske hansker.
    3. Få tak i elektriske klippere, oftalmisk salve, etanolservietter, bomullspinner og jodoppløsning, sammen med sterilt pakket skalpellblad og suturer, og plasser på arbeidsbenken.
  2. Dyreforberedelse for levende dyrekirurgi
    1. Legg dyret forsiktig i et anestesikammer som leveres med 2% isofluran og vei dyret etter at riktig anestesiplan er nådd. Riktig bedøvelse bekreftes når dyret ikke reagerer på en tåklemme.
    2. Plasser dyret på operasjonsbrettet i utsatt stilling med nesen sikkert i anestesikjeglen som følger med 2% isofluran. Påfør oftalmisk salve til hvert av dyrets øyne.
    3. Administrer opioidanalgetika og NSAID-analgetika subkutant (materialfortegnelse).
    4. Legg dyret i ryggleie, som vist i figur 2, og barber av bukpelsen fra xiphoidprosessen ned til urinrørsåpningen (8 cm x 4 cm). Steriliser magen med tre ladninger av jod og alkohol for å forberede snittstedet.
      MERK: Hvis barbering resulterer i blødning, oppnå hemostase med trykk før du forbereder huden med jod og alkohol prep pad. Oppretthold jod på huden i 30 s.
    5. Hvis det ikke er noen kirurgisk assistent tilgjengelig, legg sterile forsyninger og instrumenter på et sterilt instrumentbrett, inkludert sterile bomullspinner, drapering(er), svamper (gasbind), kirurgisk blad, suturer og kirurgisk markør (valgfritt). Hvis en kirurgisk assistent er tilgjengelig, kan dette trinnet utelates, og assistenten kan levere de sterile instrumentene i henhold til trinn 1.3.1.
  3. Hysterektomi og uterosacral ligament suspensjon (USLS)
    1. Ta på deg en kirurgisk kjole, hodeplagg, maske og sterile hansker. Draper dyret med et sterilt felt, slik at bare magen blir utsatt.
    2. Lag et 7 cm snitt nedover linea alba fra like under xiphoidprosessen til den nedre brystvortelinjen ved hjelp av et skalpellblad. Snittet skal ende ~ 0,5-1,0 cm rostral fra urinrøret åpningen. Deretter gjør du et snitt gjennom muskellaget under. Unngå blodkaret i bukveggen for å forhindre blødning.
    3. Monter abdominalretraktoren og inspiser bukhulen (figur 3A). Bruk iristang, finn forsiktig venstre livmorhorn. Livmoren er dypt inne i tarmen, som ofte er strukturen først oppstått ved å komme inn i bukhulen. Det er fordelaktig å først identifisere eggstokken (figur 3B) og den tilhørende eggstokkfettputen.
    4. Løft forsiktig venstre livmorhorn med en griper eller myggklemme og begynn hysterektomi ved å ligere hornet under eggstokken og ovidukten ved hjelp av en myggklemme. Eggstokkene er delikate strukturer og blir lett skadet eller devaskularisert med manipulasjon. Vær forsiktig når du løfter livmorhornene; Ta tak i hornet i trygg avstand fra eggstokken for å oppnå dette.
    5. Fortsett hysterektomi ved å klemme og trimme tilstøtende vaskulatur, bindevev og fett fra livmorhornet ved hjelp av mikrosaks. Klem bindevevet før fjerning for å redusere blødning. Plasser klemmene så nær livmorgrensesnittet som mulig, helt ned til det uterokerviske krysset (også betegnet som hornbifurkasjon).
    6. Klem over livmorhornet nær bifurkasjonspunktet ved hjelp av myggtang (figur 4A-C). Excise det ipsilaterale hornet bare cephalad til klemmen for å unngå blødning. Dette ligger mellom utero-cervical krysset (bare rostral til livmorhalsen) og utero-tubal ligeringspunktet. Vaginalhvelvet vil forbli etter hysterektomi (figur 4D).
      MERK: På grunn av rottekarets lille kaliber var ligering av livmorstubbene med en midlertidig klemme tilstrekkelig for denne operasjonen. Imidlertid kan denne teknikken modifiseres etter behov med enten tetting av pediklene med elektrokauterisering eller suturligering.
    7. Gjenta trinn 1.3.3-1.3.6 på høyre livmorhorn for å utføre en total hysterektomi.
    8. Juster abdominalretractoren for å eksponere det nedre bekkenet. Inspiser det eksponerte vaginale hvelvet og bekkenbunnsstøtten ligamental og bindevev, som kan ses festet til skjeden og livmorhalsen. Hvis mulig, identifiser urineren bilateralt, som bare er medialt til eggstokkene.
    9. Identifiser uterosakralleddbåndene28,29, vist i figur 5A, som finnes festet til livmorhalsen like under de resterende stubbene av livmorhornene (vaginalhvelvet). Ligamentet spores i en cephalad-medial orientering mot sakrummet.
    10. Bruk en 3-0 polydiaxanon sutur på en liten, konisk nål, legg en søm gjennom venstre uterosacral ligament. Plasser sømmen høyt på leddbåndet, nær korsbenet.
    11. Slep i sømmen for å sikre at den har fanget uterosacral ligamentet - USL-strukturen setter inn i livmorhalsen med opprinnelsen dykking bak endetarmen der den festes til sakrummet. Igjen, identifiser urineren for å sikre at den ikke har blitt innlemmet i eller knekket med uterosacral søm.
    12. Pass deretter venstre polydiaxanonsøm gjennom venstre aspekt av vaginalhvelvet (figur 5B), med forsiktighet for å innlemme både de fremre og bakre aspektene av vaginalmansjetten. Gjenta trinnene for å fullføre USLS-prosedyren på høyre side. Flere masker kan plasseres bilateralt, om ønskelig.
    13. Når uterosacralmaskene er plassert bilateralt, knyt suturen sikkert med en firkantet knute, som vist i figur 5C, slik at vaginalhvelvet er forhøyet cephalad mot sakrummet; Dette fullfører uterosacral ligament suspensjon.
  4. Lukker operasjonssåret
    1. Bytt bukinnholdet tilbake til sin anatomiske posisjon i bukhulen. Lukk de dype lagene i bukveggen (peritoneum, fascia, muskel) med kontinuerlig suturmønster på 4-0 til 6-0 polyglactin 910 eller polydiaxanon sutur.
    2. Lukk huden med en løpende subkutulær (eller avbrutt) søm på 4-0 til 6-0 polydiaxanon eller polyglaktin 910. Administrer antibiotika subkutant etter behov for infeksjonsprofylakse på operasjonsstedet.
    3. Utfør postoperativ overvåking til dyret har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Ikke returner dyret til sosialboliger før det er fullstendig gjenopprettet.

Figure 2
Figur 2: Dyrs forberedelse til levende kirurgi. Fjerning av pels fra området rundt snittstedet er nødvendig for riktig aseptisk teknikk. Området vist i panelene (A) og (B) er retningslinjer. Forskere bør fjerne nok hår slik at sterile instrumenter ikke kommer i kontakt med hår under operasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bevare eggstokkene. Livmorhornene er vanligvis ikke synlige når magen først åpnes, som vist i (A). Når et horn er lokalisert og fulgt for å finne (B) eggstokken og ovidukten der de kobles til hornet, kan toppen av hornet klemmes, og hornet skilles for å begynne hysterektomi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Fjerne livmorhornene. Hysterektomi hos rotter involverer (A) begge livmorhornene (B) klemmet ved det uterokerviske veikrysset og (C) skåret ut. Vaginalhvelvet fra hvert horn forblir med (D) livmorhals-/livmorinstubben (pilen) som forbinder dem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Uterosacral ligament suspensjon. (A) Orientering av uterosacral ligamentene i forhold til de opprettede vaginale hvelvstrukturene. Når du plasserer suturer for reparasjon av uterosacral ligament suspensjon (USLS), (B) suturer fanger uterosacral ligament og passerer deretter gjennom både de fremre og bakre aspektene av vaginalmansjetten. (C) Festet til uterosacral ligament, er vaginalhvelvet nå forhøyet cephalad mot sacrum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Uniaxial strekkprøving

MERK: Testsystemet og programvaren som brukes, ble brukt i henhold til produsentens retningslinjer for kalibrering og testing. All testing foregikk ved 22 °C.

  1. Forberedelse av prøver
    1. Avlive rotta ved hjelp av en IACUC-godkjent farmakologisk prosedyre. Sikre døden via sekundær fysisk metode. Her ble CO2 -inhalasjon brukt etterfulgt av hjertepunksjon. Utsett vaginalhvelvet som forberedelse til strekkmekanisk testing. I den nåværende studien, utfør strekkprøving på innfødte uterosacral ligamenter (kontroll), samt på dyr som hadde gjennomgått uterosacral ligament suspensjon som beskrevet ovenfor (POP).
    2. Test leddbånd in situ 24 uker etter operasjonen. Et terminalt tidspunkt på minimum 8 uker er foreslått for å tillate fullstendig reabsorpsjon av suturene.
      1. Etter human dødshjelp, gjør et snitt nedover linea alba for å avsløre magen.
      2. Begynn å dissekere fettvevet til vaginalhvelvet er synlig. Fortsett å dissekere bukfettputene til de intakte USL-ene er tydelig synlige (kontrolldyr, figur 6A) eller overgangen mellom uterosacral ligament og vaginalhvelvet er synlig (POP-dyr, figur 6C). Vær forsiktig med å ikke trekke i krysset for å fjerne fettvev, men bruk heller forsiktige kutt med mikrosaks for å opprettholde konsistens mellom prøvene.
      3. Ved hjelp av en fleksibel linjal måler du avstanden mellom uterosacral innsetting (bakre til endetarmen) og vaginalhvelvet. Denne verdien er den opprinnelige lengden på vevet.
        MERK: Den opprinnelige lengden på vevet, målerlengden, for kontroll-USL målte 13,4 ± 0,5 mm mens målerlengden for USL-reparasjon målte 12,8 ± 0,4 mm.
      4. Trådnavlestreng bak intakt USL (kontroll, figur 6B) eller USLS-krysset (POP, figur 6D) slik at vevet er sentrert på navlestrengen. Mål høyden og bredden på vevet der det krysser med navlebåndet ved hjelp av digitale kalipere. Disse verdiene vil bli brukt til å beregne tverrsnittsareal.
      5. Fest en stor kompresjonsplate (materialfortegnelse) via sokkeladapteren og plasser dyret oppå slik at prøven er sentrert under gripeholderen.
  2. Strekkprøving
    1. Programmer strekkprøvingsregimet i programvaren: forhåndsinnlasting, forhåndskondisjonering, trekk til feil. Dette følger tidligere bekkenbunn29 og reproduktivt vev30 mekaniske testprotokoller.
    2. Sett opp instrumentet som forberedelse til strekkprøving. For den nåværende studien, bruk en 10 N lastcelle, et 3D-trykt grep og en baseadapter for å feste en kompresjonsplate som vist i figur 7.
      MERK: Ethvert basisoppsett som kan støtte dyrets fulle størrelse er akseptabelt. Bruk et grep som kan holde navlebåndet sikkert. En tilpasset 3D-printet holder og grep fra tidligere studier31,32 ble brukt i denne testingen. STL-filer ble inkludert som tilleggsfiler.
      1. Plasser dyret slik at prøven er sentrert under grepet (figur 8A). Immobiliser bekkenregionen rundt prøven ved å feste dyret til platen (figur 8B).
      2. Senk lastcellen slik at halene på navlebåndet lett når grepet. Fest navlebåndet i grepet, og la båndet være slakk for å unngå prøvemanipulering.
    3. Åpne prekondisjoneringstesten i programvaregrensesnittet, og merk testen med eksempelnavnet. Kontroller at forhåndskondisjoneringsmetoden inkluderer trinnet før innlasting.
    4. Klikk for å starte prekondisjoneringstesten, som vil forhåndslaste prøven ved 0,015 N. Når forspenningskraften er stabil, vil testen forutse prøven med en forlengelseshastighet på 0,1 mm / s i 30 s. La vevet hvile i 1 min. Mens du venter, laster du trekk-til-feil-testregimet.
      MERK: Forspenningskraften kan variere avhengig av instrumentbegrensningene og testforholdene. Se tidligere studier hvor rapportert forspenning varierer fra 0,015 N til 0,1 N 29,33,34,35,36.
    5. Åpne testregimet som er programmert til å trekke til feil. Merk testen med prøvenavnet og klikk på OK for å komme til neste vindu. Skriv inn målerlengden på prøven, og klikk deretter på Neste for å gå over til testsiden.
    6. Balanser alle og klikk på Start. La testen kjøre med en forlengelseshastighet på 0,1 mm / s til vevet har blitt trukket til svikt. Testen vil produsere data om belastningsforskyvning.
  3. Beregning av spenning, tøyning og modul for strekkprøving
    1. Ved hjelp av lastforskyvningsdataene, tverrsnittsarealet og målerlengden fra prøven, beregner du spenningen (MPa) og belastningen (%) som tidligere rapportert 37,38,39,40,41. Bruk ligning 1 og ligning 2 vist nedenfor. Merk at strekking av båndet under testing også bør tas hensyn til i disse beregningene.
      Equation 1     Ligning 1
      Equation 2     Ligning 2
      1. Fra last-forskyvningskurven (figur 9A, D) beregner du stivhet (lineær stigningstall, N/mm) og endelig belastning. Fra spenningstøyningskurven beregner du tangentmodulen (lineær helling, MPa) og den ultimate spenningen. Det lineære området av spenningstøyningskurven er notert i figur 9B,E med den beregnede tangentmodulen fra denne regionen vist i figur 9C,F for begge eksperimentelle grupper.
        MERK: For både stivhet og tangensmodul, identifiser den lineære delen ved å velge et vindu med punkter som maksimerer R2-verdien for en lineær regresjon37,41.

Figure 6
Figur 6: Prøveklargjøring for uniaxial strekkprøving. (A) De eksponerte kontroll-USLene før (B) navlebåndet er tredd bak vevet. (C) USL-vaginal vault junction etter fullstendig oppløsning av suturene med (B) navlestrengen gjenget bak vevet som forberedelse til strekkprøving. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Det mekaniske testsystemet . (A) Testsystemet i strekkprøvingsmodus brukt med (B) 3D-trykt holder og (C) 3D-trykt prøvegrep komplett med en strukturert stripe for å forbedre grepet. Konfigurasjon av brikkene vist i panel (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Oppsett av strekkprøving . (A) Prøven er sentrert under grepet og holderen. (B) Dyret og vevet som omgir prøven, holdes stasjonært før starten av strekkprøven. Som vist ved det innfelte bildet, er sikring av det omkringliggende vevet viktig for å isolere vevet av interesse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Eksempel på utgang og analyse av strekktestdata. (A) Last-forskyvningskurven for en kontrollprøve etterfulgt av (B) spenningsbelastningsanalysen og (C) hellingen til linjekurvetilpasningsligningen som viser tangentmodulen i MPa. (D-F) viser samme prosess for en USLS-prøve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

Kirurgisk gjennomførbarhet og plassering av uterosacral sutur
Det var ingen intraoperative komplikasjoner relatert til hysterektomi eller uterosacral ligamentsuspensjon hos noen av dyrene. Det var minimal blødning under fjerning av livmorhornene, forutsatt at den tilstøtende vaskulaturen ble klemt fast før fjerning. Begrenset blødning tillot god visualisering av uterosacral ligamenter for suturplassering og forhindret intraoperativ tarm, endetarm, ureteral eller blæreskade. Etter suturplassering hindret det nydannede USL-vaginalhvelvkrysset bevegelse av cervikal/uterinstubben som vist i figur 5C. I løpet av de tre første postoperative dagene ble dyrene kontrollert daglig, og deretter annenhver uke til forsøkets slutt. Med opioider med utvidet frisetting og NSAID-analgetika administrert på operasjonstidspunktet, ble ytterligere analgetika funnet å være unødvendig. Basert på vår erfaring med 16 dyreoperasjoner (n = 8 for både kontroll- og USLS-gruppen), bør det forventes et vekttap den første uken etter kirurgi med et gjennomsnittlig tap på 5,7 ± 1,4 % fra operasjonsdagvekt. Som forventet gikk rottene sakte opp i vekt i løpet av de påfølgende 23 ukene, med en gjennomsnittlig vektøkning på 15,1 ± 4,5% i løpet av forsøket.

Mekanisk testing av USLS-reparasjonen
For å demonstrere funksjonaliteten til USLS-reparasjonen ble det utført uniaxial strekkprøving. Etter avliving av dyret ved valgt postoperativ tidsperiode, 24 uker i denne studien, bør operasjonsområdet dissekeres nøye for å visualisere USL-vaginalhvelvkrysset som vist i figur 6A. Sammenlignet med andre metoder for å teste rotte USL sammen med andre støttestrukturer og bekkenorganer29,42, er metoden beskrevet her den første som tester rotte USL på en isolert måte. Navlestrengen som ble brukt i denne studien ble strategisk valgt på grunn av sin fleksibilitet, da båndoverensstemmelsen tillot minimal forstyrrelse av vevet under forberedelse av strekkprøving. Lastforskyvningsdata må derfor justeres for å ta hensyn til den lille mengden strekk som navlebåndet bidrar med. Figur 9 gir et eksempel på data innhentet via strekkprøving med figur 9A som et eksempel på et typisk spenningsbelastningsplott. Rapportering av spenningsbelastningsdata anbefales da denne informasjonen er normalisert og uavhengig av størrelsen på prøvene34 og bedre kan sammenlignes på tvers av studier. For det intakte uterosacralligamentet rapporterer vi strukturelle egenskaper som ultimate load (2,9 ± 0,5 N) og stivhet (0,4 ± 0,1 N / mm) samt normaliserte materialegenskaper som ultimate stress (2,1 ± 0,4 MPa), ultimate belastning (1,6 ± 0,5) og tangentmodul (4,0 ± 1,1 MPa). I de uniaxiale testene utført på rottens reproduktive organer og alle deres støttende vevsforbindelser av Moalli et al., rapporterte de en endelig belastning ved svikt (13,2 ± 1,1 N) og stivhet (2,9 ± 0,9 N / mm) høyere enn den isolerte USL29. Arbeidet utført av Moalli et al. og annen litteratur34,35 nevner den høye variasjonen mellom testede prøver som vist i dataene som presenteres her. For reparasjon av uterosacral ligament suspensjon fant vi at alle strukturelle materialegenskaper (stivhet, 0,33 ± 0,13 N / mm; ultimate belastning, 2,6 ± 1,3 N) og normaliserte materialegenskaper (ultimate stress, 1,8 ± 0,7 MPa; ultimate belastning 1,3 ± 0,3; tangentmodul, 3,0 ± 0,9 MPa) var lavere enn den opprinnelige USL.

Discussion

Protokollen er kjent for flere fordeler. Så vidt vi vet, er det den første publiserte beskrivelsen av USLS i rottemodellen og vil gi fremtidige etterforskere reproduserbare trinn for å utføre denne prosedyren i forskningsmiljøet. For det andre inkluderer vi en ny protokoll for strekkprøving av det opprinnelige og kirurgiske grensesnittet til USL. Strekkprøvingsprotokollen kan brukes i lignende studier som undersøker nye vevstekniske tilnærminger for å øke innfødte vevsreparasjoner som USLS. Videre er rottemodellen i seg selv nyttig for studier av bekkenbunnsplager på grunn av enkel håndtering/ombordstigning, kort levetid og kostnadseffektivitet sammenlignet med større dyremodeller. Begrensninger i protokollen inkluderer manglende evne til å vurdere en av de viktigste komplikasjonene ved USLS, ureteral kinking. Til tross for dette hadde vi ingen tilfeller av antatt ureterskade i denne studien. En annen vurdering er at den horisontale orienteringen av bekkenet, forholdet mellom små foster og fødselskanal og mangel på spontan prolaps i rottemodellen begrenser noen anvendelighet av resultater for mennesker. Imidlertid er bruken av flergangsrotter en styrke ved denne studien, siden dette står for den ledende risikofaktoren i utviklingen av POP3.

Etableringen av en vellykket protokoll for hysterektomi og USLS i Lewis-rotta vil være et nyttig verktøy for fremtidige forskere som undersøker kirurgiske komponenter i POP, samtidig som variasjonen i testing av USLs mekaniske oppførsel minimeres. Kirurgiske dyremodeller er fordelaktige ved at de tillater forskere å designe klinisk relevante eksperimenter som kontrollerer for paritet, kroppsmasse, sykdom og ernæring34 samtidig som den etiske risikoen for innledende studier hos mennesker reduseres. Videre tillater standardiserte modeller for POP forskere å omgå begrensningene i menneskelig vevsinnsamling. Spesielt vil strekkprøvingsmetodene beskrevet i denne protokollen muliggjøre konsistens mellom studier. Tidligere gnagermodeller testet de mekaniske egenskapene til hele bekkenregionen, som inkluderer livmorhalsen, skjeden og de flere bekkenstøttebåndene29,42. Metodene beskrevet her tillater måling av USL på en måte som opprettholder de opprinnelige spinal- og cervikale vedleggene. Det skal bemerkes at strekkprøvingsmetodene ikke vurderer USL alene, men heller USL i kombinasjon med innsetting i sakrum og livmorhals. Dette er en styrke ved studien, da den gjenspeiler de vanlige in situ-kreftene som ligamentet blir utsatt for. Vi erkjenner at den mekaniske oppførselen til det isolerte ligamentet ville være annerledes hvis det ble testet ex vivo uten sine opprinnelige vedlegg. Dette gjelder spesielt siden rottestrukturene er små og begrenser muligheten for å samle en prøve som er egnet for ex vivo-testing. USL-ene opplever lasting i flere retninger in situ, så testens uniaxiale natur er en begrensning, men bruk av denne metoden gir meningsfulle sammenligninger mellom tidligere studier av rotte USL-mekanikk29,42. Selv om det for øyeblikket ikke er noen allment akseptert standard mekanisk testprotokoll, vil denne modellen være et nyttig verktøy for fremtidige vevstekniske studier på feltet.

Flere trinn beskrevet i denne protokollen er kritiske for dyrenes helse og velvære, samt reproduserbarheten til USLS-operasjonen og påfølgende strekkprøving. For det første er det viktig å skaffe både smertestillende og antiinflammatoriske legemidler beskrevet som smertestillende alene ble funnet å være utilstrekkelig for smertebehandling. Det profylaktiske antibiotikumet reduserer risikoen for infeksjon på operasjonsstedet og er standarden på omsorg ved menneskelig kirurgi. Når det gjelder USLS kirurgisk prosedyre, unngå skade på eggstokkene og minimere blodtap er avgjørende for en vellykket operasjon. Trinn 1.3.3 og 1.3.4 beskriver å skille toppen av livmorhornet fra den tilstøtende eggstokken; Det må utvises forsiktighet for å opprettholde denne disseksjonen på siden av livmorhornet for å forhindre forstyrrelse av delikate kar rundt eggstokken, noe som kan føre til overdreven blødning. Av notatet har andre etterforskere vist at ovariefunksjonen er bevart etter fjerning av livmorhornene43. Videre, hvis eggstokkene blir forstyrret eller fjernet, vil den generelle kollagenfibrilarkitekturen bli forstyrret, og endre de mekaniske egenskapene til vevet44,45. Når livmorhornet er trygt skilt fra eggstokken, er det et klart disseksjonsplan som tillater isolering av livmorhornet fra de omkringliggende fettputene og vaskulaturen. Til tross for det klare disseksjonsplanet, bør pediklene langs livmorhornet sikres med en klemme før transeksjon med mikrosaks. I motsetning til kirurgisk praksis hos mennesker har vi funnet at suturligering av hysterektomipediklene er unødvendig, da klemming av pedicle før transeksjon sikrer tilstrekkelig hemostase. Trinn 1.3.6 i protokollen beskriver denne forsiktige prosessen for å minimere blodtap. Som hysterektomi blir utført, bør stor forsiktighet utvises for å identifisere urinlederne som nevnt i trinn 1.3.6 og 1.3.8. Å forstå den anatomiske nærheten til urineren er kritisk, da en av de vanligste komplikasjonene forbundet med USL hos mennesker er ureteral skade46.

Avslutningsvis presenterer vi en ny protokoll for å utføre hysterektomi, uterosacral ligamentsuspensjon og strekkprøving av USL i en rottemodell. Vi forventer at våre funn vil hjelpe fremtidige grunnvitenskapelige etterforskere ved å gi en klar, reproduserbar beskrivelse av disse prosedyrene og dermed tillate fremskritt av bekkenorganprolapsforskning.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker professor Silvia Blemker for bruk av hennes Instron og Prof. George Christ for bruk av hans kirurgiske plass, samt den 3D-printede holderen og grepet. Dette arbeidet ble støttet av UVA-Coulter Translational Research Partnership og DoD (W81XWH-19-1-0157).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol prep pad BD 326895
Artificial Tear Ointment American Health Service Sales Corp PH-PARALUBE-O
Bluehill software Instron Bluehill 3
Cavicide 1 disinfectant Fisher Scientific 22 998 800
Compression platean Instron 2501-163
Cotton swabs Puritan Medical 806-WC
Gauze Sponge, 8-Ply VWR 95038-728
Mosquito Forceps Medline Industries MMDS1222115
Needle Holder Medline Industries DYND04045
Operating Scissors, 5½", Sharp American Health Service Sales Corp 4-222
Opioid Analgesic (Buprenorphine XR) Fidelis Animal Health Ethiqa XR 0.65 mg/kg SC Q72
NSAID Analgesic (Meloxicam SR) Wildlife Pharmaceuticals, LLC Meloxicam SR 1 mg/kg SC q72
PDS II, 3-0 Polydioxanone Suture, SH-1 Ethicon Z316H
PDS II, 5-0 P olydioxanone Suture, RB-1 Ethicon Z303H
Retractor Medline Industries MDS1862107
Scalpel Blade Stainless Surgical #10 Miltex 4-310
Scalpel Handle Medline Industries MDS15210
Scissor, Micro, Curved, 4.5" Westcott MDS0910311
Single Column Universal Testing System Instron 5943 S3873 1 kN force capacity, 10 N load cell
Sterile Natural Rubber Latex Gloves Accutech 91225075
Suture,Vicryl,6-0,P-3 Ethicon J492G
Tape,Umbilical,Cotton,1/8X18" Ethicon U10T
Tension and Compression Load Cell Instron 2530-10N 10N load cell (1 kgf, 2 lbf)
Veterinary surgical adhesive (skin glue) Covetrus 31477

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olsen, A. L., et al. Epidemiology of surgically managed pelvic organ prolapse and urinary incontinence. Obstetrics and Gynecology. 89 (4), 501-506 (1997).
  2. Wu, J. M., et al. Lifetime risk of stress urinary incontinence or pelvic organ prolapse surgery. Obstetrics and Gynecology. 123 (6), 1201-1206 (2014).
  3. Kenton, K., Mueller, E. R. The global burden of female pelvic floor disorders. BJU International. 98, 1-7 (2006).
  4. Herschorn, S. Female pelvic floor anatomy The pelvic floor, supporting structures, and pelvic organs. Reviews in Urology. 6, 2-10 (2004).
  5. Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D. Pelvic organ prolapse. The Lancet. 369 (9566), 1027-1038 (2007).
  6. Campbell, R. M. The anatomy and histology of the sacrouterine ligaments. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 59 (1), 1-12 (1950).
  7. Reisenauer, C., et al. The role of smooth muscle in the pathogenesis of pelvic organ prolapse - An immunohistochemical and morphometric analysis of the cervical third of the uterosacral ligament. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 19 (3), 383-389 (2008).
  8. Lavelle, R. S., Christie, A. L., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Risk of prolapse recurrence after native tissue anterior vaginal suspension procedure with intermediate to long-term followup. Journal of Urology. 195 (4), 1014-1020 (2016).
  9. Jelovsek, J. E., et al. Effect of uterosacral ligament suspension vs sacrospinous ligament fixation with or without perioperative behavioral therapy for pelvic organ vaginal prolapse on surgical outcomes and prolapse symptoms at 5 years in the OPTIMAL randomized clinical trial. JAMA - Journal of the American Medical Association. 319 (15), 1554-1565 (2018).
  10. Bradley, M. S., et al. Vaginal uterosacral ligament suspension: A retrospective cohort of absorbable and permanent suture groups. Female Pelvic Medicine & Reconstructive Surgery. 24 (3), 207-212 (2018).
  11. Cola, A., et al. Native-tissue prolapse repair: Efficacy and adverse effects of uterosacral ligaments suspension at 10-year follow up. International Journal of Gynecology and Obstetrics. , (2022).
  12. Sung, V. W., Washington, B., Raker, C. A. Costs of ambulatory care related to female pelvic floor disorders in the United States. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 202 (5), 1-4 (2010).
  13. Subak, L. L., et al. Cost of pelvic organ prolapse surgery in the United States. Obstetrics and Gynecology. 98 (4), 646-651 (2001).
  14. Siddiqui, N. Y., et al. Mesh sacrocolpopexy compared with native tissue vaginal repair: A systematic review and meta-analysis. Obstetrics & Gynecology. 125 (1), 44-55 (2015).
  15. FDA takes action to protect women's health, orders manufacturers of surgical mesh intended for transvaginal repair of pelvic organ prolapse to stop selling all devices. FDA News Release. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-takes-action-protect-womens-health-orders-manufacturers-surgical-mesh-intended-transvaginal (2019).
  16. Brincat, C. A. Pelvic organ prolapse reconsidering treatment, innovation, and failure. JAMA - Journal of the American Medical Association. 322 (11), 1047-1048 (2019).
  17. Cundiff, G. W. Surgical innovation and the US Food and Drug Administration. Female Pelvic Medicine & Reconstructive Surgery. 25 (4), 263-264 (2019).
  18. Luchristt, D., Weidner, A. C., Siddiqui, N. Y. Urinary basement membrane graft-augmented sacrospinous ligament suspension: a description of technique and short-term outcomes. International Urogynecology Journal. 33 (5), 1347-1350 (2022).
  19. Couri, B. M., et al. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics and Gynecology. 7 (3), 249-260 (2012).
  20. Mori da Cunha, M. G. M. C., et al. Animal models for pelvic organ prolapse: systematic review. International Urogynecology Journal. 32 (6), 1331-1344 (2021).
  21. Kasabwala, K., Goueli, R., Culligan, P. J. A live porcine model for robotic sacrocolpopexy training. International Urogynecology Journal. 30 (8), 1371-1375 (2019).
  22. Mansoor, A., et al. Development of an ovine model for training in vaginal surgery for pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 28 (10), 1595-1597 (2017).
  23. Liang, R., et al. Impact of prolapse meshes on the metabolism of vaginal extracellular matrix in rhesus macaque. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 212 (2), 1-7 (2015).
  24. Johannesson, L., et al. Preclinical report on allogeneic uterus transplantation in non-human primates. Human Reproduction. 28 (1), 189-198 (2013).
  25. Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
  26. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , National Academies Press. (2011).
  27. Federal Animal Welfare Regulations. National Archives. , Available from: https://www.ecfr.gov/current/title-9/chapter-l/subchapter-A/part-2/subpart-C/section-2.31 (2022).
  28. Ma, Y., et al. Knockdown of Hoxa11 in vivo in the uterosacral ligament and uterus of mice results in altered collagen and matrix metalloproteinase activity. Biology of Reproduction. 86 (4), 100 (2012).
  29. Moalli, P. A., et al. A rat model to study the structural properties of the vagina and its supportive tissues. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (1), 80-88 (2005).
  30. Yoshida, K., et al. Mechanics of cervical remodelling: Insights from rodent models of pregnancy. Interface Focus. 9 (5), 20190026 (2019).
  31. Christ, G. J., Sharma, P., Hess, W., Bour, R. Modular biofabrication platform for diverse tissue engineering applications and related method thereof. , (2020).
  32. Smith, K., Christ, G. J. Incorporation of in vitro double seeding for enhanced development of tissue engineered skeletal muscle implants. , University of Virginia. (2019).
  33. Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
  34. Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
  35. Baah-Dwomoh, A., McGuire, J., Tan, T., De Vita, R. Mechanical properties of female reproductive organs and supporting connective tissues: A review of the current state of knowledge. Applied Mechanics Reviews. 68 (6), 1-12 (2016).
  36. Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
  37. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical testing of murine tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  38. Griffin, M., et al. Biomechanical characterization of human soft tissues using indentation and tensile testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
  39. Feola, A., et al. Parity negatively impacts vaginal mechanical properties and collagen structure in rhesus macaques. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 203 (6), 1-8 (2010).
  40. Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
  41. Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology. 144, Suppl 1 146-158 (2009).
  42. Lowder, J. L., et al. Adaptations of the rat vagina in pregnancy to accommodate delivery. Obstetrics and Gynecology. 109 (1), 128-135 (2007).
  43. Koebele, S. V., et al. Hysterectomy uniquely impacts spatial memory in a rat model: A role for the nonpregnant uterus in cognitive processes. Endocrinology. 160 (1), 1-19 (2019).
  44. Kafantari, H., et al. Structural alterations in rat skin and bone collagen fibrils induced by ovariectomy. Bone. 26 (4), 349-353 (2000).
  45. Daghma, D. E. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers in bone matrix indicates bone quality in ovariectomized rat spine. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36 (3), 297-306 (2018).
  46. Manodoro, S., Frigerio, M., Milani, R., Spelzini, F. Tips and tricks for uterosacral ligament suspension: how to avoid ureteral injury. International Urogynecology Journal. 29 (1), 161-163 (2018).

Tags

Medisin utgave 186 rotte vevsmekanikk bekkenbunn livmor kirurgi
Utvikling av en uterosacral ligament suspensjon rotte modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, B. J., Jones, B. K., Turner, … More

Miller, B. J., Jones, B. K., Turner, J. S., Caliari, S. R., Vaughan, M. H. Development of a Uterosacral Ligament Suspension Rat Model. J. Vis. Exp. (186), e64311, doi:10.3791/64311 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter