Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

De isolatie van stromende mesenteriale lymfe bij muizen om in vivo kinetiek van lipideabsorptie in de voeding en chylomicronsecretie te kwantificeren

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64338
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh

Summary

Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerd chirurgisch protocol voor het isoleren van stromende darmlymfe als reactie op intraduodenale voedingsinfusies bij muizen. Dit maakt de fysiologische bepaling van de totale intestinale lipideabsorptie en chylomicronsynthese en -secretie mogelijk als reactie op verschillende experimentele voedingsstoffen.

Abstract

Intestinale lipoproteïnen, vooral triglyceride-rijke chylomicronen, zijn een belangrijke aanjager van metabolisme, ontsteking en hart- en vaatziekten. Het isoleren van intestinale lipoproteïnen is echter erg moeilijk in vivo omdat ze eerst vanuit de dunne darm worden uitgescheiden in de mesenteriale lymfevaten. Chylomicron-bevattende lymfe leegt vervolgens in de subclavia-ader van het thoracale kanaal om componenten van de maaltijd af te leveren aan het hart, de longen en uiteindelijk de bloedsomloop van het hele lichaam. Het isoleren van naïeve chylomicronen is onmogelijk uit het bloed, omdat chylomicron triglyceride onmiddellijk hydrolyse ondergaat na interactie met lipoproteïnelipase en andere lipoproteïnereceptoren in omloop. Daarom is de oorspronkelijke 2-daagse lymfefistelprocedure, beschreven door Bollman et al. bij ratten, historisch gebruikt om verse mesenteriale lymfe te isoleren voordat deze in de thoracale ader terechtkomt. Dat protocol is de afgelopen 45 jaar verbeterd en geprofessionaliseerd door het laboratorium van Patrick Tso, waardoor de analyse van deze kritische lipoproteïnen en afscheidingen uit de darm mogelijk is. De Tso lymfe fistel procedure is nu bijgewerkt en wordt hier voor het eerst visueel gepresenteerd. Deze herziene procedure is een eendaagse chirurgische techniek voor het installeren van een voedingssonde voor de twaalfvingerige darm, het cannuleren van het mesenteriale lymfekanaal en het verzamelen van lymfe na een maaltijd bij bewuste muizen. De belangrijkste voordelen van deze nieuwe technieken zijn het vermogen om reproduceerbaar lymfe van muizen te verzamelen (wat gebruik maakt van de kracht van genetische muismodellen); de verminderde anesthesietijd voor muizen tijdens de implantatie van de darminfuusbuis en de lymfecanule; het vermogen om continu lymfe te bemonsteren gedurende de voedings- en postprandiale periode; het vermogen om hormonen en cytokines kwantitatief te meten vóór hun verdunning en enzymatische hydrolyse in het bloed; en het vermogen om grote hoeveelheden lymfe te verzamelen voor het isoleren van intestinale lipoproteïnen. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor het direct en kwantitatief meten van de opname van voedingsstoffen in de voeding, intestinale lipoproteïnesynthese en chylomicronsecretie.

Introduction

Het fysiologische belang van het mesenteriale lymfestelsel
De mesenteriale lymfevaten zijn in een of andere vorm beschreven sinds ~ 300 voor Christus toen Herophilos het hepatische poortsysteem en alle "absorberende aderen in de darmen" beschreef1,2,3,4,5. Gedurende meer dan 1.700 jaar na deze eerste beschrijving was een bepalend kenmerk van darmlymfevaten de aanwezigheid van melkachtig vocht in de mesenteriale lymfe kort na een maaltijd3. Het is nu bekend dat melkachtige, chylomicron-bevattende lymfe ("chylous" lymfe) niet in de poortader en lever terechtkomt, maar in plaats daarvan door de cisterna chyli naar de thoracale ductus reist en uiteindelijk het bloed bij de linker subclaviaader6 verbindt. Door deze anatomische opstelling reist chylous lymfe eerst door het hart en de longen voordat het door de rest van het lichaam circuleert. Dit betekent dat het hart en de longen een "first-pass" krijgen bij de afscheidingen in de mesenteriale lymfe7.

Een belangrijke rol van mesenteriale lymfevaten is hun transport van voedingslipiden uit de dunne darm 8,9,10. Anatomisch, chylomicronen, intestinale immuuncellen 11,12,13,14, darmhormonen 15,16,17,18, antigenen 19,20,21, niet-chylomicron lipofiele verbindingen22,23 , en overtollig vocht komt de lactealen binnen die ten grondslag liggen aan het enterocytenkeldermembraan en worden vervolgens geconcentreerd door de lymfecapillairen naar de mesenteriale lymfeklieren. Er zijn waarschijnlijk veel onbekende mesenteriale lymfatische componenten, waaronder metabolieten, antigenen, milieuverontreinigende stoffen, voedingsstoffen en signaalmoleculen.

De componenten van mesenteriale lymfe zijn niet systematisch geïdentificeerd, grotendeels vanwege de moeilijkheid om mesenteriale lymfe te isoleren. Toegang tot de mesenteriale lymfe is altijd een serieuze uitdaging geweest omdat lymfekanalen kleurloos zijn, en behalve na een vette maaltijd wanneer ze chylous en melkachtig worden, bevatten de mesenteriale lymfevaten kleurloze lymfevocht 6,8,9,10.

Huidige en gebruikelijke methoden voor het isoleren van darmlymfe
Mesenteriale lymfe is niet toegankelijk bij mensen (behalve in zeldzame en extreme omstandigheden waarin ernstig GI-trauma is opgetreden)24. In vivo lymfeverzameling is chirurgisch complex en veeleisend. De oorspronkelijke 2-daagse lymfefistelprocedure werd beschreven door Bollman et al.25 en is de afgelopen 45 jaar verbeterd en geprofessionaliseerd door het laboratorium van Patrick Tso26,27. De lymfefistelprocedure stelt onderzoekers in staat om vloeiende lymfe van bewuste dieren te verzamelen tijdens een 6 uur durende duodenale lipide-infusieperiode.

Het lymfefistelmodel is voornamelijk gebruikt bij ratten om de lymfestroomsnelheid, de output van triglyceriden en cholesterol (of andere duodenale geïnfundeerde verbindingen), chylomicronsamenstelling en intestinale hormoonconcentraties te meten. In mindere mate kan deze techniek ook bij muizen worden gebruikt, hoewel de chirurgische overleving en het lymfevolume eronder lijden. Vanwege de moeilijkheden bij het zien van mesenteriale lymfekanalen, hebben historische methoden het cannuleren van mesenteriale lymfe bij grotere dieren zoals minivarkens28, schapen29, varkens30, honden31 en ratten17 opgenomen. Het werken met deze grotere modellen is arbeidsintensief en laat geen studies in knock-in of knock-out modellen toe.

Er zijn ook alternatieve benaderingen gebruikt. Chylomicronen kunnen worden geïsoleerd uit bloed in de postprandiale toestand (hoewel deze gedeeltelijk worden gehydrolyseerd door plasmalipoproteïnelipase)32,33,34,35. De thoracale ductus kan ook worden gecannuleerd, hoewel de daar verzamelde lymfe een mengsel van mesenteriale lymfe en extra-intestinale lymfedrainage26,36 bevat. In vitro scheiden Caco-2-cellen een chylomicronachtig deeltje af als reactie op vetzuurbehandeling, en deze cellen kunnen samen worden gekweekt met relevante lymfatische endotheel- of vasculaire cellen37,38. Van intestinale organoïde culturen van mens en muis is aangetoond dat ze apicale lipiden verwerken en chylomicronen afscheiden 39,40,41,42. Deze modellen zijn zeer voordelig en maken mechanistische inzichten in de dunne darmfysiologie mogelijk, maar ze kunnen de complexiteit, fysisch-chemische gradiënten of dynamische lymfestroom van in situ mesenteriale lymfevaten niet repliceren.

Voordelen van het 1 dag muis lymfe fistel model hier gepresenteerd
Met betrekking tot deze andere methoden voor het isoleren van intestinale lipoproteïnen, wordt de Tso Lab-lymfefisteltechniek traditioneel beschouwd als de gouden standaardtechniek voor het meten van de absorptie van voedingsnutriënten in mesenteriale lymfe. Deze in vivo techniek heeft het voordeel dat het de belangrijkste fysiologische aspecten van lipideabsorptie in de voeding vastlegt - het dynamische uiterlijk van verbindingen gedurende de absorptieperiode, waarvoor de herhaalde bemonstering van stromende mesenteriale lymfe in levende dieren met duodenale voedingsstoffen vereist is. Deze chirurgische techniek meet ook darmhormonen en cytokines direct in hun fysiologische compartiment in plaats van in het bloed, waar ze worden verdund en enzymatisch worden afgebroken 17,43.

Als de experimentele vraag een goed begrip vereist van lipidesecretiedynamiek of de dynamische absorptie en het metabolisme van een hydrofobe GI-verbinding of medicijn, dan is deze techniek niet alleen geschikt, maar is het ook de enige benadering die de beweging van luminale inhoud van de proximale naar de distale darm (maag naar colon) en van de apicale naar het basolaterale oppervlak interpoleert (luminale inhoud via enterocyt naar lactealen en portale circulatie). Omdat deze techniek gebruik maakt van de luminale afgifte van voedingsstoffen via de intraduodenale katheter, en omdat de stromende mesenteriale lymfe wordt omgeleid en verzameld, staat het hele absorptieapparaat onder experimentele controle en kan het worden gebruikt om de absorptieprofielen van de dunne darm kwalitatief te beoordelen.

Hier wordt voor het eerst visueel een belangrijke update van het Tso Lab-lymfefistelmodel gepresenteerd, die (1) de experimentele tijd reduceert tot een chirurgische implantatie- en experimentele verzamelperiode van 1 dag; (2) de overleving van muizen en overwegingen inzake dierenwelzijn verbetert; en (3) verhoogt de reproduceerbaarheid van de aanpak bij muizen om de kracht van genetische muismodellen te benutten. Deze techniek moet worden beschouwd als een gouden standaard voor alle experimentele vragen over intestinale secreties, lipoproteïnen of lipideabsorptie in de voeding en is de beste techniek voor de high-fidelity bepaling van lipideabsorptiekinetiek en chylomicronen.

Protocol

Alle chirurgische procedures zijn goedgekeurd door de University of Pittsburgh Internal Animal Care and Use Committee [Protocol # 20047008] en voldoen aan de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. C57BL6/J mannelijke muizen, 8-14 weken oud, werden gebruikt voor de huidige studie. De muizen werden verkregen uit een commerciële bron (zie Tabel van Materialen). Alle muizen werden gehuisvest op een 12 uur durende licht/donker cyclus met ad libitum toegang tot standaard chow en water.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Afhankelijk van het experimentele ontwerp, voer de muizen of laat ze vasten.
    OPMERKING: Een nacht vasten is niet nodig, tenzij er zorgen zijn over verschillen in de snelheid van maaglediging.
  2. Induceer anesthesie door 5% isofluraangas en zorg voor een goede verdoving door staart- en teenknijpen. Eenmaal verdoofd, houdt u de muizen op een goed verdovingsvlak met 2% -3% isofluraangas en plaatst u ze met tape op het chirurgische platform.
  3. Houd de muizen warm op een verwarmd chirurgisch platform dat gebruik maakt van circulerend warm water (zie materiaaltabel).

2. Chirurgie en experimenteel ontwerp

  1. Begin de operatie door veterinzalf op de ogen aan te brengen, de buik te scheren en antiseptische chirurgische scrub (zie materiaaltabel) op de operatieplaats aan te brengen. Dit steriliseert de incisie en vermindert de generatie van vacht in de lucht tijdens de middellijnincisie.
  2. Zorg voor een steriel werkgebied door gebruik te maken van steriele instrumenten, gordijnen en andere benodigde apparatuur en benodigdheden.
  3. Injecteer de eerste dosis carprofen (zie tabel met materialen) voor pijnverlichting (i.p.) in een dosis van 5 mg/kg.
  4. Pak de huid vast met een pincet en maak een buikincisie in de middellijn met een kleine schaar. Snijd naar het borstbeen (nooit boven) en snijd af tot het liesvet. Knip vervolgens met de schaar apart door de spierlaag.
    OPMERKING: Steriliseer alle apparatuur voor gebruik.
  5. Gebruik het oprolmechanisme om de peritoneale ingewanden uit de weg te bewegen totdat het lymfekanaal zichtbaar is.
  6. Gebruik een met zoutoplossing gedrenkte Q-tip (zie tabel met materialen) en beweeg de lever naar de rechterbovenkant van het lichaam en de darmen en maag naar de linkerkant van het dier.
  7. Strek de twaalfvingerige darm dwars naar links om de superieure mesenteriale slagader en het darmlymfekanaal bloot te leggen.
  8. Bereid een canuleslang van 30-40 cm lang voor door een stompe naald in de canuleslang te steken (zie materiaaltabel) en spoel een kleine hoeveelheid heparine (1.000 U / L) door de buis met een spuit van 1 ml.
    OPMERKING: Lymfestroom wordt ondersteund door de zwaartekracht om naar beneden en in de microcentrifuge-verzamelbuizen op ijs te stromen. Afhankelijk van waar de opvangijsemmer zich naast de chirurgische opstelling bevindt, moet de lengte van de canulebuis mogelijk worden aangepast.
  9. Gebruik een schaar om een schuine kant aan de punt van de canulebuis te knippen.
  10. Maak een ondiepe incisie met een irisschaar (zie tabel met materialen) in het lymfekanaal op ongeveer 5 mm van het uiterlijk in de dunne darm.
  11. Houd de canuleslang vast met een fijne tang en steek de punt voorzichtig omhoog in het kanaal.
    OPMERKING: Het is belangrijk om de canule niet te ver in het kanaal te duwen, omdat dit de lymfestroom kan voorkomen wanneer de ingetrokken organen worden teruggebracht naar hun oorspronkelijke positie.
  12. Het lymfekanaal is veel te kwetsbaar voor de manipulaties die gepaard gaan met het vastbinden van de katheter met een hechting. Gebruik in plaats daarvan een druppel cyanoacrylaatlijm (zie materiaaltabel) om de lymfecanule in het mesenteriale lymfekanaal te lijmen.
  13. Controleer op de melkachtige, witte lymfe (als pre-operatieve olijfolie werd gebruikt) of heldere lymfe (als muizen vóór de operatie nuchter zijn) die onmiddellijk door de lymfefistelcanule begint te stromen.
    OPMERKING: Controleer of de lymfecanule met succes is geplaatst en lymfe stroomt; Ga verder met de plaatsing van de intraduodenale canule.
  14. Prik met een naald van 18 G een gat door het pylorische gebied van de maag achter de pylorische sluitspier.
  15. Steek de darminfuusbuis (zie materiaaltabel) door dat gat in de maag tot ongeveer 1-2 mm voorbij de pylorische sluitspier in de twaalfvingerige darm.
  16. Bevestig met een ligatuur van de portemonnee met zijde 5-0 hechtdraad (zie materiaaltabel) met een naald naar de maag en sluit af met een druppel cyanoacrylaatlijm om lekkage te voorkomen.
  17. Start de intraduodenale infusie van 5% glucose-0,9% zoutoplossing bij 0,3 ml / h.
    OPMERKING: Bij gebruik van muizen met kleine variaties in lichaamsgewicht die ongeveer 25 g (~ 8 weken oud) zijn, is de 0,3 ml / h infusie van glucose / zoutoplossing geschikt. Als muizen dramatisch groter zijn, moet de infusiesnelheid naar boven worden bijgesteld om rekening te houden met de verandering in lichaamsgewicht en bloedvolume.
  18. Vervang de organen in de lichaamsholte en hechting (5-0) de spier- en huidweefsels afzonderlijk.
    OPMERKING: De lymfecanule en de intraduodenale voedingssonde worden beide via dezelfde incisie naar buiten gebracht. Er is geen voorrang voor het scheiden van de buizen met een hechtdraad en geen voorkeur voor de hoek van de buitenkant van de buizen.
  19. Na de operatie, maar vóór het staken van de verdoving, plaatst u de muizen voorzichtig in Snuggle-beperkingen (zie tabel met materialen) om de beweeglijkheid te beperken.
    OPMERKING: De knuffelbeperkingen voorkomen dat de muizen het hoofd vastpakken of draaien om op de steken en slangen te kauwen.
  20. Plaats de muizen vervolgens in een heldere plexiglas doos op een rotator met zacht schommelen en warm met behulp van een temperatuurgeregelde commercieel verkrijgbare amfibie / reptielverwarmingspad dat aan de zijkant van de containmentdoos is bevestigd. Zorg voor bevochtiging ook in de vorm van steriele gedeïoniseerde watercontainers op de hoeken van de containmentbox (zie tabel met materialen).
  21. Op 30 minuten voordat de isofluraan wordt teruggetrokken, dient u de muizen hun tweede pijnstillende dosis toe (Buprenex, 0,1 mg / kg, i.p.).
  22. Afhankelijk van het experiment, geef de muizen een continue intraduodenale infusie van 5% glucose-0,9% zoutoplossing met een snelheid van 0,3 ml / h gedurende 1 uur.
    OPMERKING: De 5% glucose-0,9% zoutoplossing wordt bereid met behulp van een steriele zoutoplossing (voor menselijk gebruik, pH 7,4) van de apotheek en een steriele fles voor menselijk gebruik van 50% dextrose, volgens strikte richtlijnen voor steriliteit. De oplossing moet vers worden gemaakt en worden weggegooid als de vervaldatums op de zoutzakzak of de dextrosefles zijn overschreden.
  23. Dien de muizen toe met een van de lipiden vermeld in tabel 1 als een experimentele lipide via een intraduodenale canule (zie tabel met materialen).
    OPMERKING: Voor alle gegevens in figuur 1 was SMOFlipid (20% lipide-injecteerbare emulsie, USP, zie materiaaltabel) intraduodenaal geïnfundeerd. Deze infusie zowel pre- als post-intraduodenale lipide bolus vervangt verloren vocht dat door het lymfekanaal afvoert en is een absolute vereiste. De muizen zijn nu klaar om te worden geïnfundeerd met een experimentele lipidedosis.
  24. Voer de klassieke lipide-infusie uit van een lipide-emulsiebolus van 0,3 ml (SMOFlipid 20% lipide-injecteerbare emulsie, USP) via de intra-duodenale infusiebuis (zie materiaaltabel).
  25. Na de bolusinfusie van intraduodenale lipiden, schakel de infusie terug naar 5% glucose-0,9% zoutoplossing bij 0,3 ml / h continu tot het einde van het experiment.
  26. Verzamel de lymfemonsters in vooraf gewogen microcentrifugebuizen gedurende 60 minuten en houd de lymfe op ijs. Weeg de buizen een tweede keer om het gewicht van de lymfe te bepalen die elke periode van 60 minuten wordt uitgescheiden.
    OPMERKING: Verwacht ongeveer 50-300 μL lymfe per uur te verzamelen, per muis in de ~ 6 uur na een lipidebolus van 0,3 ml.
  27. Lymfe kan tot 6 uur na de lipideninfusie stromen. Op het tijdstip van 6 uur euthanaseert u de muizen via isofluraan en cervicale dislocatie.
    OPMERKING: Een chirurg en/of laborant moet aanwezig zijn om de dieren gedurende het hele experiment te controleren. Let tijdens de observatie op stolsels in de lymfedrainage en veranderingen in het gedrag van dieren die wijzen op pijn / angst. Als de lymfegang op enig moment tijdens het experiment verstopt is, wordt het experiment beëindigd en wordt het dier geëuthanaseerd. Het dier kan technisch gezien tot 24 uur na de operatie in leven worden gehouden (volgens de regels van de IACUC-overlevingschirurgie). De overlevingskansen nemen echter in de loop van de tijd af en 6 uur is een reproduceerbare overlevingsperiode waarin lipideabsorptie nog steeds de in vivo fysiologie nabootst en het dier niet worstelt met overleving.
  28. Voer terminale weefselverzameling uit na euthanasie (stap 3.1).
    OPMERKING: Het verschil in lipidenabsorptieprofielen in de voeding bij muizen die 6 uur of 24 uur na de operatie werden gehouden, werd onlangs getest44. We ontdekten dat de 24-uursprocedure de overlevingskansen van dieren en de excursie van voedingslipiden naar de lymfe vermindert. Om deze redenen raden we de 6-uursbenadering ten zeerste aan. Dit bijgewerkte chirurgische ontwerp vermindert onnodige dierensterfte en het potentieel voor dierenleed in de postoperatieve periode. Dit ondersteunt een belangrijk doel van de American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, namelijk dierlijke "vervanging, reductie, verfijning" [ref PMID: 21595115].

3. Verzameling van luminale inhoud en slijmvliesweefsel

  1. Aan het einde van de lipide-infusieperiode van 6 uur offert u de muizen op via isofluraan en cervicale dislocatie. Bind beide uiteinden van de maag, dunne darm en blindedarm met 5-0 hechtingen om lekkage van de luminale inhoud te voorkomen.
  2. Verzamel de maag, blindedarm en dikke darm en plaats elk in een glazen buis van 15 ml. Verdeel de dunne darm in drie of vier segmenten en verzamel de luminale inhoud door het weefsel in 2-3 ml koude PBS te spoelen na het in de lengterichting opensnijden.
  3. Verwijder het darmslijmvlies bestaande uit epitheelcellen en bijbehorende lamina propria uit de spierlaag door elke sectie in 2-3 ml koude PBS te schrapen met een gebogen pincet.
  4. Plaats alle weefsels, de luminale en mucosale isolaten en de spierlaag in glazen buizen en voeg 8 ml 2: 1 vol CHCl3: MeOH toe aan elke buis.
  5. Bepaal de radioactiviteits- en/of lipideconcentraties door middel van vloeistofscintillatietelling en/of een triglyceridentestkit (zie materiaaltabel) na Folch-extractie45.

4. Dunne-laagchromatografie (TLC)

  1. Extraheer de totale lipiden van de luminale en mucosale isolaten via een gemodificeerde Folch-extractie45.
  2. Droog de geëxtraheerde lipiden in het oplosmiddel onder een stikstofverdamper en resuspensie ze vervolgens in 2:1 vol/vol CHCl3:MeOH voordat ze op een TLC-silicagelplaat worden geladen (zie materiaaltabel).
  3. Scheid de lipiden met behulp van een oplosmiddelsysteem van petroleumether, ethylether en ijsazijn (25:5:1 vol/vol/vol). Gebruik jodiumdamp voor de visualisatie van verschillende lipiden, inclusief normen.
  4. Schraap de vlekken op de TLC-plaat die overeenkomen met monoglyceriden / fosfolipide, diglyceriden, vetzuren, triglyceriden en cholesterolester in afzonderlijke scintillatieflacons voordat 4 ml van de scintillatievloeistof wordt toegevoegd (zie tabel met materialen) voor het tellen van scintillatie.
  5. Druk de gegevens uit als een percentage van de totale dosis boluslipiden of als een fractie van het totale lipide dat voor elk monster is gedetecteerd.

5. Chylomicron isolatie en karakterisering

  1. Breng de gecombineerde lymfemonsters over van de 6 h post-lipide bolus (stap 2.29) naar ultracentrifugebuizen, gemengd met 0,9% NaCl (300-500 μL), en leg vervolgens zorgvuldig over met een geschikt volume van 0,87% NaCl (300-500 μL).
    1. Ultracentrifuge (zie materiaaltabel) de monsters bij 110.000 x g bij 4 °C gedurende 16 uur. Verzamel de bovenste fractie met geïsoleerde chylomicronen en breng ze over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
  2. Bepaal chylomicron triglyceride, cholesterol en apoB concentraties volgens de onderstaande stappen.
    1. Bepaal triglyceride- en cholesterolconcentraties met behulp van een triglyceriden- en cholesteroltestkit (zie tabel met materialen).
    2. Incubeer kort 2 μL van de monsters met 200 μL enzymreagens bij 37 °C gedurende 5 minuten in een plaat met 96 putjes. Lees de plaat af met een plaatlezer bij 500 nm voor triglyceride en 600 nm voor cholesterol.
      OPMERKING: Voor de berekening van concentraties werden normen en blanco's gebruikt. ApoB-concentraties werden bepaald met behulp van Mouse ApoB ELISA Kit (zie materiaaltabel).
  3. Bepaal de deeltjesgrootte van chylomicron.
    1. Gebruik verse chylomicronmonsters bij triglycerideconcentraties van ongeveer 40 mg / dL voor TEM-beeldvorming. Plaats kort 5-10 μL van elk monster op een TEM-rooster en droog.
    2. Onderzoek het raster met een transmissie-elektronenmicroscoop en leg beelden vast. Meet de deeltjesgroottes van de lipoproteïne en analyseer ze met behulp van ImageJ-software (zie Materiaaltabel).

Representative Results

Figuur 2 toont de triglyceridensecretie in mesenteriale lymfe en de gemiddelde lymfestroomsnelheden in de meest recente n = 17 wild-type (WT) muizen die de eendaagse lymfefistelprocedure ondergingen die hier wordt beschreven. Zoals te zien is in figuur 2A, neemt de triglyceridenconcentratie in lymfe toe als reactie op een intraduodenale bolus van 300 μl SMOFLipid. De piek triglyceridenconcentratie wordt bereikt op ~ 2-3 uur na de bolus en neemt gestaag af gedurende de 6 uur tijd (onmiddellijk vóór euthanasie). Parallel aan triglyceridensecretie neemt de lymfestroomsnelheid toe vanaf de bolusinfusie van tijd 0 tot het einde van het experiment (figuur 2B).

Deze resultaten tonen aan dat de chirurgische implantatie van zowel de mesenteriale lymfegang als de intraduodenale canule heeft plaatsgevonden en representatief zijn voor een positieve controle waaraan andere lymfegehalten (hormonen, peptiden, voedingsstoffen) kunnen worden gekoppeld. Als er geen verandering is in de triglyceridenconcentratie in lymfe als reactie op bolus intraduodenale lipiden, geeft dit aan dat de operatie aanzienlijke schade aan de dunne darm heeft veroorzaakt, zodat de absorptiecapaciteit van lipiden afwezig is, of, in eerder niet-fenogetypeerde genetische modellen, zou dit suggereren dat de muis een defect in lipideabsorptie heeft dat fysiologisch betekenisvol is.

Figure 1
Figuur 1: Voorgestelde tijdlijn voor het lymfefistelmuismodel. T-4, T-3, T-2: Dubbele cannulatie duurt ongeveer 2-4 uur, gevolgd door plaatsing van de muizen in herstelkamers. T-1: Zodra de muizen zich in de herstelperiode bevinden, krijgen ze een continue duodenale infusie van 5% glucose-0,9% zoutoplossing. T0: de continue intraduodenale infusie wordt overgeschakeld van 5% glucose-0,9% zoutoplossing naar een infusie van experimentele voedingsstoffen. T0-T6: Muizen ontvangen continu intraduodenale 5% glucose in zoutoplossing of, als alternatief, continue voedingsstoffen. Lymfe wordt in deze periode elk uur verzameld. Eindpunt: Muizen worden geëuthanaseerd en weefsels kunnen worden verzameld. De figuur is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Mesenteriale lymfetriglyceridenconcentratie en stroomsnelheid. Wild-type muizen werden uitgerust met een intraduodenale voedingssonde en een mesenteriale lymfecanule. Muizen kregen een bolusinfusie van 300 μL lipide. Lymfe werd gedurende 6 uur per uur verzameld en op ijs gehouden. (A) Het gehalte aan lymfetriglyceriden werd bepaald door een chemische bepaling in elk uur aliquot lymfe. (B) In de 6 uur na bolusinfusie wordt de lymfestroom uitgezet als grammen lymfe die per uur worden uitgescheiden. Punten zijn middelen ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Lipide leveringsmethoden Aanbevelingen/instructies
Gemengde lipide-emulsie bolus Een dosis van 0,3 ml van (A ) Liposyn III 20% lipide-injecteerbare of (B) SMOFlipide 20% lipide-injecteerbare emulsie, USP, via intra-duodenale infusiebuis kan worden gebruikt. Deze geëmulgeerde lipiden zijn nuttig omdat ze niet van tevoren hoeven te worden bereid, vloeibaar zijn bij kamertemperatuur, steriel zijn en omdat ze een "licht verteerbare" mix van vrije vetzuren, triglyceriden, fosfolipiden en natriumtaurocholaat bevatten. Dit is een goede startinfusie voor muizen die pancreas- of galinsufficiënties kunnen hebben.
Triglyceride bolus 0,3 ml zacht opgewarmde olijfolie (of gezuiverde triolein) als een neutraal lipide dat een dieet weerspiegelt dat rijk is aan onverzadigd vet, reuzel (een weerspiegeling van een dieet met een hoog gehalte aan verzadigd vet) of kokosolie (weerspiegeling van een dieet met een hoog triglyceridengehalte in de middellange keten) kan allemaal worden gegeven door intra-duodenale infusiebuis of orale maagsonde. Als de experimentele triglyceride verzadigd is, moet deze worden opgewarmd om vloeibaar te zijn bij kamertemperatuur.
Bolus met gemengde maaltijd 0,3 ml Zorg ervoor dat de formulering die 0,075 g vet (21,6%), 0,5 g koolhydraten (64,0%) en 0,1125 g eiwit (14,4%) bevat en een vetarme gemengde maaltijd weerspiegelt, kan worden toegediend via intra-duodenale infusie.
Radioactief gelabelde lipide bolus 5,0 μCi 3 H-gelabeld glyceroltrioleaat en/of 1,0 μCi 14C-cholesterol in 0,3ml olijfolie kan worden gegeven via intra-duodenale infusie. 14 C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] met specifieke activiteit van 55Ci/mmol en een concentratie van 0,1mCi/ml. 3 H-TG Trioleïne [9,10-3H(N)] (3H-TG) met specifieke activiteit van 60Ci/mmol en concentratie van 1mCi/ml
Continue dosis De infusie van een van de bovenstaande experimentele voedingsformuleringen met een snelheid van 0,3 ml / h (in plaats van 0,3 ml totale bolus), zal resulteren in een gestage output van triglyceriden in de lymfe. Dit verschilt van een bolusinfusie, waarbij de triglyceridenconcentratie in lymfe piekt op ~ 2-3 uur en vervolgens terugkeert naar de uitgangsconcentraties bij ~ 6-8 uur.

Tabel 1: Tabel met lipide-infusies.

Discussion

De oorspronkelijke 2-daagse lymfefistelprocedure werd beschreven door Bollman et al.25 en de laatste 45 jaar beoefend door het laboratorium van Patrick Tso26,27. Het hier gepresenteerde protocol is een krachtige aanvulling op deze klassieke, gouden standaardmethode voor het identificeren, kwantificeren en begrijpen van de unieke chylous secreties van de dunne darm, evenals de in vivo dynamiek van de opname en het metabolisme van voedingsstoffen in de voeding, darmhormonen en darmimmuniteit.

De voordelen van dit model omvatten (1) het vermogen om continu mesenteriale lymfe te bemonsteren gedurende de voedings- en postprandiale periode in plaats van statische bemonstering op één tijdstip tijdens absorptie, spijsvertering of secretie; (2) de meting van darmhormonen en cytokines rechtstreeks in hun fysiologische compartiment in plaats van in het bloed, waar zij worden verdund en enzymatisch worden afgebroken 17,44; (3) het vermogen om de lipoproteïnen die door de dunne darm worden uitgescheiden na inname van een lipidemeel en de afwezigheid van endotheellipasen in de mesenteriale lymfe te isoleren, te kwantificeren en te karakteriseren, waardoor chylomicrontriglyceridenconcentraties en de inheemse chylomicronstructuur behouden46,47; (4) het vermogen om de lymfestroomsnelheid, de output van triglyceriden en cholesterol (of andere duodenale geïnfundeerde verbindingen), chylomicronsamenstelling en darmhormoonconcentraties direct te meten. Ten slotte maakt dit protocol het mogelijk om relatief grote hoeveelheden >50 μL lymfe per uur te verzamelen gedurende een periode van 6 uur. Naarmate de vloeistof wordt aangevuld met intra-duodenale zoutoplossing en glucose-infusie, is het lymfefistelmodel aanzienlijk verbeterd ten opzichte van andere lymfebemonsteringstechnieken en resulteert dit in stromende in plaats van statische pools van mesenteriale lymfe. Aangezien volume een belangrijke hindernis is voor lipidomische, proteomische en metabolomische benaderingen, is dit een belangrijke kracht.

Het hier beschreven 1-daagse lymfefistelprotocol van de muis heeft verschillende voordelen ten opzichte van het oorspronkelijke lymfefistelprotocol, waaronder een vermindering van het totale aantal proefdieren van eerder beschreven 2-daagse lymfefistelprotocollen26,27 vanwege een hogere overlevingskans na de operatie; een verkorting van de totale experimentele tijd van 2 dagen tot één dag; en, ten slotte, een vermindering van de herstelperiode voor muizen van 's nachts (>18 uur), waar doorbraakpijn of slechte postoperatieve resultaten kunnen optreden, tot een meer beheersbare ~ 6 uur na de operatie.

Een kenmerk van dit 1-daagse protocol is de focus op humane overwegingen en eindpunten. Deze moeten de hoogste prioriteit hebben: (1) dieren moeten intraduodenale of IV-vervangingsvloeistoffen krijgen; (2) ze moeten warm en zo pijnvrij mogelijk worden gehouden (met postoperatieve Buprenex en/of carprofen, afhankelijk van de experimentele opzet en de noodzaak om ontstekingsremmende effecten te vermijden); (3) Bloeden, trillen, diarree of tekenen van nood zijn allemaal dwingende redenen voor een humaan eindpunt. Volgens strikte IACUC-richtlijnen is isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie een goed eindpunt. Chirurgische overlevingspercentages zijn ~ 70% voor een enkele dag (vergeleken met ~ 40% voor de oorspronkelijke 2-daagse operatie), maar onderzoekers moeten niet aarzelen om het experiment te beëindigen bij een teken van nood. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het plannen van het aantal dieren.

In termen van het oplossen van deze techniek is een succesvolle plaatsing van de lymfecanule het belangrijkste knelpunt in deze chirurgische procedure. Tijdens het oefenen van de operatie helpt het om de muis ongeveer 2 uur voorafgaand aan de operatie te voorzien van 0,3 ml olijfolie. Dit zal de afscheiding van chylomicronen in het mesenteriale lymfekanaal veroorzaken, waardoor het "melkachtig" en zichtbaarder lijkt. Methyleenblauw kan ook worden gebruikt, maar is vaak minder duidelijk dan het melkachtige lymfekanaal. Als na de plaatsing van de lymfecanule en de plaatsing ervan met lijm de mesenteriale lymfe met succes door de canule in een verzamelvat stroomt, kan men doorgaan met de plaatsing van een darminfuusbuis. Af en toe kan de lymfe niet continu stromen, maar kan het weer gaan stromen wanneer het dier op de draaitafel wordt geplaatst. Let kritisch op stolsels in de lymfebuis. Deze moeten uit de buizen worden gemasseerd om tegenstroomdruk op het lymfekanaal te voorkomen.

Naast triglyceridensecretie en lymfestroomsnelheid kan deze techniek worden gebruikt om de volgende lipideabsorptiekinetiek en chylomicronkenmerken te bepalen:

Chylomicron secretie45,48,49
Onmiddellijk na een maaltijd die vet bevat, is er een voorbijgaande stijging van circulerend plasmatriglyceride. Omdat triglyceriden inherent hydrofoob zijn, moeten ze eerst worden geëmulgeerd om oplosbaar te zijn in bloed50. Dunne darm enterocyten voeren deze rol uit en verpakken triglyceriden in de voeding in chylomicron-emulsiedeeltjes51. Chylomicronen bevatten cholesterol en triglyceriden in hun kern, omgeven door fosfolipiden en apolipoproteïnen, waaronder apoB-48, apoA-I, apoA-IV en apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 is het essentiële structurele eiwit en de andere apolipoproteïnen hebben verschillende functies die nodig zijn voor chylomicronmetabolisme en klaring uit het bloed. Om de belangrijkste kenmerken van chylomicronen te bepalen, inclusief hun triglyceriden- en apolipoproteïnegehalte, moet de hier getoonde 1-daagse lymfefisteltechniek worden gebruikt. De chylomicronsecretiesnelheid is het percentage geïnfundeerd 3H-triglyceride dat wordt uitgescheiden in de lymfe en gemeten door scintillatie door het tellen van lymfemonsters per uur. Dit kan worden gecombineerd met gedetailleerde chylomicronkarakterisering 48,49,56,57,58. Uurlijkse lymfemonsters kunnen worden gecombineerd of afzonderlijk worden bewaard. Lymfe wordt overgebracht naar ultracentrifugebuizen, gemengd met 0,9% NaCl en vervolgens zorgvuldig bedekt met 300-500 μL van 0,87% NaCl. De monsters worden vervolgens ultracentrifugeren bij 110.000 x g bij 4 °C gedurende 16 uur. De bovenste fracties die geïsoleerde chylomicronen bevatten, worden verzameld en getest op triglycerideconcentraties met behulp van de triglyceridentestkit. In het kort wordt 2 μL van het chylomicron (1:10 verdunning) geïncubeerd met 200 μL enzymreagens bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een plaat met 96 putten. De plaat wordt gelezen door een plaatlezer bij 500 nm en de normen en spaties worden gebruikt voor de berekening van triglycerideconcentraties. De grootte van chylomicron kan vervolgens worden bepaald door negatieve kleuring en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)14,29. Triglyceriden en cholesterol kunnen worden gekwantificeerd door chemische assay en apolipoproteïnegehalte (apoB-48, A-I, C-II, C-III) door ELISA-kits of Western blot.

Bepaling van de primaire plaats van lipideabsorptie 48,59
Door de luminale en epitheelcelcompartimenten van de twaalfvingerige darm, jejunum en ileum te isoleren 6 h na de infusie van 3 H-triglyceride of een radioactief gelabelde gemengde maaltijd, wordt de inhoud folch geëxtraheerd om te bepalen hoeveel van de 3H-triglyceride wordt geabsorbeerd over het epitheelcelmembraan (normaal) of wordt vastgehouden in het lumen (abnormaal) langs de lengte van de dunne darm48 . Deze studies hebben vooral impact als er potentiële verschillen zijn in GI-motiliteit 60,61,62, als er een hypothese is met betrekking tot galzuren (zeer actief gedurende lipideabsorptie en zelf opnieuw geabsorbeerd in het ileum)63,64,65,66, of als er een bezorgdheid is dat voedingsstoffen worden geabsorbeerd op de verkeerde anatomische locatie (ileum of zelfs dikke darm)67 ,68,69,70.

Identificatie van mechanismen van 3H-triglyceriden die in absorberende epitheelcellen terechtkomen48
Dit wordt uitgevoerd door het percentage 3 H-triglyceriden te berekenen dat is gehydrolyseerd tot 3 H-vrij vetzuur in het darmlumen, geabsorbeerd in het slijmvlies en opnieuw veresterd tot intracellulair 3H-triglyceride voorafgaand aan secretie als chylomicronen. Dit is een krachtige marker van absorptie- / secretiedefecten, omdat het kan worden getraceerd om de beweging van triglyceriden in de voedingstriglyceriden in zijn afbraakproducten en daaropvolgende verpakking in chylomicronen te laten zien. mRNA-expressie van de vetzuurabsorptiemachinerie (CD36, FABPs, ACSLs), re-esterificatieroute (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) en apolipoproteïnen (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) kunnen verder worden gekwantificeerd door RT-PCR.

Toekomstige toepassingen van deze techniek worden alleen beperkt door interesse in darm-orgaanoverspraak, metabolisme, immuniteit, opname van voedingsstoffen, milieuverontreinigingen in de voeding of een andere ziekte met een rol in het GI-systeem. Het is waarschijnlijk dat veel overtuigende experimenten en hypothesen zijn vastgelopen vanwege de moeilijkheid om toegang te krijgen tot het kritieke mesenteriale lymfesysteem, en het doel van dit gevisualiseerde protocol is om deze techniek gemakkelijker beschikbaar te maken. Het isoleren van chylomicronen en de mesenteriale lymfe waarin ze zich aanvankelijk bevinden, is een cruciaal onderdeel van het begrijpen van het metabolisme van het hele lichaam; Het 1 Day Mouse Lymph Fistula Model is een krachtig fysiologisch model voor het bestuderen van deze gebeurtenissen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zijn de Cystic Fibrosis Foundation (Pilot and Feasibility Award 1810, aan ABK), de Rainin Foundation (Synergy Award, aan PI GJ Randolph en Co-I ABK) en de National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 aan ABK) zeer dankbaar voor hun steun aan deze studies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC 0409-4888-06
1.7 mL Eppendorf tubes Fisher Scientific, Waltham, MA, US 7200184
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ARC 0857
18 G needle Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 305199
2 Dumont micro-dissecting forceps Fine Science Tools, Foster City, CA, US 11251-35
2 Forceps ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5130
3H-TAG:  Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ART0199
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC-0409-6648-16
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK Fisher Scientific, Waltham, MA, US 11-101-0007
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick Fisher Scientific, Waltham, MA, US 14-910-501
Betadine surgical scrub Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US 1201
Bevel-cut cannula Braintree Scientific.,  Braintree , MA, US MRE025
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) HenrySchein, Warrendale, PA, US 1278184
C57BL6/J male mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine
ChloraPrep Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 260100
Cholesterol Assay Kit FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US 99902601
Cholesterol-[4-14C] American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification our own design and modifications
commercially available  amphibian/reptile heating pad ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China XHC-F035D
Cotton tip applicators Fisher Scientific, Waltham, MA, US 22363156
Duodenal infusion tube - canuala Braintree Scientific, Braintree , MA, US MRE037
Ensure Abbott Nutrition, Columbus, OH
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination Patterson Scientific, Waukesha, WI, US Gaymar T/Pump Classic
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile Mylan, Morgantown, WV, US NDC-67457-384-31
Image J Software National Institute of Health, Bethesda, Maryland,
Iris scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Isoflurane Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US NDC 66794-017-25
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus Patterson Scientific, Waukesha, WI, US mouse induction chamber
Krazy glue Elmer's products Inc., Columbus, OH, US KG484
Liposyn III 20% lipid injectable Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter Beckman Coulter, Brea, CA
Micro-dissecting Spring Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Mouse apoB ELISA Kit ABCAM Inc., Waltham, MA, US ab230932-1
Needle Holder Fine Science Tools, Foster City, CA, US 12002-12
Retractors Kent Scientific Co., Torrington, CT, US SURGI-5001
Rimadyl (Carprofen) Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US 4019449
Rotating table Barnstead Thermolyne Labquake, Zürich, Switzerland Barnstead Thermolyne
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US NDC-63323-820-01
Snuggle Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada MS 02.5PM
Surgical Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5912SC
Suture (5-0 silk with needle) DemeTECH, Miami Lakes, FL, US DT-719
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) JEOL, Peabody, MA
Triglyceride Assay Kit Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom TR210
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid Perkin Elmer, Hebron, KY, US 6013119
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 SORVALL RC M120 GX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natale, G., Bocci, G., Ribatti, D. Scholars and Scientists in the History of the Lymphatic System. Journal of Anatomy. 231 (3), 417-429 (2017).
  2. Loukas, M., et al. The lymphatic system: A historical perspective. Clinical Anatomy. 24 (7), 807-816 (2011).
  3. Suy, R., Thomis, S., Fourneau, I. The discovery of the lymphatic system in the seventeenth century. Part II: The discovery of Chyle vessels. Acta Chirurgica Belgica. 116 (5), 325-331 (2016).
  4. Azzali, G. Historical notes on the lymphatic vascular system. Acta Bio-medica de L'Ateneo Parmense. 61 (3-4), 113-125 (1990).
  5. Irschick, R., Siemon, C., Brenner, E. The history of anatomical research of lymphatics - From the ancient times to the end of the European Renaissance. Annals of Anatomy. 223, 49-69 (2019).
  6. Swartz, M. A. The physiology of the lymphatic system. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 3-20 (2001).
  7. Deitch, E. A. Gut lymph and lymphatics: A source of factors leading to organ injury and dysfunction. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 103-111 (2010).
  8. Tso, P., Gollamudi, S. R. Pluronic L-81: A potent inhibitor of the transport of intestinal chylomicrons. American Journal of Physiology. 247, 32-36 (1984).
  9. Tso, P., Karlstad, M. D., Bistrian, B. R., DeMichele, S. J. Intestinal digestion, absorption, and transport of structured triglycerides and cholesterol in rats. American Journal of Physiology. 268, 568-577 (1995).
  10. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. American Journal of Physiology. 261, 530-538 (1991).
  11. Bogunovic, M., et al. Origin of the lamina propria dendritic cell network. Immunity. 31 (3), 513-525 (2009).
  12. Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Science Translational Medicine. 6 (237), (2014).
  13. Ji, Y., Sakata, Y., Tso, P. Nutrient-induced inflammation in the intestine. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (4), 315-321 (2011).
  14. Ji, Y., Sakata, Y., Yang, Q., Tso, P. Intestinal mucosal mast cells is activated by fat absorption. Gastroenterology. 140 (5), (2011).
  15. Wang, F., et al. Chronic high-fat feeding increases mixed meal-induced incretin secretion in Sprague-Dawley rats. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (10), 807-815 (2015).
  16. Kindel, T. L., Yoder, S. M., D'Alessio, D. A., Tso, P. The effect of duodenal-jejunal bypass on glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in Wistar rats. Obesity Surgery. 20 (6), 768-775 (2010).
  17. Kohan, A. B., Yoder, S. M., Tso, P. Using the lymphatics to study nutrient absorption and the secretion of gastrointestinal hormones. Physiology & Behavior. 105 (1), 82-88 (2011).
  18. Yoder, S. M., Yang, Q., Kindel, T. L., Tso, P. Stimulation of incretin secretion by dietary lipid: Is it dose dependent. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (2), 299-305 (2009).
  19. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PLoS One. 4 (12), 8442 (2009).
  20. Vors, C., et al. Postprandial endotoxemia linked with chylomicrons and lipopolysaccharides handling in obese versus lean men: A lipid dose-effect trial. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (9), 3427-3435 (2015).
  21. Ghoshal, S., Witta, J., Zhong, J., de Villiers, W., Eckhardt, E. Chylomicrons promote intestinal absorption of lipopolysaccharides. Journal of Lipid Research. 50 (1), 90-97 (2009).
  22. Jandacek, R. J., Rider, T., Keller, E. R., Tso, P. The effect of olestra on the absorption, excretion and storage of 2,2',5,5' tetrachlorobiphenyl; 3,3',4,4' tetrachlorobiphenyl; and perfluorooctanoic acid. Environment International. 36 (8), 880-883 (2010).
  23. Jandacek, R. J., Tso, P. Organochlorine compounds are absorbed via lymph and portal circulation. The FASEB Journal. 22, (2008).
  24. Utermann, G., Beisiegel, U. Apolipoprotein A-IV: A protein occurring in human mesenteric lymph chylomicrons and free in plasma. Isolation and quantification. European Journal of Biochemistry. 99 (2), 333-344 (1979).
  25. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 33 (10), 1349-1352 (1948).
  26. Tso, P., Balint, J. A., Rodgers, J. B. Effect of hydrophobic surfactant (pluronic L-81) on lymphatic lipid transport in the rat. American Journal of Physiology. 239 (5), 348-353 (1980).
  27. Liu, M., et al. Sexual dimorphism in intestinal absorption and lymphatic transport of dietary lipids. Journal of Physiology. 599 (22), 5015-5030 (2021).
  28. Manolas, K. J., et al. Lymph, pancreatic and gastrointestinal hormones in response to feeding in the conscious pig. European Surgical Research. 17 (5), 324-332 (1985).
  29. Lascelles, A. K., Morris, B. Surgical techniques for the collection of lymph from unanaesthetized sheep. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 46, 199-205 (1961).
  30. Jensen, L. T., Olesen, H. P., Risteli, J., Lorenzen, I. External thoracic duct-venous shunt in conscious pigs for long term studies of connective tissue metabolites in lymph. Laboratory Animal Science. 40 (6), 620-624 (1990).
  31. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 45-60 (2001).
  32. Yasunaga, K., Saito, S., Zhang, Y. -L., Hernandez-Ono, A., Ginsberg, H. N. Effects of triacylglycerol and diacylglycerol oils on blood clearance, tissue uptake, and hepatic apolipoprotein B secretion in mice. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1108-1121 (2007).
  33. Curtin, A., et al. Elevated triglyceride-rich lipoproteins in diabetes. A study of apolipoprotein B-48. Acta Diabetologica. 33 (3), 205-210 (1996).
  34. Gordts, P. L. S. M., et al. ApoC-III inhibits clearance of triglyceride-rich lipoproteins through LDL family receptors. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2855-2866 (2016).
  35. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78 (5), 1287-1295 (1986).
  36. Ormai, S., Palkovits, M. Size distribution of lymphocytes in the thoracic duct lymph in rat after lymphocyte mobilization induced by polymethacrylic acid. Blut Zeitschrift für die Gesamte Blutforschung. 24 (3), 161-165 (1972).
  37. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19565-19572 (1999).
  38. Nollevaux, G., et al. Development of a serum-free co-culture of human intestinal epithelium cell-lines (Caco-2/HT29-5M21). BMC Cell Biology. 7 (1), 20 (2006).
  39. Li, D., Dong, H., Kohan, A. B. The Isolation, Culture, and Propagation of Murine Intestinal Enteroids for the Study of Dietary Lipid Metabolism. Organoids. Methods in Molecular Biology. 1576, Humana. New York, NY. 195-204 (2019).
  40. Jattan, J. J., et al. Using murine-derived primary intestinal enteroids for studies of dietary triglyceride absorption and lipoprotein synthesis, and to determine the role of intestine-specific ApoC-III in the intestine. Journal of Lipid Research. 58 (5), 853-865 (2017).
  41. Haring, E., et al. Bile acids regulate intestinal antigen presentation and reduce graft-versus-host disease without impairing the graft-versus-leukemia effect. Haematologica. 106 (8), 2131-2146 (2021).
  42. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: Reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 269-289 (2015).
  43. Deacon, C. F. Circulation and degradation of GIP and GLP-1. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 761-765 (2004).
  44. Dedousis, N., Teng, L., Kanshana, J. S., Kohan, A. B. A single-day mouse mesenteric lymph surgery in mice: an updated approach to study dietary lipid absorption, chylomicron secretion, and lymphocyte dynamics. J Lipid Res. 63 (11), 100284 (2022).
  45. Li, D., et al. Intestinal basolateral lipid substrate transport is linked to chylomicron secretion and is regulated by ApoC-III. Journal of Lipid Research. 60 (9), 1503-1515 (2019).
  46. Glatzle, J., et al. Chylomicron components mediate intestinal lipid-induced inhibition of gastric motor function. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 282 (1), 86-91 (2002).
  47. Huang, J., Sloop, C. H., Roheim, P. S., Wong, L. Lipoprotein lipase and hepatic triacylglycerol lipase activities in peripheral and skeletal muscle lymph. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 10 (5), 720-726 (1990).
  48. Wang, F., et al. Overexpression of apolipoprotein C-III decreases secretion of dietary triglyceride into lymph. Physiological Reports. 2 (3), 00247 (2014).
  49. Kohan, A. B., et al. Apolipoprotein A-IV regulates chylomicron metabolism-Mechanism and function. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (6), 628-636 (2012).
  50. Hayashi, H., et al. Fat feeding increases size, but not number, of chylomicrons produced by small intestine. American Journal of Physiology. 259 (5), 709-719 (1990).
  51. Tso, P., Balint, J. A. Formation and transport of chylomicrons by enterocytes to the lymphatics. American Journal of Physiology. 250 (6), 715-726 (1986).
  52. Bhattacharya, S., Redgrave, T. G. The content of apolipoprotein B in chylomicron particles. Journal of Lipid Research. 22 (5), 820-828 (1981).
  53. Björkegren, J., Karpe, F., Milne, R. W., Hamsten, A. Differences in apolipoprotein and lipid composition between human chylomicron remnants and very low density lipoproteins isolated from fasting and postprandial plasma. Journal of Lipid Research. 39 (7), 1412-1420 (1998).
  54. Martins, I. J., Sainsbury, A. J., Mamo, J. C., Redgrave, T. G. Lipid and apolipoprotein B48 transport in mesenteric lymph and the effect of hyperphagia on the clearance of chylomicron-like emulsions in insulin-deficient rats. Diabetologia. 37 (3), 238-246 (1994).
  55. Mar, R., et al. Association of the APOLIPOPROTEIN A1/C3/A4/A5 gene cluster with triglyceride levels and LDL particle size in familial combined hyperlipidemia. Circulation Research. 94 (7), 993-999 (2004).
  56. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 086005 (2012).
  57. Nauli, A. M., et al. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiological Reports. 2 (6), 192-196 (2014).
  58. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1290-1297 (2005).
  59. Kohan, A. B., et al. Is apolipoprotein A-IV rate limiting in the intestinal transport and absorption of triglyceride. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (12), 1128-1135 (2013).
  60. De Lisle, R. C. Altered transit and bacterial overgrowth in the cystic fibrosis mouse small intestine. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (1), 104-111 (2007).
  61. Debas, H. T., Farooq, O., Grossman, M. I. Inhibition of gastric emptying is a physiological action of cholecystokinin. Gastroenterology. 68 (5), 1211-1217 (1975).
  62. Spiller, R. C., et al. Further characterisation of the 'ileal brake' reflex in man--Effect of ileal infusion of partial digests of fat, protein, and starch on jejunal motility and release of neurotensin, enteroglucagon, and peptide YY. Gut. 29 (8), 1042-1051 (1988).
  63. Battle, M. A., et al. GATA4 is essential for jejunal function in mice. Gastroenterology. 135 (5), 1676-1686 (2008).
  64. Morgan, R. G., Borgström, B. The mechanism of fat absorption in the bile fistula rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 228-243 (1969).
  65. Davidson, N. O., Kollmer, M. E., Glickman, R. M. Apolipoprotein B synthesis in rat small intestine: Regulation by dietary triglyceride and biliary lipid. Journal of Lipid Research. 27 (1), 30-39 (1986).
  66. Bouchi, R., et al. FOXO1 inhibition yields functional insulin-producing cells in human gut organoid cultures. Nature Communications. 5, 4242 (2014).
  67. Bijvelds, M. J. C., et al. Fat absorption in cystic fibrosis mice is impeded by defective lipolysis and post-lipolytic events. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 288 (4), 646-653 (2005).
  68. Struyvenberg, M. R., Martin, C. R., Freedman, S. D. Practical guide to exocrine pancreatic insufficiency - Breaking the myths. BMC Medicine. 15 (1), 29 (2017).
  69. Tickell, K. D., Atlas, H. E., Walson, J. L. Environmental enteric dysfunction: A review of potential mechanisms, consequences and management strategies. BMC Medicine. 17 (1), 181 (2019).
  70. Lo, C. M., et al. Cholecystokinin knockout mice are resistant to high-fat diet-induced obesity. Gastroenterology. 138 (5), 1997-2005 (2010).

Tags

Biologie Nummer 189
De isolatie van stromende mesenteriale lymfe bij muizen om <em>in vivo</em> kinetiek van lipideabsorptie in de voeding en chylomicronsecretie te kwantificeren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. … More

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. B. The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion. J. Vis. Exp. (189), e64338, doi:10.3791/64338 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter