Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering af flydende mesenteriallymfe hos mus for at kvantificere in vivo-kinetik af lipidabsorption i kosten og chylomicron-sekretion

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64338
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh

Summary

Denne protokol beskriver en detaljeret kirurgisk protokol til isolering af flydende tarmlymfe som reaktion på intraduodenale næringsstofinfusioner hos mus. Dette muliggør fysiologisk bestemmelse af total intestinal lipidabsorption og chylomicron syntese og sekretion som reaktion på forskellige eksperimentelle næringsstoffer.

Abstract

Intestinale lipoproteiner, især triglyceridrige chylomicroner, er en vigtig drivkraft for metabolisme, betændelse og hjerte-kar-sygdomme. Imidlertid er isolering af intestinale lipoproteiner meget vanskeligt in vivo , fordi de først udskilles fra tyndtarmen ind i mesenteriallymfatik. Chylomicron-holdige lymfe tømmer derefter ind i den subklaviske vene fra thoraxkanalen for at levere komponenter af måltidet til hjertet, lungerne og i sidste ende hele kroppens cirkulation. Isolering af naive chylomicroner er umuligt fra blod, da chylomicron triglycerid gennemgår hydrolyse umiddelbart efter interaktion med lipoproteinlipase og andre lipoproteinreceptorer i omløb. Derfor er den oprindelige 2-dages lymfefistleprocedure, beskrevet af Bollman et al. hos rotter, historisk blevet brugt til at isolere frisk mesenterial lymfe, før den kommer ind i thoraxvenen. Denne protokol er blevet forbedret og professionaliseret af Patrick Tso's laboratorium i de sidste 45 år, hvilket giver mulighed for analyse af disse kritiske lipoproteiner og sekreter fra tarmen. Tso lymfefistelproceduren er nu blevet opdateret og præsenteres her visuelt for første gang. Denne reviderede procedure er en en-dags kirurgisk teknik til installation af et duodenalt fodringsrør, kanylering af mesenteriallymfekanalen og opsamling af lymfe efter et måltid i bevidste mus. De største fordele ved disse nye teknikker omfatter evnen til reproducerbart at indsamle lymfe fra mus (som udnytter kraften i genetiske musemodeller); den reducerede anæstesitid for mus under implantationen af duodenalinfusionsrøret og lymfekanylen; evnen til kontinuerligt at prøve lymfe gennem hele fodrings- og postprandialperioden evnen til kvantitativt at måle hormoner og cytokiner før deres fortynding og enzymatisk hydrolyse i blodet; og evnen til at indsamle store mængder lymfe til isolering af intestinale lipoproteiner. Denne teknik er et kraftfuldt værktøj til direkte og kvantitativ måling af næringsstofabsorption i kosten, intestinal lipoproteinsyntese og chylomicron-sekretion.

Introduction

Den fysiologiske betydning af det mesenteriske lymfesystem
De mesenteriske lymfatika er blevet beskrevet i en eller anden form siden ~ 300 f.Kr., da Herophilos beskrev leverportalsystemet og alle de "absorberende vener i tarmene"1,2,3,4,5. I mere end 1.700 år efter denne første beskrivelse var et definerende kendetegn ved tarmlymfeknuder tilstedeværelsen af mælkevæske i mesenteriallymfen kort efter et måltid3. Det er nu kendt, at mælkeagtig, chylomicron-holdig lymfe ("chylous" lymfe) ikke dræner ind i portalvenen og leveren, men i stedet bevæger sig gennem cisterna chyli ind i thoraxkanalen og i sidste ende slutter sig til blodet ved venstre subklaviske vene6. På grund af dette anatomiske arrangement rejser chylous lymfe først gennem hjertet og lungerne, før de cirkulerer gennem resten af kroppen. Det betyder, at hjertet og lungerne får et "first-pass" ved sekreterne ind i mesenteriallymfen7.

En vigtig rolle mesenteriske lymfatik er deres transport af kosten lipider fra tyndtarmen 8,9,10. Anatomisk, chylomicrons, intestinale immunceller 11,12,13,14, tarmhormoner 15,16,17,18, antigener 19,20,21, ikke-chylomicron lipofile forbindelser 22,23 , og overskydende væske kommer ind i lactealerne, der ligger under enterocytkældermembranen og koncentreres derefter gennem lymfekapillærerne til mesenteriallymfeknuderne. Der er sandsynligvis mange ukendte mesenteriske lymfekomponenter, herunder metabolitter, antigener, miljøforurenende stoffer, næringsstoffer og signalmolekyler.

Komponenterne i mesenterisk lymfe er ikke blevet systematisk identificeret, hovedsagelig på grund af vanskeligheden ved at isolere mesenterisk lymfe. Adgang til mesenteriallymfe har altid været en alvorlig udfordring, fordi lymfekanalerne er farveløse, og bortset fra efter et fedtholdigt måltid, når de bliver chylous og mælkeagtige, indeholder mesenteriallymferne farveløs lymfevæske 6,8,9,10.

Nuværende og almindelige metoder til isolering af tarmlymfe
Mesenterisk lymfe kan ikke tilgås hos mennesker (undtagen i sjældne og ekstreme tilfælde, hvor der er opstået alvorlige GI-traumer)24. In vivo lymfeopsamling er kirurgisk kompleks og krævende. Den oprindelige 2-dages lymfefistleprocedure blev beskrevet af Bollman et al.25 og er blevet forbedret og professionaliseret af Patrick Tso's laboratorium i de sidste 45 år 26,27. Lymfefistelproceduren gør det muligt for efterforskere at indsamle flydende lymfe fra bevidste dyr i løbet af en 6 timers duodenal lipidinfusionsperiode.

Lymfefistelmodellen er hovedsageligt blevet brugt til rotter til at måle lymfestrømningshastighed, output af triglycerid og kolesterol (eller andre duodenal-infunderede forbindelser), chylomicronsammensætning og tarmhormonkoncentrationer. I mindre grad kan denne teknik også anvendes til mus, selvom kirurgisk overlevelse og lymfevolumen lider. På grund af vanskelighederne med at se mesenteriske lymfekanaler har historiske metoder inkluderet kanylering af mesenterisk lymfe hos større dyr som mini-grise28, får29, svin30, hunde31 og rotter17. At arbejde med disse større modeller er ressourcekrævende og giver ikke mulighed for studier i knock-in eller knock-out modeller.

Der er også anvendt alternative tilgange. Chylomicrons kan isoleres fra blod i postprandial tilstand (selvom disse vil blive delvist hydrolyseret af plasma lipoprotein lipase)32,33,34,35. Brystkanalen kan også kanyleres, selvom lymfen opsamlet der indeholder en blanding af mesenterisk lymfe og ekstra-intestinal lymfedrænage26,36. In vitro udskiller Caco-2-celler en chylomicron-lignende partikel som reaktion på fedtsyrebehandling, og disse celler kan dyrkes sammen med relevante lymfatiske endotel- eller vaskulære celler37,38. Humane og mus intestinale organoidkulturer har vist sig at behandle apikale lipider og udskille chylomicroner 39,40,41,42. Disse modeller er yderst fordelagtige og muliggør mekanistisk indsigt i tyndtarmens fysiologi, men de kan ikke replikere kompleksiteten, fysiokemiske gradienter eller dynamisk lymfestrøm af in situ mesenteriske lymfatik.

Fordele ved 1 dag mus lymfefistel model præsenteret her
Med hensyn til disse andre metoder til isolering af intestinale lipoproteiner er Tso Lab-lymfefistleteknikken traditionelt blevet betragtet som guldstandardteknikken til måling af absorptionen af næringsstoffer i kosten i mesenterisk lymfe. Denne in vivo-teknik har den fordel, at den fanger vigtige fysiologiske aspekter af lipidabsorption i kosten - forbindelsernes dynamiske udseende i absorptionsperioden, hvilket kræver gentagen prøveudtagning af flydende mesenteriallymfe hos levende dyr med duodenale næringsstoffer. Denne kirurgiske teknik måler også tarmhormoner og cytokiner direkte i deres fysiologiske rum snarere end i blod, hvor de fortyndes og enzymatisk nedbrydes17,43.

Hvis det eksperimentelle spørgsmål kræver en forståelse af lipidsekretionsdynamik eller den dynamiske absorption og metabolisme af enhver hydrofob GI-forbindelse eller lægemiddel, er denne teknik ikke kun passende, men er også den eneste tilgang, der interpolerer bevægelsen af luminalt indhold fra det proksimale til den distale tarm (mave til tyktarm) og fra den apikale til den basolaterale overflade (luminalt indhold gennem enterocyt til lacteals og portalcirkulation). Da denne teknik anvender luminal tilførsel af næringsstoffer gennem det intraduodenale kateter, og fordi den flydende mesenteriske lymfe omdirigeres og opsamles, er hele absorptionsapparatet under eksperimentel kontrol og kan bruges til kvalitativt at vurdere tyndtarmens absorptionsprofiler.

Præsenteret visuelt her for første gang er en større opdatering af Tso Lab-lymfefistelmodellen, som (1) reducerer forsøgstiden til en 1 dags kirurgisk implantations- og eksperimentel indsamlingsperiode; 2) forbedrer museoverlevelse og dyrevelfærd og (3) øger reproducerbarheden af tilgangen i mus for at udnytte kraften i musegenetiske modeller. Denne teknik skal betragtes som en guldstandard for alle eksperimentelle spørgsmål om tarmsekretioner, lipoproteiner eller diætlipidabsorption og er den bedste teknik til high-fidelity-bestemmelse af lipidabsorptionskinetik og chylomicrons.

Protocol

Alle kirurgiske procedurer blev godkendt af University of Pittsburgh Internal Animal Care and Use Committee [Protokol # 20047008] og overholder NIH Guide for pleje og brug af forsøgsdyr. C57BL6/J hanmus, 8-14 uger gamle, blev anvendt til nærværende undersøgelse. Musene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel). Alle mus blev anbragt på en 12 timers lys/mørk cyklus med ad libitum adgang til standard chow og vand.

1. Tilberedning af dyr

  1. Afhængigt af det eksperimentelle design skal du fodre musene eller lade dem faste.
    BEMÆRK: En faste natten over er unødvendig, medmindre der er bekymringer om forskelle i hastigheden af mavetømning.
  2. Inducer anæstesi med 5% isoflurangas og sørg for korrekt bedøvelse ved hale og tåklemme. Når musene er bedøvet, skal du holde musene på et korrekt bedøvelsesplan med 2% -3% isoflurangas og placere dem med tape på den kirurgiske platform.
  3. Hold musene varme på en opvarmet kirurgisk platform, der bruger cirkulerende varmt vand (se materialetabel).

2. Kirurgi og eksperimentelt design

  1. Start operationen ved at anvende dyrlægesalve på øjnene, barbere maven og anvende antiseptisk kirurgisk skrubbe (se materialetabellen) på det kirurgiske sted. Dette steriliserer snittet og reducerer dannelsen af luftbåren pels under midterlinjesnittet.
  2. Oprethold et sterilt arbejdsområde ved at bruge sterile instrumenter, gardiner og andet nødvendigt udstyr og forsyninger.
  3. Injicer den første dosis carprofen (se materialetabel) til smertelindring (i.p.) i en dosis på 5 mg/kg.
  4. Tag fat i huden med pincet og lav et midterlinie abdominal snit med lille saks. Skær mod brystbenet (aldrig over) og skær ned til lyskefedtet. Skær derefter gennem muskellaget separat ved hjælp af saksen.
    BEMÆRK: Steriliser alt udstyr før brug.
  5. Brug retraktoren til at flytte peritoneale indvolde ud af vejen, indtil lymfekanalen er synlig.
  6. Brug en saltvandsgennemblødt Q-tip (se materialetabel) til at flytte leveren mod øverste højre side af kroppen og tarmene og maven til venstre for dyret.
  7. Stræk tolvfingertarmen mod venstre på tværs for at udsætte den overlegne mesenteriske arterie og tarmlymfekanalen.
  8. Forbered en 30-40 cm længde kanyleslange ved at indsætte en stump nål i kanyleslangeslangen (se materialetabel) og skyl en lille mængde heparin (1.000 E / L) gennem røret ved hjælp af en 1 ml sprøjte.
    BEMÆRK: Lymfestrømmen assisteres af tyngdekraften til at strømme ned og ind i mikrocentrifugeopsamlingsrørene på is. Afhængigt af hvor opsamlingsisspanden er placeret ved siden af den kirurgiske opsætning, kan det være nødvendigt at justere kanylens længde.
  9. Brug en saks til at klippe en skråning i spidsen af kanyleslange.
  10. Lav et lavt snit med irissaks (se materialetabel) i lymfekanalen ca. 5 mm fra dets udseende i tyndtarmen.
  11. Hold kanyleslangerøret med en fin tang, og sæt forsigtigt spidsen skrå op i kanalen.
    BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at skubbe kanylen for langt ind i kanalen, da dette kan forhindre lymfestrøm, når de tilbagetrukne organer returneres til deres oprindelige position.
  12. Lymfekanalen er alt for skrøbelig til de manipulationer, der er forbundet med at binde kateteret ind med en sutur. Brug i stedet en dråbe cyanoacrylatlim (se materialetabel) til at lime lymfekanylen ind i mesenteriallymfekanalen.
  13. Kontroller for den mælkeagtige, hvide lymfe (hvis der blev brugt olivenolie før operationen) eller klar lymfe (hvis mus har fastet før operationen), der begynder at strømme straks gennem lymfefistellanulen.
    BEMÆRK: Kontroller, at lymfekanylen er placeret med succes, og lymfe flyder; Fortsæt med den intraduodenale kanyleplacering.
  14. Brug en 18 G nål til at punktere et hul gennem den pyloriske region i maven bagved den pyloriske lukkemuskel.
  15. Duodenal infusionsslangen (se materialetabel) føres gennem hullet i maven ca. 1-2 mm ud over pyloruslukkemusklen og ind i tolvfingertarmen.
  16. Fastgør med en pungstrengligatur ved hjælp af silke 5-0 sutur (se materialetabel) med en nål til maven og forsegl med en dråbe cyanoacrylatlim for at forhindre lækage.
  17. Start den intraduodenale infusion af 5% glucose-0,9% saltvand ved 0,3 ml / time.
    BEMÆRK: Når du bruger mus med små variationer i kropsvægt, som er ca. 25 g (~8 uger gamle), er 0,3 ml/t infusion af glucose/saltvand passende. Hvis mus er dramatisk større, skal infusionshastigheden justeres opad for at tage højde for ændringen i kropsvægt og blodvolumen.
  18. Udskift organerne i kropshulen og suturen (5-0) muskel- og hudvævene separat.
    BEMÆRK: Lymfekanylen og det intraduodenale fodringsrør er begge eksteriøriseret gennem det samme snit. Der er ingen forrang for at adskille rørene med en sutur og ingen præference for vinklen på rørets eksteriørisering.
  19. Efter operationen, men før tilbagetrækning af bedøvelsesmidlet, skal du placere musene forsigtigt i Snuggle restraints (se tabel over materialer) for at begrænse bevægeligheden.
    BEMÆRK: Puttefastholdelserne forhindrer musene i at gribe eller rotere hovedet for at tygge på stingene og slangerne.
  20. Placer derefter musene i en klar plexiglaskasse på en rotator med blid vuggen, og varm dem ved hjælp af en temperaturstyret, kommercielt tilgængelig amfibie/krybdyrvarmepude, der sidder fast på siden af indeslutningsboksen. Sørg også for befugtning i form af sterile deioniserede vandbeholdere i hjørnerne af indeslutningsboksen (se materialetabel).
  21. 30 minutter før isofluran trækkes op, administreres musenes anden smertelindrende dosis (Buprenex, 0,1 mg/kg, i.p.).
  22. Afhængigt af eksperimentet skal musene have en kontinuerlig intraduodenal infusion af 5% glucose-0,9% saltvand med en hastighed på 0,3 ml / time i 1 time.
    BEMÆRK: 5% glucose-0,9% saltopløsning fremstilles ved hjælp af en steril saltvandspose (til human brug, pH 7,4) fra apoteket og en steril flaske til human brug af 50% dextrose, efter strenge retningslinjer for sterilitet. Opløsningen skal gøres frisk og kasseres, hvis den overskrider de udløbsdatoer, der er angivet på saltposen eller dextroseflasken.
  23. Administrer musene med et af lipiderne anført i tabel 1 som et eksperimentelt lipid via en intraduodenal kanyle (se materialetabel).
    BEMÆRK: For alle data vist i figur 1 blev SMOFlipid (20% lipidinjicerbar emulsion, USP, se materialetabel) intraduodenalt infunderet. Denne infusion både før og efter intraduodenal lipidbolus erstatter tabt væske, der drænes gennem lymfekanalen og er et absolut krav. Musene er nu klar til at blive infunderet med en eksperimentel lipiddosis.
  24. Udfør den klassiske lipidinfusion af en 0,3 ml lipidemulsionsbolus (SMOFlipid 20% lipidinjicerbar emulsion, USP) via det intraduodenale infusionsrør (se materialetabel).
  25. Efter bolusinfusion af intraduodenale lipider skiftes infusionen tilbage til 5% glucose-0,9% saltvand ved 0,3 ml/h kontinuerligt frem til afslutningen af eksperimentet.
  26. Lymfeprøverne samles i forvejede mikrocentrifugeglas i 60 minutter og opbevares på is. Vej rørene en anden gang for at fastslå vægten af lymfe, der udskilles hver 60 minutters periode.
    BEMÆRK: Forvent at indsamle ca. 50-300 μL lymfe i timen pr. mus i ~6 timer efter en 0,3 ml lipidbolus.
  27. Lymfe kan strømme i op til 6 timer efter lipidinfusionen. Ved 6 timers tid aflives musene via isofluran og cervikal dislokation.
    BEMÆRK: En kirurg og / eller laboratorietekniker skal være til stede for at overvåge dyrene under hele forsøget. Under observationen skal du holde øje med blodpropper i lymfedrænage og ændringer i dyreadfærd, der indikerer smerte / nød. Hvis lymfekanalen er tilstoppet på et hvilket som helst tidspunkt under forsøget, afsluttes eksperimentet, og dyret aflives. Dyret kan teknisk holdes i live i op til 24 timer efter operationen (i henhold til IACUC overlevelseskirurgi regler). Imidlertid falder overlevelsesraten over tid, og 6 timer er en reproducerbar overlevelsesperiode, hvor lipidabsorption stadig efterligner in vivo-fysiologien , og dyret kæmper ikke med overlevelse.
  28. Udfør terminal vævsindsamling efter eutanasi (trin 3.1).
    BEMÆRK: Forskellen i lipidabsorptionsprofiler i kosten hos mus, der holdes i 6 timer eller 24 timer efter operationen, blev for nylig testet44. Vi fandt ud af, at 24-timers proceduren reducerer dyreoverlevelsesraten og udflugten af diætlipider i lymfen. Af disse grunde anbefaler vi stærkt 6-timers tilgangen. Dette opdaterede kirurgiske design reducerer unødvendig dyredød og potentialet for dyrenød i den postkirurgiske periode. Dette understøtter et vigtigt mål for American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, som er dyr "Udskiftning, reduktion, forfining" [ref PMID: 21595115].

3. Indsamling af luminalt indhold og slimhindevæv

  1. Ved afslutningen af 6 timers lipidinfusionsperioden ofres musene via isofluran og cervikal dislokation. Bind begge ender af maven, tyndtarmen og cecum med 5-0 suturer for at undgå lækage af luminalindholdet.
  2. Saml maven, cecum og tyktarmen, og placer hver i et 15 ml glasrør. Del tyndtarmen i tre eller fire segmenter, og saml luminalindholdet ved at skylle vævet i 2-3 ml koldt PBS efter at have skåret åbent i længderetningen.
  3. Fjern tarmslimhinden bestående af epitelceller og tilhørende lamina propria fra muskellaget ved at skrabe hver sektion i 2-3 ml kold PBS med en buet pincet.
  4. Alle væv, luminal- og slimhindeisolater og muskellaget anbringes i glasrør, og der tilsættes 8 ml 2:1 vol/vol CHCl3:MeOH til hvert glas.
  5. Radioaktivitets- og/eller lipidkoncentrationerne bestemmes ved væskescintillationstælling og/eller triglyceridanalysesæt (se materialetabel) efter folchekstraktion45.

4. Tyndtlagskromatografi (TLC)

  1. De samlede lipider i luminal- og slimhindeisolaterne ekstraheres via en modificeret Folch-ekstraktion45.
  2. Tør de ekstraherede lipider i opløsningsmidlet under en nitrogenfordamper, og resuspender dem derefter i 2: 1 vol / vol CHCl3: MeOH, før du lægger dem på en TLC silicagelplade (se materialetabel).
  3. Lipiderne adskilles ved hjælp af et opløsningsmiddelsystem af petroleumsether, ethylether og iseddike (25: 5: 1 vol / vol / vol). Brug joddamp til visualisering af forskellige lipider, herunder standarder.
  4. Skrab pletterne på TLC-pladen svarende til monoglycerid/phospholipid, diglycerider, fedtsyrer, triglycerid og kolesterolester i individuelle scintillationshætteglas, før der tilsættes 4 ml scintillationsvæske (se materialetabel) til scintillationstælling.
  5. Dataene udtrykkes enten som en procent af den totale boluslipiddosis eller som en brøkdel af det samlede lipid, der er påvist for hver prøve.

5. Chylomicron isolering og karakterisering

  1. De kombinerede lymfeprøver overføres fra 6 timers postlipidbolus (trin 2.29) til ultracentrifugeglas blandet med 0,9% NaCl (300-500 μL), og derefter forsigtigt overlejres med et passende volumen på 0,87% NaCl (300-500 μL).
    1. Ultracentrifuge (se materialetabellen) prøverne ved 110.000 x g ved 4 °C i 16 timer. Saml den øverste fraktion indeholdende isolerede chylomikroner og overfør dem til et nyt mikrocentrifugerør.
  2. Bestem chylomicron triglycerid-, kolesterol- og apoB-koncentrationer ved at følge nedenstående trin.
    1. Bestem triglycerid- og kolesterolkoncentrationer ved hjælp af et triglycerid- og kolesterolanalysesæt (se materialetabel).
    2. Kort fortalt inkuberes 2 μL af prøverne med 200 μL enzymreagens ved 37 °C i 5 minutter i en plade med 96 huller. Aflæs pladen ved hjælp af en pladelæser ved 500 nm for triglycerid og 600 nm for kolesterol.
      BEMÆRK: Standarder og blindprøver blev brugt til beregning af koncentrationer. ApoB-koncentrationer blev bestemt ved hjælp af Mouse ApoB ELISA Kit (se materialetabel).
  3. Bestem chylomicron partikelstørrelsen.
    1. Brug friske chylomicron-prøver ved triglyceridkoncentrationer på ca. 40 mg / dL til TEM-billeddannelse. Kort fortalt anbringes 5-10 μL af hver prøve på et TEM-gitter og tørres.
    2. Undersøg gitteret med et transmissionselektronmikroskop og tag billeder. Mål lipoproteinpartikelstørrelserne og analyser dem ved hjælp af ImageJ-software (se materialetabel).

Representative Results

Figur 2 viser triglyceridsekretionen i mesenterisk lymfe og den gennemsnitlige lymfestrømningshastighed i de seneste n = 17 vildtypemus (WT), der gennemgik den endags lymfefistelprocedure, der er beskrevet her. Som vist i figur 2A øges triglyceridkoncentrationen i lymfe som reaktion på en intraduodenal bolus på 300 μL SMOFLipid. Maksimal triglyceridkoncentration nås ved ~ 2-3 timer efter bolus og falder støt gennem 6 timers tid (umiddelbart før eutanasi). Parallelt med triglyceridsekretion øges lymfestrømningshastigheden fra Time 0 bolusinfusion til slutningen af eksperimentet (figur 2B).

Disse resultater viser, at den kirurgiske implantation af både mesenteriallymfekanalen og intraduodenal kanyle har fundet sted og er repræsentative for en positiv kontrol, som andet lymfeindhold (hormoner, peptider, næringsstoffer) kunne benchmarkes til. Hvis der ikke er nogen ændring i triglyceridkoncentrationen i lymfe som reaktion på bolus intraduodenale lipider, signalerer dette, at operationen har forårsaget betydelig skade på tyndtarmen, så lipidabsorptionskapaciteten er fraværende, eller i tidligere ikke-fænotypede genetiske modeller tyder dette på, at musen har en defekt i lipidabsorption, der er fysiologisk meningsfuld.

Figure 1
Figur 1: Foreslået tidslinje for lymfefistlamusmodellen. T-4, T-3, T-2: Dobbeltkanylering tager ca. 2-4 timer, efterfulgt af placering af musene i genopretningskamre. T-1: Når musene er i restitutionsperioden, modtager de en kontinuerlig duodenal infusion af 5% glucose-0,9% saltvand. T0: Den kontinuerlige intraduodenale infusion skiftes fra 5% glucose-0,9% saltvand til en infusion af eksperimentelle næringsstoffer. T0-T6: Mus modtager kontinuerlig intraduodenal 5% glucose i saltvand eller alternativt kontinuerlige næringsstoffer. Lymfe opsamles hver time i denne periode. Endepunkt: Mus aflives, og væv kan indsamles. Figuren blev skabt med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Mesenterisk lymfe triglycerid koncentration og strømningshastighed. Vildtypemus blev udstyret med et intraduodenalt fodringsrør og en mesenterisk lymfekanyle. Mus fik en bolusinfusion af 300 μL lipid. Lymfe blev opsamlet i 6 timer i timebaserede alikvoter og holdt på is. (A) Indholdet af lymfetriglycerider blev bestemt ved et kemisk assay i hver timealikvote lymfe. (B) I 6 timer efter bolusinfusion plottes lymfestrømmen som gram lymfe, der udskilles pr. Time. Point er midler ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Lipid leveringsmetoder Anbefalinger/instruktioner
Blandet lipidemulsionsbolus En 0,3 ml dosis af enten ( A ) Liposyn III 20% lipidinjicerbar eller (B) SMOFlipid 20% lipidinjicerbar emulsion, USP, via intraduodenal infusionsrør kan anvendes. Disse emulgerede lipider er nyttige, fordi de ikke behøver at blive forberedt på forhånd, er flydende ved stuetemperatur, er sterile, og fordi de indeholder en "let fordøjelig" blanding af frie fedtsyrer, triglycerid, phospholipider og natriumtaurocholat. Dette er en god startinfusion til mus, der kan have bugspytkirtel- eller galdeinsufficienser.
Triglycerid bolus 0,3 ml forsigtigt opvarmet olivenolie (eller renset triolein) som et neutralt lipid, der afspejler en kost rig på umættet fedt, svinefedt (reflekterende af en kost med højt indhold af mættet fedt) eller kokosolie (reflekterende af en diæt med højt triglyceridindhold i mellemkæden) kan alle gives ved intraduodenal infusionsrør eller oral sonde. Hvis det eksperimentelle triglycerid er mættet, skal det opvarmes til at være flydende ved stuetemperatur.
Bolus med blandet måltid 0,3 ml Sørg for, at formuleringen indeholdende 0,075 g fedt (21,6%), 0,5 g kulhydrat (64,0%) og 0,1125 g protein (14,4%) og afspejler et fedtfattigt blandet måltid, kan administreres via intraduodenal infusion.
Radioaktivt mærket lipidbolus 5,0 μCi 3 H-mærket glyceroltrioleat og / eller 1,0 μCi 14C-kolesterol i 0,3ml olivenolie kan gives via intra-duodenal infusion. 14 C-kolesterol: Kolesterol-[4-14C] med specifik aktivitet på 55Ci / mmol og en koncentration på 0,1 mCi / ml. 3 H-TG-triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) med en specifik aktivitet på 60Ci/mmol og en koncentration på 1 mCi/ml
Kontinuerlig dosis Infusionen af en af de ovennævnte eksperimentelle næringsstofformuleringer med en hastighed på 0,3 ml / h (snarere end 0,3 ml total bolus) vil resultere i en stabil produktion af triglycerid i lymfen. Dette adskiller sig fra en bolusinfusion, hvor triglyceridkoncentrationen i lymfe topper ved ~2-3 timer og derefter vender tilbage til baseline-koncentrationer ved ~6-8 timer.

Tabel 1: Tabel over lipidinfusioner.

Discussion

Den oprindelige 2-dages lymfefistleprocedure blev beskrevet af Bollman et al.25 og praktiseret af Patrick Tso's laboratorium i de sidste 45 år 26,27. Protokollen, der præsenteres her, er en kraftfuld tilføjelse til denne klassiske, guldstandardmetode til at identificere, kvantificere og forstå tyndtarmens unikke chylousekretioner samt in vivo-dynamikken i næringsstofabsorption og metabolisme i kosten, tarmhormoner og tarmimmunitet.

Fordelene ved denne model inkluderer (1) evnen til kontinuerligt at prøve mesenterisk lymfe gennem hele fodrings- og postprandialperioden snarere end statisk prøveudtagning på et tidspunkt under enten absorption, fordøjelse eller sekretion; 2) måling af tarmhormoner og cytokiner direkte i deres fysiologiske rum i stedet for i blodet, hvor de fortyndes og nedbrydes enzymatisk17,44 (3) evnen til at isolere, kvantitere og karakterisere lipoproteinerne udskilt af tyndtarmen efter indtagelse af et lipidmåltid og fraværet af endotellipaser i mesenteriallymfen, som bevarer chylomicron triglyceridkoncentrationer og native chylomicron struktur46,47; (4) evnen til direkte at måle lymfestrømningshastighed, output af triglycerid og kolesterol (eller andre duodenal-infunderede forbindelser), chylomicronsammensætning og tarmhormonkoncentrationer. Endelig giver denne protokol mulighed for at indsamle relativt store mængder >50 μL lymfe hver time over en periode på 6 timer. Da væsken genopfyldes med intra-duodenal saltvand og glucoseinfusion, forbedres lymfefistelmodellen signifikant i forhold til andre lymfeprøvetagningsteknikker og resulterer i flydende snarere end statiske puljer af mesenterisk lymfe. Da volumen er en stor hindring for lipidomiske, proteomiske og metabolomiske tilgange, er dette en stor styrke.

1-dags muselymfefistelprotokollen beskrevet her har flere fordele i forhold til den oprindelige lymfefistelprotokol, herunder en reduktion i det samlede eksperimentelle dyreantal fra tidligere beskrevne 2-dages lymfefistleprotokoller26,27 på grund af en højere overlevelsesrate efter operationen; en reduktion af den samlede forsøgstid fra 2 dage til en enkelt dag og endelig en reduktion i restitutionsperioden for mus fra natten over (>18 timer), hvor gennembrudssmerter eller dårlige postkirurgiske resultater kan forekomme, til en mere håndterbar ~ 6 timers postoperativ periode.

Et træk ved denne 1-dags protokol er fokus på humane overvejelser og endepunkter. Disse skal have højeste prioritet: (1) dyr skal have intraduodenale eller IV erstatningsvæsker; (2) de skal holdes varme og så smertefri som muligt (med postoperativ Buprenex og/eller carprofen, afhængigt af forsøgsdesignet og behovet for at undgå antiinflammatoriske virkninger); (3) blødning, rysten, diarré eller tegn på nød er alle tvingende grunde til et humant endepunkt. I henhold til IACUC's strenge retningslinjer er isofluran efterfulgt af cervikal dislokation et godt endepunkt. Kirurgiske overlevelsesrater er ~ 70% for en enkelt dag (sammenlignet med ~ 40% for den oprindelige 2-dages operation), men efterforskere bør ikke tøve med at afslutte eksperimentet ved et tegn på nød. Dette bør tages i betragtning ved planlægning af antallet af dyr.

Med hensyn til fejlfinding af denne teknik er vellykket placering af lymfekanylen den største flaskehals i denne kirurgiske procedure. Mens du praktiserer operationen, hjælper det med at gavge musen med 0,3 ml olivenolie ca. 2 timer før operationen. Dette vil medføre udskillelse af chylomicroner i mesenteriallymfekanalen, hvilket får den til at virke "mælkeagtig" og mere synlig. Methylenblåt kan også bruges, men er ofte mindre indlysende end den mælkeagtige lymfekanal. Hvis mesenteriallymfen efter placeringen af lymfekanylen og dens placering med lim med succes strømmer gennem kanylen ind i en opsamlingsbeholder, kan man fortsætte med placeringen af et duodenalt infusionsrør. Lejlighedsvis kan lymfen ikke flyde kontinuerligt, men kan begynde at flyde igen, når dyret placeres på rotationsbordet. Pas kritisk på blodpropper i lymfeslangen. Disse bør masseres ud af rørene for at forhindre tilbagestrømningstryk på lymfekanalen.

Ud over triglyceridsekretion og lymfestrømningshastighed kan denne teknik anvendes til at bestemme følgende lipidabsorptionskinetik og chylomicronegenskaber:

Chylomicron sekretion45,48,49
Umiddelbart efter et måltid, der indeholder fedt, er der en forbigående stigning i cirkulerende plasmatriglycerid. Da triglycerider i sagens natur er hydrofobe, skal de først emulgeres for at være opløselige i blod50. Tyndtarmens enterocytter udfører denne rolle og pakker triglycerid i kosten i chylomicron emulsionspartikler51. Chylomicrons indeholder kolesterol og kosten triglycerid i deres kerne, omgivet af fosfolipider og apolipoproteiner, herunder apoB-48, apoA-I, apoA-IV og apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 er det essentielle strukturelle protein, og de andre apolipoproteiner har forskellige funktioner, der kræves for chylomicron metabolisme og clearance fra blodet. For at bestemme chylomicrons nøgleegenskaber, herunder deres triglycerid- og apolipoproteinindhold, bør 1-dags lymfefistlateknikken vist her anvendes. Chylomicron-sekretionshastigheden er procentdelen af infunderet 3H-triglycerid, der udskilles i lymfen og måles ved scintillation ved at tælle lymfeprøver hver time. Dette kan kombineres med detaljeret chylomicron karakterisering 48,49,56,57,58. Timelymfeprøver kan kombineres eller opbevares separat. Lymfe overføres til ultracentrifuge rør, blandes med 0,9% NaCl og overlejres derefter omhyggeligt med 300-500 μL 0,87% NaCl. Prøverne ultracentrifugeres derefter ved 110.000 x g ved 4 °C i 16 timer. De øverste fraktioner, der indeholder isolerede chylomikroner, indsamles og testes for triglyceridkoncentrationer ved hjælp af triglyceridanalysesættet. Kort fortalt inkuberes 2 μL chylomicron (1:10 fortynding) med 200 μL enzymreagens ved stuetemperatur i 10 minutter i en 96-brøndplade. Pladen læses af en pladelæser ved 500 nm, og standarderne og emnerne anvendes til beregning af triglyceridkoncentrationer. Chylomicron-størrelsen kan derefter bestemmes ved negativ farvning og transmissionselektronmikroskopi (TEM)14,29. Triglycerid og kolesterol kan kvantificeres ved kemisk analyse og apolipoproteinindhold (apoB-48, A-I, C-II, C-III) ved ELISA Kits eller Western blot.

Bestemmelse af det primære sted for lipidabsorption 48,59
Ved at isolere luminal- og epitelcellerummene i tolvfingertarmen, jejunum og ileum 6 timer efter infusion af 3H-triglycerid eller et radioaktivt mærket blandet måltid, ekstraheres indholdet folch for at bestemme, hvor meget af 3H-triglyceridet der absorberes over epitelcellemembranen (normalt) eller tilbageholdes i lumen (unormalt) langs tyndtarmens længde48 . Disse undersøgelser er særligt virkningsfulde, hvis der er potentielle forskelle i GI-motilitet 60,61,62, hvis der er en hypotese om galdesyrer (meget aktive gennem lipidabsorption og selv reabsorberet i ileum)63,64,65,66, eller hvis der er bekymring for, at næringsstoffer absorberes på det forkerte anatomiske sted (ileum eller endda tyktarm)67 ,68,69,70.

Identifikation af mekanismer for 3H-triglyceridhandel i absorberende epitelceller48
Dette udføres ved at beregne procentdelen af 3 H-triglycerid hydrolyseret til 3 H-fri fedtsyre i tarmens lumen, absorberet i slimhinden og re-esterificeret til intracellulært 3H-triglycerid før sekretion som chylomicrons. Dette er en kraftig markør for absorptions- / sekretionsdefekter, da det kan spores for at vise bevægelsen af triglycerid i kosten i dets nedbrydningsprodukter og efterfølgende emballering i chylomicroner. mRNA-ekspression af fedtsyreabsorptionsmaskineriet (CD36, FABP'er, ACSL'er), re-esterificeringsvej (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) og apolipoproteiner (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) kan yderligere kvantificeres ved RT-PCR.

Fremtidige anvendelser af denne teknik er kun begrænset af interesse for tarmorgan-krydstale, stofskifte, immunitet, næringsabsorption, miljømæssige kostforurenende stoffer eller enhver anden sygdom med en rolle i GI-systemet. Det er sandsynligt, at mange overbevisende eksperimenter og hypoteser er gået i stå på grund af vanskeligheden ved at få adgang til det kritiske mesenteriske lymfesystem, og målet med denne visualiserede protokol er at gøre denne teknik lettere tilgængelig. Isolering af chylomicroner og mesenteriallymfen, hvor de oprindeligt bor, er en kritisk del af forståelsen af helkropsmetabolisme; 1-dags muselymfefistelmodellen er en stærk fysiologisk model til at studere disse begivenheder.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi er meget taknemmelige over for Cystic Fibrosis Foundation (Pilot and Feasibility Award 1810, til ABK), Rainin Foundation (Synergy Award, til PI GJ Randolph og Co-I ABK) og National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 til ABK) for deres støtte til disse undersøgelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC 0409-4888-06
1.7 mL Eppendorf tubes Fisher Scientific, Waltham, MA, US 7200184
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ARC 0857
18 G needle Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 305199
2 Dumont micro-dissecting forceps Fine Science Tools, Foster City, CA, US 11251-35
2 Forceps ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5130
3H-TAG:  Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ART0199
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC-0409-6648-16
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK Fisher Scientific, Waltham, MA, US 11-101-0007
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick Fisher Scientific, Waltham, MA, US 14-910-501
Betadine surgical scrub Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US 1201
Bevel-cut cannula Braintree Scientific.,  Braintree , MA, US MRE025
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) HenrySchein, Warrendale, PA, US 1278184
C57BL6/J male mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine
ChloraPrep Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 260100
Cholesterol Assay Kit FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US 99902601
Cholesterol-[4-14C] American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification our own design and modifications
commercially available  amphibian/reptile heating pad ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China XHC-F035D
Cotton tip applicators Fisher Scientific, Waltham, MA, US 22363156
Duodenal infusion tube - canuala Braintree Scientific, Braintree , MA, US MRE037
Ensure Abbott Nutrition, Columbus, OH
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination Patterson Scientific, Waukesha, WI, US Gaymar T/Pump Classic
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile Mylan, Morgantown, WV, US NDC-67457-384-31
Image J Software National Institute of Health, Bethesda, Maryland,
Iris scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Isoflurane Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US NDC 66794-017-25
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus Patterson Scientific, Waukesha, WI, US mouse induction chamber
Krazy glue Elmer's products Inc., Columbus, OH, US KG484
Liposyn III 20% lipid injectable Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter Beckman Coulter, Brea, CA
Micro-dissecting Spring Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Mouse apoB ELISA Kit ABCAM Inc., Waltham, MA, US ab230932-1
Needle Holder Fine Science Tools, Foster City, CA, US 12002-12
Retractors Kent Scientific Co., Torrington, CT, US SURGI-5001
Rimadyl (Carprofen) Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US 4019449
Rotating table Barnstead Thermolyne Labquake, Zürich, Switzerland Barnstead Thermolyne
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US NDC-63323-820-01
Snuggle Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada MS 02.5PM
Surgical Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5912SC
Suture (5-0 silk with needle) DemeTECH, Miami Lakes, FL, US DT-719
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) JEOL, Peabody, MA
Triglyceride Assay Kit Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom TR210
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid Perkin Elmer, Hebron, KY, US 6013119
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 SORVALL RC M120 GX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natale, G., Bocci, G., Ribatti, D. Scholars and Scientists in the History of the Lymphatic System. Journal of Anatomy. 231 (3), 417-429 (2017).
  2. Loukas, M., et al. The lymphatic system: A historical perspective. Clinical Anatomy. 24 (7), 807-816 (2011).
  3. Suy, R., Thomis, S., Fourneau, I. The discovery of the lymphatic system in the seventeenth century. Part II: The discovery of Chyle vessels. Acta Chirurgica Belgica. 116 (5), 325-331 (2016).
  4. Azzali, G. Historical notes on the lymphatic vascular system. Acta Bio-medica de L'Ateneo Parmense. 61 (3-4), 113-125 (1990).
  5. Irschick, R., Siemon, C., Brenner, E. The history of anatomical research of lymphatics - From the ancient times to the end of the European Renaissance. Annals of Anatomy. 223, 49-69 (2019).
  6. Swartz, M. A. The physiology of the lymphatic system. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 3-20 (2001).
  7. Deitch, E. A. Gut lymph and lymphatics: A source of factors leading to organ injury and dysfunction. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 103-111 (2010).
  8. Tso, P., Gollamudi, S. R. Pluronic L-81: A potent inhibitor of the transport of intestinal chylomicrons. American Journal of Physiology. 247, 32-36 (1984).
  9. Tso, P., Karlstad, M. D., Bistrian, B. R., DeMichele, S. J. Intestinal digestion, absorption, and transport of structured triglycerides and cholesterol in rats. American Journal of Physiology. 268, 568-577 (1995).
  10. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. American Journal of Physiology. 261, 530-538 (1991).
  11. Bogunovic, M., et al. Origin of the lamina propria dendritic cell network. Immunity. 31 (3), 513-525 (2009).
  12. Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Science Translational Medicine. 6 (237), (2014).
  13. Ji, Y., Sakata, Y., Tso, P. Nutrient-induced inflammation in the intestine. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (4), 315-321 (2011).
  14. Ji, Y., Sakata, Y., Yang, Q., Tso, P. Intestinal mucosal mast cells is activated by fat absorption. Gastroenterology. 140 (5), (2011).
  15. Wang, F., et al. Chronic high-fat feeding increases mixed meal-induced incretin secretion in Sprague-Dawley rats. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (10), 807-815 (2015).
  16. Kindel, T. L., Yoder, S. M., D'Alessio, D. A., Tso, P. The effect of duodenal-jejunal bypass on glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in Wistar rats. Obesity Surgery. 20 (6), 768-775 (2010).
  17. Kohan, A. B., Yoder, S. M., Tso, P. Using the lymphatics to study nutrient absorption and the secretion of gastrointestinal hormones. Physiology & Behavior. 105 (1), 82-88 (2011).
  18. Yoder, S. M., Yang, Q., Kindel, T. L., Tso, P. Stimulation of incretin secretion by dietary lipid: Is it dose dependent. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (2), 299-305 (2009).
  19. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PLoS One. 4 (12), 8442 (2009).
  20. Vors, C., et al. Postprandial endotoxemia linked with chylomicrons and lipopolysaccharides handling in obese versus lean men: A lipid dose-effect trial. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (9), 3427-3435 (2015).
  21. Ghoshal, S., Witta, J., Zhong, J., de Villiers, W., Eckhardt, E. Chylomicrons promote intestinal absorption of lipopolysaccharides. Journal of Lipid Research. 50 (1), 90-97 (2009).
  22. Jandacek, R. J., Rider, T., Keller, E. R., Tso, P. The effect of olestra on the absorption, excretion and storage of 2,2',5,5' tetrachlorobiphenyl; 3,3',4,4' tetrachlorobiphenyl; and perfluorooctanoic acid. Environment International. 36 (8), 880-883 (2010).
  23. Jandacek, R. J., Tso, P. Organochlorine compounds are absorbed via lymph and portal circulation. The FASEB Journal. 22, (2008).
  24. Utermann, G., Beisiegel, U. Apolipoprotein A-IV: A protein occurring in human mesenteric lymph chylomicrons and free in plasma. Isolation and quantification. European Journal of Biochemistry. 99 (2), 333-344 (1979).
  25. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 33 (10), 1349-1352 (1948).
  26. Tso, P., Balint, J. A., Rodgers, J. B. Effect of hydrophobic surfactant (pluronic L-81) on lymphatic lipid transport in the rat. American Journal of Physiology. 239 (5), 348-353 (1980).
  27. Liu, M., et al. Sexual dimorphism in intestinal absorption and lymphatic transport of dietary lipids. Journal of Physiology. 599 (22), 5015-5030 (2021).
  28. Manolas, K. J., et al. Lymph, pancreatic and gastrointestinal hormones in response to feeding in the conscious pig. European Surgical Research. 17 (5), 324-332 (1985).
  29. Lascelles, A. K., Morris, B. Surgical techniques for the collection of lymph from unanaesthetized sheep. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 46, 199-205 (1961).
  30. Jensen, L. T., Olesen, H. P., Risteli, J., Lorenzen, I. External thoracic duct-venous shunt in conscious pigs for long term studies of connective tissue metabolites in lymph. Laboratory Animal Science. 40 (6), 620-624 (1990).
  31. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 45-60 (2001).
  32. Yasunaga, K., Saito, S., Zhang, Y. -L., Hernandez-Ono, A., Ginsberg, H. N. Effects of triacylglycerol and diacylglycerol oils on blood clearance, tissue uptake, and hepatic apolipoprotein B secretion in mice. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1108-1121 (2007).
  33. Curtin, A., et al. Elevated triglyceride-rich lipoproteins in diabetes. A study of apolipoprotein B-48. Acta Diabetologica. 33 (3), 205-210 (1996).
  34. Gordts, P. L. S. M., et al. ApoC-III inhibits clearance of triglyceride-rich lipoproteins through LDL family receptors. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2855-2866 (2016).
  35. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78 (5), 1287-1295 (1986).
  36. Ormai, S., Palkovits, M. Size distribution of lymphocytes in the thoracic duct lymph in rat after lymphocyte mobilization induced by polymethacrylic acid. Blut Zeitschrift für die Gesamte Blutforschung. 24 (3), 161-165 (1972).
  37. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19565-19572 (1999).
  38. Nollevaux, G., et al. Development of a serum-free co-culture of human intestinal epithelium cell-lines (Caco-2/HT29-5M21). BMC Cell Biology. 7 (1), 20 (2006).
  39. Li, D., Dong, H., Kohan, A. B. The Isolation, Culture, and Propagation of Murine Intestinal Enteroids for the Study of Dietary Lipid Metabolism. Organoids. Methods in Molecular Biology. 1576, Humana. New York, NY. 195-204 (2019).
  40. Jattan, J. J., et al. Using murine-derived primary intestinal enteroids for studies of dietary triglyceride absorption and lipoprotein synthesis, and to determine the role of intestine-specific ApoC-III in the intestine. Journal of Lipid Research. 58 (5), 853-865 (2017).
  41. Haring, E., et al. Bile acids regulate intestinal antigen presentation and reduce graft-versus-host disease without impairing the graft-versus-leukemia effect. Haematologica. 106 (8), 2131-2146 (2021).
  42. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: Reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 269-289 (2015).
  43. Deacon, C. F. Circulation and degradation of GIP and GLP-1. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 761-765 (2004).
  44. Dedousis, N., Teng, L., Kanshana, J. S., Kohan, A. B. A single-day mouse mesenteric lymph surgery in mice: an updated approach to study dietary lipid absorption, chylomicron secretion, and lymphocyte dynamics. J Lipid Res. 63 (11), 100284 (2022).
  45. Li, D., et al. Intestinal basolateral lipid substrate transport is linked to chylomicron secretion and is regulated by ApoC-III. Journal of Lipid Research. 60 (9), 1503-1515 (2019).
  46. Glatzle, J., et al. Chylomicron components mediate intestinal lipid-induced inhibition of gastric motor function. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 282 (1), 86-91 (2002).
  47. Huang, J., Sloop, C. H., Roheim, P. S., Wong, L. Lipoprotein lipase and hepatic triacylglycerol lipase activities in peripheral and skeletal muscle lymph. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 10 (5), 720-726 (1990).
  48. Wang, F., et al. Overexpression of apolipoprotein C-III decreases secretion of dietary triglyceride into lymph. Physiological Reports. 2 (3), 00247 (2014).
  49. Kohan, A. B., et al. Apolipoprotein A-IV regulates chylomicron metabolism-Mechanism and function. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (6), 628-636 (2012).
  50. Hayashi, H., et al. Fat feeding increases size, but not number, of chylomicrons produced by small intestine. American Journal of Physiology. 259 (5), 709-719 (1990).
  51. Tso, P., Balint, J. A. Formation and transport of chylomicrons by enterocytes to the lymphatics. American Journal of Physiology. 250 (6), 715-726 (1986).
  52. Bhattacharya, S., Redgrave, T. G. The content of apolipoprotein B in chylomicron particles. Journal of Lipid Research. 22 (5), 820-828 (1981).
  53. Björkegren, J., Karpe, F., Milne, R. W., Hamsten, A. Differences in apolipoprotein and lipid composition between human chylomicron remnants and very low density lipoproteins isolated from fasting and postprandial plasma. Journal of Lipid Research. 39 (7), 1412-1420 (1998).
  54. Martins, I. J., Sainsbury, A. J., Mamo, J. C., Redgrave, T. G. Lipid and apolipoprotein B48 transport in mesenteric lymph and the effect of hyperphagia on the clearance of chylomicron-like emulsions in insulin-deficient rats. Diabetologia. 37 (3), 238-246 (1994).
  55. Mar, R., et al. Association of the APOLIPOPROTEIN A1/C3/A4/A5 gene cluster with triglyceride levels and LDL particle size in familial combined hyperlipidemia. Circulation Research. 94 (7), 993-999 (2004).
  56. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 086005 (2012).
  57. Nauli, A. M., et al. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiological Reports. 2 (6), 192-196 (2014).
  58. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1290-1297 (2005).
  59. Kohan, A. B., et al. Is apolipoprotein A-IV rate limiting in the intestinal transport and absorption of triglyceride. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (12), 1128-1135 (2013).
  60. De Lisle, R. C. Altered transit and bacterial overgrowth in the cystic fibrosis mouse small intestine. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (1), 104-111 (2007).
  61. Debas, H. T., Farooq, O., Grossman, M. I. Inhibition of gastric emptying is a physiological action of cholecystokinin. Gastroenterology. 68 (5), 1211-1217 (1975).
  62. Spiller, R. C., et al. Further characterisation of the 'ileal brake' reflex in man--Effect of ileal infusion of partial digests of fat, protein, and starch on jejunal motility and release of neurotensin, enteroglucagon, and peptide YY. Gut. 29 (8), 1042-1051 (1988).
  63. Battle, M. A., et al. GATA4 is essential for jejunal function in mice. Gastroenterology. 135 (5), 1676-1686 (2008).
  64. Morgan, R. G., Borgström, B. The mechanism of fat absorption in the bile fistula rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 228-243 (1969).
  65. Davidson, N. O., Kollmer, M. E., Glickman, R. M. Apolipoprotein B synthesis in rat small intestine: Regulation by dietary triglyceride and biliary lipid. Journal of Lipid Research. 27 (1), 30-39 (1986).
  66. Bouchi, R., et al. FOXO1 inhibition yields functional insulin-producing cells in human gut organoid cultures. Nature Communications. 5, 4242 (2014).
  67. Bijvelds, M. J. C., et al. Fat absorption in cystic fibrosis mice is impeded by defective lipolysis and post-lipolytic events. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 288 (4), 646-653 (2005).
  68. Struyvenberg, M. R., Martin, C. R., Freedman, S. D. Practical guide to exocrine pancreatic insufficiency - Breaking the myths. BMC Medicine. 15 (1), 29 (2017).
  69. Tickell, K. D., Atlas, H. E., Walson, J. L. Environmental enteric dysfunction: A review of potential mechanisms, consequences and management strategies. BMC Medicine. 17 (1), 181 (2019).
  70. Lo, C. M., et al. Cholecystokinin knockout mice are resistant to high-fat diet-induced obesity. Gastroenterology. 138 (5), 1997-2005 (2010).

Tags

Biologi nr. 189
Isolering af flydende mesenteriallymfe hos mus for at kvantificere <em>in vivo-kinetik</em> af lipidabsorption i kosten og chylomicron-sekretion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. … More

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. B. The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion. J. Vis. Exp. (189), e64338, doi:10.3791/64338 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter