El presente protocolo describe un protocolo quirúrgico detallado para aislar la linfa intestinal que fluye en respuesta a infusiones de nutrientes intraduodenales en ratones. Esto permite la determinación fisiológica de la absorción total de lípidos intestinales y la síntesis y secreción de quilomicrones en respuesta a diversos nutrientes experimentales.
Las lipoproteínas intestinales, especialmente los quilomicrones ricos en triglicéridos, son un importante impulsor del metabolismo, la inflamación y las enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, aislar las lipoproteínas intestinales es muy difícil in vivo porque primero se secretan desde el intestino delgado hacia los linfáticos mesentéricos. La linfa que contiene quilomicron luego se vacía en la vena subclavia desde el conducto torácico para entregar componentes de la comida al corazón, los pulmones y, en última instancia, la circulación de todo el cuerpo. Aislar los quilomicrones ingenuos es imposible de la sangre ya que el triglicérido de quilomicrones sufre hidrólisis inmediatamente después de la interacción con la lipoproteína lipasa y otros receptores de lipoproteínas en circulación. Por lo tanto, el procedimiento original de fístula linfática de 2 días, descrito por Bollman et al. en ratas, se ha utilizado históricamente para aislar la linfa mesentérica fresca antes de su entrada en la vena torácica. Ese protocolo ha sido mejorado y profesionalizado por el laboratorio de Patrick Tso durante los últimos 45 años, lo que permite el análisis de estas lipoproteínas críticas y secreciones del intestino. El procedimiento de fístula linfática Tso ahora se ha actualizado y se presenta aquí visualmente por primera vez. Este procedimiento revisado es una técnica quirúrgica de un solo día para instalar una sonda de alimentación duodenal, canular el conducto linfático mesentérico y recolectar linfa después de una comida en ratones conscientes. Los principales beneficios de estas nuevas técnicas incluyen la capacidad de recolectar linfa de ratones de forma reproducible (que aprovecha el poder de los modelos genéticos de ratón); la reducción del tiempo de anestesia para ratones durante la implantación del tubo de infusión duodenal y la cánula linfática; la capacidad de muestrear continuamente la linfa durante la alimentación y el período postprandial; la capacidad de medir cuantitativamente hormonas y citoquinas antes de su dilución e hidrólisis enzimática en sangre; y la capacidad de recolectar grandes cantidades de linfa para aislar lipoproteínas intestinales. Esta técnica es una herramienta poderosa para medir directa y cuantitativamente la absorción de nutrientes en la dieta, la síntesis intestinal de lipoproteínas y la secreción de quilomicrones.
La importancia fisiológica del sistema linfático mesentérico
Los linfáticos mesentéricos han sido descritos de alguna forma desde ~300 a.C. cuando Herófilo describió el sistema portal hepático y todas las “venas absorbentes en los intestinos”1,2,3,4,5. Durante más de 1.700 años después de esta descripción inicial, una característica definitoria de los linfáticos intestinales fue la presencia de líquido lechoso en la linfa mesentérica poco después de una comida3. Ahora se sabe que la linfa lechosa que contiene quilomicron (linfa “quilosa”) no drena en la vena porta y el hígado, sino que viaja a través de la cisterna quili hacia el conducto torácico y, en última instancia, se une a la sangre en la vena subclavia izquierda6. Debido a esta disposición anatómica, la linfa quilosa viaja primero a través del corazón y los pulmones antes de circular por el resto del cuerpo. Esto significa que el corazón y los pulmones obtienen un “primer paso” en las secreciones en la linfa mesentérica7.
Un papel importante de los linfáticos mesentéricos es su transporte de lípidos dietéticos desde el intestino delgado 8,9,10. Anatómicamente, quilomicrones, células inmunes intestinales 11,12,13,14, hormonas intestinales 15,16,17,18, antígenos 19,20,21, compuestos lipofílicos no quilomicrones 22,23 , y el exceso de líquido entra en los lacteales subyacentes a la membrana basal de los enterocitos y luego se concentran a través de los capilares linfáticos a los ganglios linfáticos mesentéricos. Es probable que haya muchos componentes linfáticos mesentéricos desconocidos, incluidos metabolitos, antígenos, contaminantes ambientales, nutrientes y moléculas de señalización.
Los componentes de la linfa mesentérica no se han identificado sistemáticamente, en gran parte debido a la dificultad de aislar la linfa mesentérica. El acceso a la linfa mesentérica siempre ha sido un desafío serio porque los conductos linfáticos son incoloros, y excepto después de una comida grasa cuando se vuelven quilosos y lechosos, los linfáticos mesentéricos contienen líquido linfático incoloro 6,8,9,10.
Métodos actuales y comunes para aislar la linfa intestinal
No se puede acceder a la linfa mesentérica en humanos (excepto en circunstancias raras y extremas en las que se ha producido un traumatismo gastrointestinal grave)24. La recolección linfática in vivo es quirúrgicamente compleja y exigente. El procedimiento original de fístula linfática de 2 días fue descrito por Bollman et al.25 y ha sido mejorado y profesionalizado por el laboratorio de Patrick Tso durante los últimos 45 años 26,27. El procedimiento de fístula linfática permite a los investigadores recolectar linfa que fluye de animales conscientes durante un período de infusión de lípidos duodenales de 6 h.
El modelo de fístula linfática se ha utilizado principalmente en ratas para medir la tasa de flujo linfático, la producción de triglicéridos y colesterol (u otros compuestos con infusión duodenal), la composición de quilomicrones y las concentraciones hormonales intestinales. En menor medida, esta técnica también se puede utilizar en ratones, aunque la supervivencia quirúrgica y el volumen linfático sufren. Debido a las dificultades para ver los conductos linfáticos mesentéricos, los métodos históricos han incluido la linfa mesentérica canulante en animales más grandes como mini-cerdos28, ovejas29, cerdos30, perros31 y ratas17. Trabajar con estos modelos más grandes requiere muchos recursos y no permite estudios en modelos knock-in o knock-out.
También se han utilizado enfoques alternativos. Los quilomicrones pueden aislarse de la sangre en estado postprandial (aunque estos serán parcialmente hidrolizados por la lipoproteína lipasa plasmática)32,33,34,35. El conducto torácico también puede ser canulado, aunque la linfa recolectada allí contiene una mezcla de linfa mesentérica y drenaje linfático extraintestinal26,36. In vitro, las células Caco-2 secretan una partícula similar al quilomicron en respuesta al tratamiento con ácidos grasos, y estas células pueden ser cocultivadas con células endoteliales o vasculares linfáticas relevantes37,38. Se ha demostrado que los cultivos de organoides intestinales humanos y de ratón procesan lípidos apicales y secretan quilomicrones 39,40,41,42. Estos modelos son muy ventajosos y permiten conocimientos mecanicistas sobre la fisiología del intestino delgado, pero no pueden replicar la complejidad, los gradientes fisicoquímicos o el flujo linfático dinámico de los linfáticos mesentéricos in situ.
Ventajas del modelo de fístula linfática de ratón de 1 día presentado aquí
Con respecto a estos otros métodos de aislamiento de lipoproteínas intestinales, la técnica de fístula linfática Tso Lab se ha considerado tradicionalmente la técnica estándar de oro para medir la absorción de nutrientes dietéticos en la linfa mesentérica. Esta técnica in vivo tiene la ventaja de capturar aspectos fisiológicos clave de la absorción de lípidos en la dieta: la apariencia dinámica de los compuestos durante el período de absorción, lo que requiere el muestreo repetido de linfa mesentérica que fluye en animales vivos con nutrientes duodenales. Esta técnica quirúrgica también mide las hormonas intestinales y las citoquinas directamente en su compartimento fisiológico en lugar de en la sangre, donde se diluyen y degradan enzimáticamente17,43.
Si la pregunta experimental requiere una comprensión de la dinámica de la secreción lipídica o la absorción dinámica y el metabolismo de cualquier compuesto o fármaco GI hidrófobo, entonces esta técnica no solo es apropiada sino que también es el único enfoque que interpola el movimiento del contenido luminal desde el intestino proximal al distal (estómago a colon) y desde la superficie apical a la basolateral (contenido luminal a través de enterocitos a lacteales y circulación portal). Como esta técnica emplea la entrega luminal de nutrientes a través del catéter intraduodenal, y debido a que la linfa mesentérica que fluye se desvía y se recolecta, todo el aparato de absorción está bajo control experimental y se puede usar para evaluar cualitativamente los perfiles de absorción del intestino delgado.
Presentado visualmente aquí por primera vez es una actualización importante del modelo de fístula linfática Tso Lab, que (1) reduce el tiempo experimental a un período de implantación quirúrgica y recolección experimental de 1 día; (2) mejora la supervivencia del ratón y las consideraciones de bienestar animal; y (3) aumenta la reproducibilidad del enfoque en ratones para aprovechar el poder de los modelos genéticos de ratón. Esta técnica debe considerarse un estándar de oro para todas las cuestiones experimentales de secreciones intestinales, lipoproteínas o absorción de lípidos en la dieta y es la mejor técnica para la determinación de alta fidelidad de la cinética de absorción de lípidos y quilomicrones.
El procedimiento original de fístula linfática de 2 días fue descrito por Bollman et al.25 y practicado por el laboratorio de Patrick Tso durante los últimos 45 años 26,27. El protocolo presentado aquí es una poderosa adición a este método clásico y estándar de oro para identificar, cuantificar y comprender las secreciones quilosas únicas del intestino delgado, así como la dinámica in vivo de la absorción y el metabolismo de nutrientes en la dieta, las hormonas intestinales y la inmunidad intestinal.
Las ventajas de este modelo incluyen (1) la capacidad de muestrear continuamente la linfa mesentérica durante todo el período de alimentación y postprandial en lugar de muestreo estático en un punto de tiempo durante la absorción, digestión o secreción; (2) la medición de hormonas intestinales y citoquinas directamente en su compartimento fisiológico en lugar de en la sangre, donde se diluyen y degradan enzimáticamente17,44; (3) la capacidad de aislar, cuantificar y caracterizar las lipoproteínas secretadas por el intestino delgado después de la ingestión de una harina lipídica y la ausencia de lipasas endoteliales en la linfa mesentérica, lo que preserva las concentraciones de triglicéridos quilomicrones y la estructura de quilomicrones nativos46,47; (4) la capacidad de medir directamente la tasa de flujo linfático, la producción de triglicéridos y colesterol (u otros compuestos con infusión duodenal), la composición de quilomicrones y las concentraciones hormonales intestinales. Finalmente, este protocolo permite recolectar cantidades relativamente grandes de >50 μL de linfa cada hora durante un período de 6 horas. A medida que el líquido se repone con solución salina intraduodenal e infusión de glucosa, el modelo de fístula linfática mejora significativamente sobre otras técnicas de muestreo linfático y da como resultado grupos de linfa mesentérica que fluyen en lugar de estáticos. Como el volumen es un obstáculo importante para los enfoques lipidómicos, proteómicos y metabolómicos, esta es una fortaleza importante.
El protocolo de fístula linfática de ratón de 1 día descrito aquí tiene varias ventajas sobre el protocolo original de fístula linfática, incluida una reducción en el número total de animales experimentales de los protocolos de fístula linfática de 2 días descritos anteriormente26,27 debido a una mayor tasa de supervivencia después de la cirugía; una reducción en el tiempo experimental total de 2 días a un solo día; y, finalmente, una reducción en el período de recuperación para ratones de durante la noche (>18 h), donde puede ocurrir dolor irruptivo o malos resultados postquirúrgicos, a un período postoperatorio más manejable de ~ 6 h después de la cirugía.
Una característica de este protocolo de 1 día es el enfoque en consideraciones humanas y puntos finales. Estos deben tener la máxima prioridad: (1) los animales deben recibir líquidos de reemplazo intraduodenal o IV; (2) deben mantenerse calientes y lo más indoloros posible (con Buprenex y/o carprofeno postoperatorio, dependiendo del diseño experimental y la necesidad de evitar efectos antiinflamatorios); (3) sangrado, temblores, diarrea o signos de angustia son razones convincentes para un criterio de valoración humano. Según las estrictas pautas de IACUC, el isoflurano seguido de dislocación cervical es un buen punto final. Las tasas de supervivencia quirúrgica son ~ 70% para un solo día (en comparación con ~ 40% para la cirugía original de 2 días), pero los investigadores no deben dudar en terminar el experimento a un signo de angustia. Esto debe tenerse en cuenta al planificar el número de animales.
En términos de solución de problemas de esta técnica, la colocación exitosa de la cánula linfática es el principal cuello de botella en este procedimiento quirúrgico. Mientras practica la cirugía, ayuda a sonda nasogástrica al ratón con 0,3 ml de aceite de oliva aproximadamente 2 h antes de la cirugía. Esto causará la secreción de quilomicrones en el conducto linfático mesentérico, haciéndolo parecer “lechoso” y más visible. El azul de metileno también se puede usar, pero a menudo es menos obvio que el conducto linfático lechoso. Si después de la colocación de la cánula linfática y su colocación con pegamento, la linfa mesentérica fluye con éxito a través de la cánula hacia un recipiente de recolección, entonces se puede proceder con la colocación de un tubo de infusión duodenal. Ocasionalmente, la linfa puede no fluir continuamente, pero puede comenzar a fluir nuevamente cuando el animal se coloca en la mesa giratoria. Críticamente, tenga cuidado con los coágulos dentro del tubo linfático. Estos deben ser masajeados fuera de los tubos para evitar la presión de reflujo en el conducto linfático.
Además de la secreción de triglicéridos y la tasa de flujo linfático, esta técnica se puede utilizar para determinar la siguiente cinética de absorción de lípidos y las características de los quilomicrones:
Secreción de quilomicrones45,48,49
Inmediatamente después de una comida que contiene grasa, hay un aumento transitorio en los triglicéridos plasmáticos circulantes. Como los triglicéridos son inherentemente hidrofóbicos, primero deben emulsionarse para ser solubles en sangre50. Los enterocitos del intestino delgado desempeñan esta función y empaquetan triglicéridos dietéticos en partículas de emulsión de quilomicrones51. Los quilomicrones contienen colesterol y triglicéridos dietéticos en su núcleo, rodeados de fosfolípidos y apolipoproteínas, incluyendo apoB-48, apoA-I, apoA-IV y apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 es la proteína estructural esencial, y las otras apolipoproteínas tienen varias funciones requeridas para el metabolismo de quilomicrones y la eliminación de la sangre. Para determinar las características clave de los quilomicrones, incluido su contenido de triglicéridos y apolipoproteínas, se debe utilizar la técnica de fístula linfática de 1 día que se muestra aquí. La tasa de secreción de quilomicrones es el porcentaje de 3triglicéridos H infundidos que se secretan en la linfa y se miden por centelleo contando muestras de linfa por hora. Esto se puede combinar con la caracterización detallada de quilomicrones 48,49,56,57,58. Las muestras de linfa por hora se pueden combinar o mantener por separado. La linfa se transfiere a tubos de ultracentrífuga, se mezcla con NaCl al 0,9% y luego se superpone cuidadosamente con 300-500 μL de NaCl al 0,87%. A continuación, las muestras se centrifugan a 110.000 g a 4 °C durante 16 h. Las fracciones superiores que contienen quilomicrones aislados se recogen y se analizan para determinar las concentraciones de triglicéridos utilizando el kit de ensayo de triglicéridos. Brevemente, 2 μL del quilomicron (dilución 1:10) se incuban con 200 μL de reactivo enzimático a temperatura ambiente durante 10 min en una placa de 96 pocillos. La placa es leída por un lector de placas a 500 nm, y los patrones y espacios en blanco se utilizan para el cálculo de las concentraciones de triglicéridos. El tamaño de los quilomicrones puede determinarse mediante tinción negativa y microscopía electrónica de transmisión (TEM)14,29. Los triglicéridos y el colesterol se pueden cuantificar mediante ensayo químico y contenido de apolipoproteínas (apoB-48, A-I, C-II, C-III) mediante kits ELISA o Western blot.
Determinación del sitio primario de absorción de lípidos 48,59
Al aislar los compartimentos de células luminales y epiteliales del duodeno, yeyuno e íleon a las 6 h después de la infusión de 3 triglicéridos H o una comida mixta radiomarcada, se extrae el contenido de Folch para determinar qué cantidad del triglicérido 3 H seabsorbe a través de la membrana celular epitelial (normal) o se retiene en el lumen (anormal) a lo largo del intestino delgado48 . Estos estudios son particularmente impactantes si existen diferencias potenciales en la motilidad GI 60,61,62, si existe una hipótesis con respecto a los ácidos biliares (altamente activos durante la absorción de lípidos y reabsorbidos en el íleon)63,64,65,66, o si existe la preocupación de que los nutrientes estén siendo absorbidos en la ubicación anatómica incorrecta (íleon o incluso colon)67 ,68,69,70.
Identificación de mecanismos de tráfico de 3H-triglicéridos en células epiteliales absorbentes48
Esto se realiza calculando el porcentaje de 3 triglicéridos H hidrolizados a 3ácidos grasos libres de Hen la luz intestinal, absorbidos en la mucosa y reesterificados en triglicéridos 3 Hintracelulares antes de la secreción como quilomicrones. Este es un poderoso marcador de defectos de absorción / secreción, ya que se puede rastrear para mostrar el movimiento de los triglicéridos dietéticos en sus productos de degradación y el posterior envasado en quilomicrones. La expresión de ARNm de la maquinaria de absorción de ácidos grasos (CD36, FABPs, ACSLs), la vía de reesterificación (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) y las apolipoproteínas (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) pueden cuantificarse adicionalmente mediante RT-PCR.
Las aplicaciones futuras de esta técnica solo están limitadas por el interés en la diafonía entre el intestino y los órganos, el metabolismo, la inmunidad, la absorción de nutrientes, los contaminantes dietéticos ambientales o cualquier otra enfermedad con un papel en el sistema gastrointestinal. Es probable que muchos experimentos e hipótesis convincentes se hayan estancado debido a la dificultad para acceder al sistema linfático mesentérico crítico, y el objetivo de este protocolo visualizado es hacer que esta técnica esté más fácilmente disponible. Aislar los quilomicrones y la linfa mesentérica en la que residen inicialmente es una parte crítica de la comprensión del metabolismo de todo el cuerpo; El modelo de fístula linfática de ratón de 1 día es un poderoso modelo fisiológico para estudiar estos eventos.
The authors have nothing to disclose.
Estamos extremadamente agradecidos a la Fundación de Fibrosis Quística (Premio Piloto y de Viabilidad 1810, a ABK), la Fundación Rainin (Premio Synergy, a PI GJ Randolph y Co-I ABK) y los Institutos Nacionales de Salud (R01DK118239, R03DK116011 a ABK) por su apoyo a estos estudios.
0.9% Sodium Chloride Injection, USP sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC 0409-4888-06 | |
1.7 mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 7200184 | |
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ARC 0857 | |
18 G needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 305199 | |
2 Dumont micro-dissecting forceps | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 11251-35 | |
2 Forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5130 | |
3H-TAG: Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ART0199 | |
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC-0409-6648-16 | |
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 11-101-0007 | |
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 14-910-501 | |
Betadine surgical scrub | Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US | 1201 | |
Bevel-cut cannula | Braintree Scientific., Braintree , MA, US | MRE025 | |
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) | HenrySchein, Warrendale, PA, US | 1278184 | |
C57BL6/J male mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine | ||
ChloraPrep | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 260100 | |
Cholesterol Assay Kit | FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US | 99902601 | |
Cholesterol-[4-14C] | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification | our own design and modifications | ||
commercially available amphibian/reptile heating pad | ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China | XHC-F035D | |
Cotton tip applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 22363156 | |
Duodenal infusion tube – canuala | Braintree Scientific, Braintree , MA, US | MRE037 | |
Ensure | Abbott Nutrition, Columbus, OH | ||
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | Gaymar T/Pump Classic | |
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile | Mylan, Morgantown, WV, US | NDC-67457-384-31 | |
Image J Software | National Institute of Health, Bethesda, Maryland, | ||
Iris scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
Isoflurane | Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US | NDC 66794-017-25 | |
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | mouse induction chamber | |
Krazy glue | Elmer's products Inc., Columbus, OH, US | KG484 | |
Liposyn III 20% lipid injectable | Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA | ||
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
Micro-dissecting Spring Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
Mouse apoB ELISA Kit | ABCAM Inc., Waltham, MA, US | ab230932-1 | |
Needle Holder | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 12002-12 | |
Retractors | Kent Scientific Co., Torrington, CT, US | SURGI-5001 | |
Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US | 4019449 | |
Rotating table Barnstead Thermolyne | Labquake, Zürich, Switzerland | Barnstead Thermolyne | |
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP | Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US | NDC-63323-820-01 | |
Snuggle | Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada | MS 02.5PM | |
Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5912SC | |
Suture (5-0 silk with needle) | DemeTECH, Miami Lakes, FL, US | DT-719 | |
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) | JEOL, Peabody, MA | ||
Triglyceride Assay Kit | Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom | TR210 | |
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid | Perkin Elmer, Hebron, KY, US | 6013119 | |
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 | SORVALL RC M120 GX |