Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isoleringen av flytande mesenterisk lymf hos möss för att kvantifiera in vivo-kinetik för lipidabsorption i kosten och chylomikronsekretion

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64338
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh

Summary

Detta protokoll beskriver ett detaljerat kirurgiskt protokoll för att isolera strömmande tarmlymf som svar på intraduodenala näringsinfusioner hos möss. Detta möjliggör fysiologisk bestämning av total intestinal lipidabsorption och chylomikronsyntes och utsöndring som svar på olika experimentella näringsämnen.

Abstract

Intestinala lipoproteiner, särskilt triglyceridrika chylomikroner, är en viktig drivkraft för metabolism, inflammation och hjärt-kärlsjukdomar. Att isolera intestinala lipoproteiner är dock mycket svårt in vivo eftersom de först utsöndras från tunntarmen till mesenteriska lymfatiken. Chylomikroninnehållande lymfa töms sedan i den subklaviska venen från bröstkanalen för att leverera komponenter i måltiden till hjärtat, lungorna och slutligen hela kroppscirkulationen. Att isolera naiva chylomikroner är omöjligt från blod eftersom chylomikrontriglycerid genomgår hydrolys omedelbart efter interaktion med lipoproteinlipas och andra lipoproteinreceptorer i omlopp. Därför har den ursprungliga 2-dagars lymffistelproceduren, beskriven av Bollman et al. hos råttor, historiskt använts för att isolera färsk mesenterisk lymf innan den kommer in i bröstvenen. Det protokollet har förbättrats och professionaliserats av Patrick Tsos laboratorium under de senaste 45 åren, vilket möjliggör analys av dessa kritiska lipoproteiner och sekret från tarmen. Tso lymffistelproceduren har nu uppdaterats och presenteras här visuellt för första gången. Detta reviderade förfarande är en endags kirurgisk teknik för att installera ett duodenalt matningsrör, kanylera den mesenteriska lymfkanalen och samla lymf efter en måltid hos medvetna möss. De stora fördelarna med dessa nya tekniker inkluderar förmågan att reproducerbart samla lymf från möss (som utnyttjar kraften i genetiska musmodeller); den reducerade anestesitiden för möss under implantationen av duodenalinfusionsröret och lymfkanylen; förmågan att kontinuerligt prova lymf under utfodring och postprandial period; förmågan att kvantitativt mäta hormoner och cytokiner före utspädning och enzymatisk hydrolys i blod, och förmågan att samla stora mängder lymf för att isolera intestinala lipoproteiner. Denna teknik är ett kraftfullt verktyg för direkt och kvantitativt mätning av näringsupptag i kosten, tarmlipoproteinsyntes och chylomikronsekretion.

Introduction

Den fysiologiska betydelsen av det mesenteriska lymfsystemet
De mesenteriska lymfatikerna har beskrivits i någon form sedan ~ 300 f.Kr. när Herophilos beskrev leverportalsystemet och alla "absorberande vener i tarmarna"1,2,3,4,5. I mer än 1 700 år efter denna första beskrivning var en definierande egenskap hos tarmlymfatiker närvaron av mjölkaktig vätska i den mesenteriska lymfen strax efter en måltid3. Det är nu känt att mjölkaktig, chylomikroninnehållande lymfa ("chylous" lymfa) inte rinner ut i portvenen och levern utan istället färdas genom cisterna chyli in i bröstkanalen och slutligen förenar blodet vid vänster subklavisk ven6. På grund av detta anatomiska arrangemang färdas chylous lymf först genom hjärtat och lungorna innan den cirkulerar genom resten av kroppen. Detta innebär att hjärtat och lungorna får ett "första pass" vid sekretionerna i mesenteriallymfan7.

En viktig roll för mesenteriska lymfatiker är deras transport av dietlipider från tunntarmen 8,9,10. Anatomiskt, kylomikroner, intestinala immunceller 11,12,13,14, tarmhormoner 15,16,17,18, antigener 19,20,21, icke-chylomikron lipofila föreningar22,23 , och överskott av vätska kommer in i laktealerna som ligger bakom enterocytkällarmembranet och koncentreras sedan genom lymfkapillärerna till de mesenteriska lymfkörtlarna. Det finns sannolikt många okända mesenteriska lymfatiska komponenter, inklusive metaboliter, antigener, miljöföroreningar, näringsämnen och signalmolekyler.

Komponenterna i mesenterisk lymf har inte identifierats systematiskt, till stor del på grund av svårigheten att isolera mesenterisk lymf. Åtkomst till mesenterisk lymf har alltid varit en allvarlig utmaning eftersom lymfkanalerna är färglösa, och förutom efter en fet måltid när de blir chylous och mjölkiga, innehåller mesenteriska lymfatiker färglös lymfvätska 6,8,9,10.

Nuvarande och vanliga metoder för att isolera tarmlymf
Mesenteriallymfan kan inte nås hos människor (utom i sällsynta och extrema fall där allvarligt gastrointestinalt trauma har inträffat)24. In vivo lymfinsamling är kirurgiskt komplex och krävande. Den ursprungliga 2 dagars lymffistelproceduren beskrevs av Bollman et al.25 och har förbättrats och professionaliserats av Patrick Tsos laboratorium under de senaste 45 åren 26,27. Lymffistelproceduren gör det möjligt för utredare att samla flytande lymf från medvetna djur under en 6 h duodenal lipidinfusionsperiod.

Lymffistelmodellen har huvudsakligen använts hos råttor för att mäta lymfflödeshastighet, produktionen av triglycerid och kolesterol (eller andra duodenal-infunderade föreningar), chylomikronsammansättning och tarmhormonkoncentrationer. I mindre utsträckning kan denna teknik också användas på möss, även om kirurgisk överlevnad och lymfvolym lider. På grund av svårigheterna att se mesenteriska lymfkanaler har historiska metoder inkluderat kanylering av mesenterisk lymf hos större djur som minigrisar28, får29, grisar30, hundar31 och råttor17. Att arbeta med dessa större modeller är resurskrävande och tillåter inte studier i knock-in- eller knock-out-modeller.

Alternativa tillvägagångssätt har också använts. Chylomikroner kan isoleras från blod i postprandialt tillstånd (även om dessa delvis hydrolyseras av plasmalipoproteinlipas)32,33,34,35. Bröstkanalen kan också kanyleras, även om lymfan som samlas där innehåller en blandning av mesenterisk lymf och extra-intestinal lymfdränage26,36. In vitro utsöndrar Caco-2-celler en chylomikronliknande partikel som svar på fettsyrabehandling, och dessa celler kan samodlas med relevanta lymfatiska endotel- eller kärlceller37,38. Humana och musintestinala organoidkulturer har visat sig bearbeta apikala lipider och utsöndrar chylomikroner 39,40,41,42. Dessa modeller är mycket fördelaktiga och möjliggör mekanistiska insikter i tunntarmsfysiologi, men de kan inte replikera komplexiteten, fysiokemiska gradienter eller dynamiskt lymfflöde av in situ mesenteriska lymfatiker.

Fördelar med 1-dagars muslymffistelmodellen som presenteras här
Med avseende på dessa andra metoder för att isolera intestinala lipoproteiner har Tso Lab-lymffisteltekniken traditionellt ansetts vara guldstandardtekniken för att mäta absorptionen av kostnäringsämnen i mesenterisk lymfa. Denna in vivo-teknik har fördelen att fånga viktiga fysiologiska aspekter av lipidabsorption i kosten - det dynamiska utseendet av föreningar under absorptionsperioden, vilket kräver upprepad provtagning av flytande mesenterisk lymf hos levande djur med duodenala näringsämnen. Denna kirurgiska teknik mäter också tarmhormoner och cytokiner direkt i deras fysiologiska fack snarare än i blod, där de späds ut och enzymatiskt bryts ned17,43.

Om den experimentella frågan kräver en förståelse för lipidsekretionsdynamik eller den dynamiska absorptionen och metabolismen av någon hydrofob GI-förening eller läkemedel, är denna teknik inte bara lämplig utan är också det enda tillvägagångssättet som interpolerar rörelsen av luminalt innehåll från proximal till distal tarm (mage till kolon) och från apikal till basolateral yta (luminalt innehåll genom enterocyt till lakteals och portalcirkulation). Eftersom denna teknik använder luminal leverans av näringsämnen genom den intraduodenala katetern, och eftersom den flytande mesenteriska lymfen avleds och samlas in, är hela absorptionsapparaten under experimentell kontroll och kan användas för att kvalitativt bedöma små tarmabsorptionsprofiler.

Presenteras visuellt här för första gången är en stor uppdatering av Tso Lab-lymffistelmodellen, som (1) minskar experimenttiden till en 1 dags kirurgisk implantation och experimentell insamlingsperiod; (2) förbättrar musens överlevnad och djurskydd, och (3) ökar reproducerbarheten av tillvägagångssättet hos möss för att utnyttja kraften i musgenetiska modeller. Denna teknik måste betraktas som en guldstandard för alla experimentella frågor om tarmsekret, lipoproteiner eller dietlipidabsorption och är den bästa tekniken för högkvalitativ bestämning av lipidabsorptionskinetik och kylomikroner.

Protocol

Alla kirurgiska ingrepp godkändes av University of Pittsburgh Internal Animal Care and Use Committee [protokoll # 20047008] och överensstämmer med NIH-guiden för vård och användning av laboratoriedjur. C57BL6/J hanmöss, 8-14 veckors ålder, användes för den aktuella studien. Mössen erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning). Alla möss var inrymda på en 12 h ljus / mörk cykel med ad libitum tillgång till standard chow och vatten.

1. Beredning av djur

  1. Beroende på experimentell design, mata mössen eller låt dem fasta.
    OBS: En fasta över natten är onödig om det inte finns oro för skillnader i magtömningshastigheten.
  2. Inducera anestesi med 5% isoflurangas och säkerställ korrekt bedövning med svans och tå nypa. När de är bedövade, håll mössen på ett ordentligt bedövningsplan med 2% -3% isoflurangas och placera dem med tejp på den kirurgiska plattformen.
  3. Håll mössen varma på en uppvärmd kirurgisk plattform som använder cirkulerande varmt vatten (se materialförteckning).

2. Kirurgi och experimentell design

  1. Börja operationen genom att applicera veterinärsalva på ögonen, raka buken och applicera antiseptisk kirurgisk skrubb (se materialförteckning) på operationsområdet. Detta steriliserar snittet och minskar genereringen av luftburen päls under snittet i mittlinjen.
  2. Behåll ett sterilt arbetsområde genom att använda sterila instrument, draperier och annan utrustning och förnödenheter som behövs.
  3. Injicera den första dosen karprofen (se materialtabell) för smärtlindring (i.p.) i en dos på 5 mg/kg.
  4. Ta tag i huden med pincett och gör ett snitt i buken med en liten sax. Skär mot bröstbenet (aldrig ovanför) och skär ner till inguinalfettet. Skär sedan genom muskelskiktet separat med saxen.
    OBS: Sterilisera all utrustning före användning.
  5. Använd upprullningsdonet och flytta peritoneala inälvor ur vägen tills lymfkanalen är synlig.
  6. Använd en saltindränkt Q-tip (se materialtabell), flytta levern mot kroppens övre högra sida och tarmarna och magen till vänster om djuret.
  7. Sträck tolvfingertarmen mot vänster tvärs för att exponera den överlägsna mesenteriska artären och tarmlymfkanalen.
  8. Förbered en 30-40 cm lång kanylslang genom att föra in en trubbig nål i kanylslangen (se materialtabell) och spola en liten mängd heparin (1 000 E/L) genom slangen med en 1 ml spruta.
    OBS: Lymfflödet assisteras av tyngdkraften att strömma ner och in i mikrocentrifuguppsamlingsrören på is. Beroende på var uppsamlingsishinken är placerad intill den kirurgiska installationen kan längden på kanylslangen behöva justeras.
  9. Använd sax för att klippa en fasning vid kanylrörets spets.
  10. Gör ett grunt snitt med irissax (se materialförteckning) i lymfkanalen cirka 5 mm från dess utseende i tunntarmen.
  11. Håll kanylslangen med ett par fina pincett och sätt försiktigt in spetsfasningen i kanalen.
    OBS: Det är viktigt att inte trycka kanylen för långt in i kanalen eftersom det kan förhindra lymfflödet när de indragna organen återgår till sitt ursprungliga läge.
  12. Lymfkanalen är alldeles för ömtålig för de manipulationer som är förknippade med att binda katetern med en sutur. Använd istället en droppe cyanoakrylatlim (se materialförteckning) för att limma lymfkanylen i den mesenteriska lymfkanalen.
  13. Kontrollera om mjölkaktig, vit lymfa (om olivoljesondmatning användes före operationen) eller klar lymfa (om möss har fastat före operationen) som börjar strömma omedelbart genom lymffistelkanylen.
    OBS: Kontrollera att lymfkanylen är framgångsrikt placerad och lymf flyter; Fortsätt med placeringen av intraduodenal kanyl.
  14. Använd en 18 G nål, punktera ett hål genom den pyloriska regionen i magen bakom pylorisk sfinkter.
  15. För in duodenalinfusionsröret (se Materialtabell) genom det hålet i magen till cirka 1-2 mm bortom pylorisk sfinkter i tolvfingertarmen.
  16. Säkra med en handväska-sträng ligatur med silke 5-0 sutur (se materialförteckning) med en nål till magen och försegla med en droppe cyanoakrylatlim för att förhindra läckage.
  17. Starta den intraduodenala infusionen av 5% glukos-0,9% saltlösning vid 0,3 ml / timme.
    OBS: Vid användning av möss med små variationer i kroppsvikt som är ungefär 25 g (~ 8 veckors ålder) är 0,3 ml / h infusion av glukos / saltlösning lämplig. Om mössen är dramatiskt större måste infusionshastigheten justeras uppåt för att ta hänsyn till förändringen i kroppsvikt och blodvolym.
  18. Byt ut organen i kroppshålan och suturen (5-0) muskel- och hudvävnaderna separat.
    OBS: Lymfkanylen och det intraduodenala matningsröret är båda exterioriserade genom samma snitt. Det finns inget företräde för att separera rören med en sutur och ingen preferens för rörens utvändighetsvinkel.
  19. Efter operationen men innan bedövningsmedlet dras ut, placera mössen försiktigt i Snuggle restraints (se Materialtabell) för att begränsa rörligheten.
    OBS: Snuggle restraints hindrar mössen från att ta tag i eller rotera huvudet för att tugga på stygnen och slangarna.
  20. Placera sedan mössen i en genomskinlig plexiglaslåda på en rotator med mild gungning och värm med en temperaturkontrollerad kommersiellt tillgänglig amfibie / reptilvärmedyna fäst vid sidan av inneslutningslådan. Tillhandahåll befuktning även i form av sterila avjoniserade vattenbehållare i hörnen av inneslutningslådan (se Materialförteckning).
  21. 30 minuter innan isofluran sätts ut, administrera mössen sin andra smärtlindringsdos (Buprenex, 0,1 mg/kg, i.p.).
  22. Beroende på experimentet, ge mössen en kontinuerlig intraduodenal infusion av 5% glukos-0,9% saltlösning med en hastighet av 0,3 ml / h i 1 h.
    OBS: 5% glukos-0,9% saltlösning framställs med en steril saltlösningspåse (för humant bruk, pH 7,4) från apoteket och en steril flaska för humant bruk av 50% dextros, enligt strikta riktlinjer för sterilitet. Lösningen måste göras färsk och kasseras om utgångsdatum som anges på saltlösningspåsen eller dextrosflaskan har passerats.
  23. Administrera mössen med en av de lipider som anges i tabell 1 som en experimentell lipid via en intraduodenal kanyl (se materialtabell).
    OBS: För alla data som visas i figur 1 var SMOFlipid (20% lipidinjicerbar emulsion, USP, se materialtabell) intraduodenalt infunderad. Denna infusion, både pre- och post-intraduodenal lipidbolus, ersätter förlorad vätska som dräneras genom lymfkanalen och är ett absolut krav. Mössen är nu redo att infunderas med en experimentell lipiddos.
  24. Utför den klassiska lipidinfusionen av en 0,3 ml lipidemulsionsbolus (SMOFlipid 20% lipidinjicerbar emulsion, USP) via infusionsröret inom duodenal (se Materialtabell).
  25. Efter bolusinfusionen av intraduodenala lipider, byt tillbaka infusionen till 5 % glukos-0,9 % saltlösning vid 0,3 ml/timme kontinuerligt fram till slutet av experimentet.
  26. Samla lymfproverna i förvägda mikrocentrifugrör i 60 minuter och håll lymfan på is. Väg rören en andra gång för att fastställa vikten av lymf som utsöndras varje 60 minuters period.
    OBS: Räkna med att samla in cirka 50-300 μL lymfa per timme, per mus i ~ 6 timmar efter en 0,3 ml lipidbolus.
  27. Lymf kan flöda i upp till 6 timmar efter lipidinfusionen. Vid 6 h tidpunkt, avliva mössen via isofluran och cervikal dislokation.
    OBS: En kirurg och / eller laboratorietekniker bör vara närvarande för att övervaka djuren under hela experimentet. Under observationen, se upp för blodproppar i lymfatiska dränering och förändringar i djurens beteende som indikerar smärta / nöd. Om lymfkanalen är igensatt när som helst under experimentet avslutas experimentet och djuret avlivas. Djuret kan tekniskt hållas vid liv i upp till 24 timmar efter operationen (enligt IACUC:s regler för överlevnadskirurgi). Överlevnadsgraden minskar dock med tiden, och 6 h är en reproducerbar överlevnadsperiod där lipidabsorptionen fortfarande efterliknar in vivo-fysiologin och djuret inte kämpar med överlevnad.
  28. Utför terminal vävnadsinsamling efter eutanasi (steg 3.1).
    OBS: Skillnaden i lipidabsorptionsprofiler i kosten hos möss som hölls i 6-h eller 24-h efter operationen testades nyligen44. Vi fann att 24-timmarsproceduren minskar djurens överlevnad och utflykten av dietlipider i lymfen. Av dessa skäl rekommenderar vi starkt 6-timmarsmetoden. Denna uppdaterade kirurgiska design minskar onödig djurdöd och risken för djurnöd under den postoperativa perioden. Detta stöder ett viktigt mål för American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, som är djur "Replacement, Reduction, Refinement" [ref PMID: 21595115].

3. Insamling av luminalt innehåll och slemhinnevävnad

  1. I slutet av 6 timmars lipidinfusionsperiod, offra mössen via isofluran och cervikal dislokation. Bind båda ändarna av magen, tunntarmen och blindtarmen med 5-0 suturer för att undvika läckage av luminalinnehållet.
  2. Samla mage, blindtarm och tjocktarm och placera var och en i ett 15 ml glasrör. Dela tunntarmen i tre eller fyra segment och samla luminalinnehållet genom att skölja vävnaden i 2-3 ml kall PBS efter skärning i längdriktningen.
  3. Ta bort tarmslemhinnan bestående av epitelceller och tillhörande lamina propria från muskelskiktet genom att skrapa varje sektion i 2-3 ml kall PBS med en krökt pincett.
  4. Placera alla vävnader, luminal- och slemhinneisolat och muskelskiktet i glasrör och tillsätt 8 ml 2: 1 vol / vol CHCl3: MeOH till varje rör.
  5. Bestäm radioaktiviteten och/eller lipidkoncentrationerna genom vätskescintillationsräkning och/eller ett triglyceridanalyskit (se materialtabell) efter extraktion med Folch45.

4. Tunnskiktskromatografi (TLC)

  1. Extrahera de totala lipiderna i luminal- och slemhinneisolaten via en modifierad Folch-extraktion45.
  2. Torka de extraherade lipiderna i lösningsmedlet under en kväveindunstare och suspendera dem sedan igen i 2:1 vol/vol CHCl3:MeOH innan de fylls på en TLC-kiselgelplatta (se Materialtabell).
  3. Separera lipiderna med hjälp av ett lösningsmedelssystem av petroleumeter, etyleter och isättika (25:5:1 vol/vol/vol). Använd jodånga för visualisering av olika lipider, inklusive standarder.
  4. Skrapa fläckarna på TLC-plattan motsvarande monoglycerid/fosfolipid, diglycerider, fettsyror, triglycerider och kolesterolester i enskilda scintillationsflaskor innan 4 ml av scintillationsvätskan tillsätts (se Materialförteckning) för scintillationsräkning.
  5. Uttryck data antingen som en procentandel av den totala boluslipiddosen eller som en bråkdel av den totala lipid som detekterats för varje prov.

5. Chylomicron-isolering och karakterisering

  1. Överför de kombinerade lymfproverna från 6 timmars postlipidbolus (steg 2.29) till ultracentrifugrören, blandade med 0,9 % NaCl (300–500 μl), och överlappa sedan försiktigt med en lämplig volym på 0,87 % NaCl (300–500 μl).
    1. Ultracentrifug (se materialtabell) proverna vid 110 000 x g vid 4 °C i 16 timmar. Samla upp den övre fraktionen som innehåller isolerade chylomikroner och överför dem till ett nytt mikrocentrifugrör.
  2. Bestäm chylomicron triglycerid-, kolesterol- och apoB-koncentrationer enligt stegen nedan.
    1. Bestäm triglycerid- och kolesterolkoncentrationer med hjälp av ett triglycerid- och kolesterolanalyskit (se materialtabell).
    2. Inkubera kortfattat 2 μl av proverna med 200 μl enzymreagens vid 37 °C i 5 minuter i en platta med 96 brunnar. Läs plattan med en plattläsare vid 500 nm för triglycerid och 600 nm för kolesterol.
      Anm.: Standarder och blankämnen har använts för beräkning av koncentrationer. ApoB-koncentrationerna bestämdes med hjälp av ApoB ELISA-kit (se materialtabell).
  3. Bestäm chylomikronpartikelstorleken.
    1. Använd färska chylomikronprover vid triglyceridkoncentrationer på cirka 40 mg / dL för TEM-avbildning. Placera kortfattat 5-10 μL av varje prov på ett TEM-galler och torka.
    2. Undersök gallret med ett transmissionselektronmikroskop och ta bilder. Mät lipoproteinpartikelstorlekarna och analysera dem med hjälp av ImageJ-programvaran (se Materialförteckning).

Representative Results

Figur 2 visar triglyceridsekretionen i mesenterisk lymfa och de genomsnittliga lymfflödeshastigheterna hos de senaste n = 17 vildtypsmössen (WT) som genomgick den endagslymffistelprocedur som beskrivs här. Som visas i figur 2A ökar triglyceridkoncentrationen i lymfan som svar på en intraduodenal bolus på 300 μl SMOFLipid. Maximal triglyceridkoncentration uppnås vid ~2-3 timmar efter bolus och minskar stadigt under 6-timmarstiden (omedelbart före eutanasi). Parallellt med triglyceridsekretionen ökar lymfflödeshastigheten från bolusinfusion i tid 0 till slutet av experimentet (figur 2B).

Dessa resultat visar att kirurgisk implantation av både mesenterisk lymfkanal och intraduodenal kanyl har inträffat och är representativa för en positiv kontroll till vilken annat lymfatiskt innehåll (hormoner, peptider, näringsämnen) kan jämföras. Om det inte sker någon förändring i triglyceridkoncentrationen i lymfan som svar på bolus intraduodenala lipider, signalerar detta att operationen har orsakat betydande skador på tunntarmen så att lipidabsorptionskapaciteten saknas, eller i tidigare ofenotypade genetiska modeller skulle detta tyda på att musen har en defekt i lipidabsorption som är fysiologiskt meningsfull.

Figure 1
Figur 1: Föreslagen tidslinje för lymffistelmusmodellen. T-4, T-3, T-2: Dubbelkanylering tar cirka 2-4 timmar, följt av placering av mössen i återhämtningskammare. T-1: När mössen är i återhämtningsperioden får de en kontinuerlig duodenal infusion av 5% glukos-0,9% saltlösning. T0: den kontinuerliga intraduodenala infusionen byts från 5% glukos-0,9% saltlösning till en infusion av experimentella näringsämnen. T0-T6: Möss får kontinuerlig intraduodenal 5% glukos i saltlösning eller alternativt kontinuerliga näringsämnen. Lymf samlas varje timme under denna period. Slutpunkt: Möss avlivas och vävnader kan samlas in. Figuren skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Triglyceridkoncentration och flödeshastighet för mesenteriallymfa. Vilda möss var utrustade med ett intraduodenalt matningsrör och en mesenterisk lymfkanyl. Möss fick en bolusinfusion av 300 μl lipid. Lymf samlades i 6 timmar i timalikvoter och hölls på is. A) Lymftriglyceridhalten bestämdes genom en kemisk bestämning i varje timliter lymfa. (B) Under 6 timmar efter bolusinfusion plottas lymfflödet som gram lymf som utsöndras per timme. Poäng är medel ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Lipid leveransmetoder Rekommendationer/instruktioner
Blandad lipidemulsionsbolus En 0,3 ml dos av antingen ( A ) Liposyn III 20% lipidinjicerbar eller (B) SMOFlipid 20% lipidinjicerbar emulsion, USP, via intraduodenal infusionsslang kan användas. Dessa emulgerade lipider är användbara eftersom de inte behöver förberedas i förväg, är flytande vid rumstemperatur, är sterila och eftersom de innehåller en "lättsmält" blandning av fria fettsyror, triglycerider, fosfolipider och natriumtaurokolat. Detta är en bra startinfusion för möss som kan ha bukspottskörtel- eller gallinsufficiens.
Triglycerid bolus 0,3 ml försiktigt uppvärmd olivolja (eller renat triolein) som en neutral lipid som återspeglar en kost rik på omättat fett, ister (reflekterande av en diet med högt mättat fettinnehåll) eller kokosnötolja (reflekterande av en diet med högt triglyceridinnehåll med medelkedja) kan alla ges genom intraduodenal infusionsrör eller oral sondmatning. Om den experimentella triglyceriden är mättad måste den värmas för att vara flytande vid rumstemperatur.
Bolus med blandad måltid 0,3 ml Säkerställ med formuleringen innehållande 0,075 g fett (21,6%), 0,5 g kolhydrat (64,0%) och 0,1125 g protein (14,4%) och återspeglar en fettsnål blandad måltid, kan administreras via intraduodenal infusion.
Radiomärkt lipidbolus 5,0 μCi 3 H-märkt glyceroltrioleat och/eller 1,0 μCi 14C-kolesterol i 0,3ml olivolja kan ges via intraduodenal infusion. 14 C-kolesterol: Kolesterol-[4-14C] med specifik aktivitet av 55Ci / mmol och en koncentration av 0,1 mCi / ml. 3 H-TG-triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) med specifik aktivitet på 60Ci/mmol och koncentration på 1 mCi/ml
Kontinuerlig dos Infusion av någon av ovanstående experimentella näringsformuleringar med en hastighet av 0,3 ml/h (snarare än 0,3 ml total bolus) kommer att resultera i en stadig produktion av triglycerid i lymfan. Detta skiljer sig från en bolusinfusion, där triglyceridkoncentrationen i lymfan toppar vid ~ 2-3 timmar och sedan återgår till baslinjekoncentrationer vid ~ 6-8 timmar.

Tabell 1: Tabell över lipidinfusioner.

Discussion

Den ursprungliga 2-dagars lymffistelproceduren beskrevs av Bollman et al.25 och praktiserades av Patrick Tsos laboratorium under de senaste 45 åren 26,27. Protokollet som presenteras här är ett kraftfullt tillägg till denna klassiska, guldstandardmetod för att identifiera, kvantifiera och förstå de unika chylous sekretionerna i tunntarmen, liksom in vivo-dynamiken i kostnäringsabsorption och metabolism, tarmhormoner och tarmimmunitet.

Fördelarna med denna modell inkluderar (1) förmågan att kontinuerligt prova mesenterisk lymfa under hela utfodrings- och postprandialperioden snarare än statisk provtagning vid en tidpunkt under antingen absorption, matsmältning eller utsöndring; 2. mätning av tarmhormoner och cytokiner direkt i deras fysiologiska avdelning snarare än i blod, där de späds ut och enzymatiskt bryts ned17,44; (3) förmågan att isolera, kvantifiera och karakterisera lipoproteinerna som utsöndras av tunntarmen efter intag av en lipidmåltid och frånvaron av endotellipaser i mesenteriallymfan, vilket bevarar chylomikrontriglyceridkoncentrationer och inhemsk chylomikronstruktur46,47; (4) förmågan att direkt mäta lymfflödeshastighet, produktionen av triglycerid och kolesterol (eller andra duodenal-infunderade föreningar), chylomikronsammansättning och tarmhormonkoncentrationer. Slutligen tillåter detta protokoll att samla relativt stora mängder >50 μL lymf varje timme under en 6-timmarsperiod. Eftersom vätskan fylls på med intraduodenal saltlösning och glukosinfusion, förbättras lymffistelmodellen signifikant jämfört med andra lymfprovtagningstekniker och resulterar i flödande snarare än statiska pooler av mesenterisk lymfa. Eftersom volymen är ett stort hinder för lipidomiska, proteomiska och metabolomiska metoder är detta en stor styrka.

1-dagars muslymffistelprotokollet som beskrivs här har flera fördelar jämfört med det ursprungliga lymffistelprotokollet, inklusive en minskning av det totala antalet försöksdjur från tidigare beskrivna 2-dagars lymffistelprotokoll26,27 på grund av en högre överlevnad efter operationen; en minskning av den totala försökstiden från 2 dagar till en enda dag; och slutligen en minskning av återhämtningsperioden för möss från över natten (>18 timmar), där genombrottssmärta eller dåliga postoperativa resultat kan uppstå, till en mer hanterbar ~ 6 h efter operationen.

En funktion i detta 1-dagarsprotokoll är fokus på humana överväganden och slutpunkter. Dessa måste ha högsta prioritet: (1) djur måste få intraduodenala eller intravenösa ersättningsvätskor; (2) De måste hållas varma och så smärtfria som möjligt (med postoperativt Buprenex och/eller karprofen, beroende på försökets utformning och behovet av att undvika antiinflammatoriska effekter). (3) blödning, skakningar, diarré eller tecken på ångest är alla tvingande skäl för en human endpoint. Enligt strikta IACUC-riktlinjer är isofluran följt av cervikal dislokation ett bra effektmått. Kirurgisk överlevnad är ~ 70% för en enda dag (jämfört med ~ 40% för den ursprungliga 2-dagars operationen), men utredare bör inte tveka att avsluta experimentet vid ett tecken på nöd. Detta bör beaktas vid planering av antalet djur.

När det gäller felsökning av denna teknik är framgångsrik placering av lymfkanylen den största flaskhalsen i detta kirurgiska ingrepp. Medan du övar operationen hjälper det att sonda musen med 0,3 ml olivolja cirka 2 timmar före operationen. Detta kommer att orsaka utsöndring av chylomikroner i den mesenteriska lymfkanalen, vilket gör att den verkar "mjölkaktig" och mer synlig. Methylenblått kan också användas men är ofta mindre uppenbart än den mjölkiga lymfkanalen. Om den mesenteriska lymfen efter placeringen av lymfkanylen och dess placering med lim framgångsrikt strömmar genom kanylen in i ett uppsamlingskärl, kan man fortsätta med placeringen av ett duodenalt infusionsrör. Ibland kan lymfan inte flöda kontinuerligt men kan börja flöda igen när djuret placeras på det roterande bordet. Kritiskt, se upp för blodproppar i lymfröret. Dessa bör masseras ut ur rören för att förhindra återflödestryck på lymfkanalen.

Förutom triglyceridsekretion och lymfflödeshastighet kan denna teknik användas för att bestämma följande lipidabsorptionskinetik och chylomikronegenskaper:

Utsöndring av kylomikron45,48,49
Omedelbart efter en måltid som innehåller fett sker en övergående ökning av cirkulerande plasmatriglycerid. Eftersom triglycerider i sig är hydrofoba måste de först emulgeras för att vara lösliga i blod50. Tunntarmsenterocyter utför denna roll och paketerar diettriglycerid i chylomikronemulsionspartiklar51. Chylomikroner innehåller kolesterol och diettriglycerid i sin kärna, omgiven av fosfolipider och apolipoproteiner, inklusive apoB-48, apoA-I, apoA-IV och apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 är det väsentliga strukturella proteinet, och de andra apolipoproteinerna har olika funktioner som krävs för chylomikronmetabolism och clearance från blodet. För att bestämma de viktigaste egenskaperna hos chylomikroner, inklusive deras triglycerid- och apolipoproteininnehåll, bör 1-dagars lymffistelteknik som visas här användas. Chylomikronsekretionshastigheten är procentandelen infunderad 3H-triglycerid som utsöndras i lymfan och mäts genom scintillation genom att räkna lymfprover per timme. Detta kan kombineras med detaljerad chylomikronkarakterisering 48,49,56,57,58. Lymfprover per timme kan kombineras eller förvaras separat. Lymf överförs till ultracentrifugrör, blandas med 0,9% NaCl och överlagras sedan försiktigt med 300-500 μL 0,87% NaCl. Proverna ultracentrifugeras sedan vid 110 000 x g vid 4 °C i 16 timmar. De översta fraktionerna som innehåller isolerade chylomikroner samlas in och testas för triglyceridkoncentrationer med hjälp av triglyceridanalyssatsen. Kortfattat inkuberas 2 μL av chylomikron (1:10 spädning) med 200 μL enzymreagens vid rumstemperatur i 10 minuter i en 96-brunnsplatta. Plattan läses av en plattläsare vid 500 nm, och standarderna och ämnena används för beräkning av triglyceridkoncentrationer. Chylomikronstorleken kan sedan bestämmas genom negativ färgning och transmissionselektronmikroskopi (TEM)14,29. Triglycerid och kolesterol kan kvantifieras genom kemisk analys och apolipoproteininnehåll (apoB-48, A-I, C-II, C-III) med ELISA-kit eller Western blot.

Bestämning av den primära platsen för lipidabsorption 48,59
Genom att isolera de luminala och epiteliala cellfacken i tolvfingertarmen, jejunum och ileum vid 6 timmar efter infusionen av 3H-triglycerid eller en radioaktivt märkt blandad måltid extraheras innehållet Folch för att bestämma hur mycket av 3H-triglyceriden som absorberas över epitelcellmembranet (normalt) eller behålls i lumen (onormalt) längs tunntarmen48 . Dessa studier är särskilt effektiva om det finns potentiella skillnader i GI-motilitet 60,61,62, om det finns en hypotes om gallsyror (mycket aktiva under lipidabsorption och själva reabsorberas i ileum)63,64,65,66, eller om det finns en oro för att näringsämnen absorberas på fel anatomisk plats (ileum eller till och med kolon)67 ,68,69,70.

Identifiera mekanismer för 3H-triglyceridhandel i absorberande epitelceller48
Detta utförs genom att beräkna procentandelen av3 H-triglycerid hydrolyserad till 3 H-fri fettsyra i tarmlumen, absorberad i slemhinnan och omförestrad till intracellulär 3H-triglycerid före utsöndring som chylomikroner. Detta är en kraftfull markör för absorptions- / utsöndringsdefekter eftersom det kan spåras för att visa rörelsen av diettriglycerid i dess nedbrytningsprodukter och efterföljande förpackning i chylomikroner. mRNA-uttryck av fettsyraabsorptionsmaskineriet (CD36, FAFP, ACSL), reförestringsväg (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) och apolipoproteiner (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) kan kvantifieras ytterligare med RT-PCR.

Framtida tillämpningar av denna teknik begränsas endast av intresse för överhörning mellan tarmorgan, metabolism, immunitet, näringsabsorption, miljöföroreningar eller någon annan sjukdom med en roll i GI-systemet. Det är troligt att många övertygande experiment och hypoteser har stoppats på grund av svårigheten att komma åt det kritiska mesenteriska lymfsystemet, och målet med detta visualiserade protokoll är att göra denna teknik mer lättillgänglig. Att isolera chylomikroner och den mesenteriska lymfan där de ursprungligen bor är en kritisk del av förståelsen av hela kroppens metabolism; 1 Day Mouse Lymph Fistel-modellen är en kraftfull fysiologisk modell för att studera dessa händelser.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi är oerhört tacksamma till Cystic Fibrosis Foundation (Pilot and Feasibility Award 1810, till ABK), Rainin Foundation (Synergy Award, till PI GJ Randolph och Co-I ABK) och National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 till ABK) för deras stöd till dessa studier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC 0409-4888-06
1.7 mL Eppendorf tubes Fisher Scientific, Waltham, MA, US 7200184
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ARC 0857
18 G needle Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 305199
2 Dumont micro-dissecting forceps Fine Science Tools, Foster City, CA, US 11251-35
2 Forceps ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5130
3H-TAG:  Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ART0199
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC-0409-6648-16
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK Fisher Scientific, Waltham, MA, US 11-101-0007
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick Fisher Scientific, Waltham, MA, US 14-910-501
Betadine surgical scrub Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US 1201
Bevel-cut cannula Braintree Scientific.,  Braintree , MA, US MRE025
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) HenrySchein, Warrendale, PA, US 1278184
C57BL6/J male mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine
ChloraPrep Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 260100
Cholesterol Assay Kit FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US 99902601
Cholesterol-[4-14C] American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification our own design and modifications
commercially available  amphibian/reptile heating pad ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China XHC-F035D
Cotton tip applicators Fisher Scientific, Waltham, MA, US 22363156
Duodenal infusion tube - canuala Braintree Scientific, Braintree , MA, US MRE037
Ensure Abbott Nutrition, Columbus, OH
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination Patterson Scientific, Waukesha, WI, US Gaymar T/Pump Classic
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile Mylan, Morgantown, WV, US NDC-67457-384-31
Image J Software National Institute of Health, Bethesda, Maryland,
Iris scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Isoflurane Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US NDC 66794-017-25
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus Patterson Scientific, Waukesha, WI, US mouse induction chamber
Krazy glue Elmer's products Inc., Columbus, OH, US KG484
Liposyn III 20% lipid injectable Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter Beckman Coulter, Brea, CA
Micro-dissecting Spring Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Mouse apoB ELISA Kit ABCAM Inc., Waltham, MA, US ab230932-1
Needle Holder Fine Science Tools, Foster City, CA, US 12002-12
Retractors Kent Scientific Co., Torrington, CT, US SURGI-5001
Rimadyl (Carprofen) Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US 4019449
Rotating table Barnstead Thermolyne Labquake, Zürich, Switzerland Barnstead Thermolyne
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US NDC-63323-820-01
Snuggle Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada MS 02.5PM
Surgical Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5912SC
Suture (5-0 silk with needle) DemeTECH, Miami Lakes, FL, US DT-719
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) JEOL, Peabody, MA
Triglyceride Assay Kit Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom TR210
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid Perkin Elmer, Hebron, KY, US 6013119
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 SORVALL RC M120 GX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natale, G., Bocci, G., Ribatti, D. Scholars and Scientists in the History of the Lymphatic System. Journal of Anatomy. 231 (3), 417-429 (2017).
  2. Loukas, M., et al. The lymphatic system: A historical perspective. Clinical Anatomy. 24 (7), 807-816 (2011).
  3. Suy, R., Thomis, S., Fourneau, I. The discovery of the lymphatic system in the seventeenth century. Part II: The discovery of Chyle vessels. Acta Chirurgica Belgica. 116 (5), 325-331 (2016).
  4. Azzali, G. Historical notes on the lymphatic vascular system. Acta Bio-medica de L'Ateneo Parmense. 61 (3-4), 113-125 (1990).
  5. Irschick, R., Siemon, C., Brenner, E. The history of anatomical research of lymphatics - From the ancient times to the end of the European Renaissance. Annals of Anatomy. 223, 49-69 (2019).
  6. Swartz, M. A. The physiology of the lymphatic system. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 3-20 (2001).
  7. Deitch, E. A. Gut lymph and lymphatics: A source of factors leading to organ injury and dysfunction. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 103-111 (2010).
  8. Tso, P., Gollamudi, S. R. Pluronic L-81: A potent inhibitor of the transport of intestinal chylomicrons. American Journal of Physiology. 247, 32-36 (1984).
  9. Tso, P., Karlstad, M. D., Bistrian, B. R., DeMichele, S. J. Intestinal digestion, absorption, and transport of structured triglycerides and cholesterol in rats. American Journal of Physiology. 268, 568-577 (1995).
  10. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. American Journal of Physiology. 261, 530-538 (1991).
  11. Bogunovic, M., et al. Origin of the lamina propria dendritic cell network. Immunity. 31 (3), 513-525 (2009).
  12. Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Science Translational Medicine. 6 (237), (2014).
  13. Ji, Y., Sakata, Y., Tso, P. Nutrient-induced inflammation in the intestine. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (4), 315-321 (2011).
  14. Ji, Y., Sakata, Y., Yang, Q., Tso, P. Intestinal mucosal mast cells is activated by fat absorption. Gastroenterology. 140 (5), (2011).
  15. Wang, F., et al. Chronic high-fat feeding increases mixed meal-induced incretin secretion in Sprague-Dawley rats. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (10), 807-815 (2015).
  16. Kindel, T. L., Yoder, S. M., D'Alessio, D. A., Tso, P. The effect of duodenal-jejunal bypass on glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in Wistar rats. Obesity Surgery. 20 (6), 768-775 (2010).
  17. Kohan, A. B., Yoder, S. M., Tso, P. Using the lymphatics to study nutrient absorption and the secretion of gastrointestinal hormones. Physiology & Behavior. 105 (1), 82-88 (2011).
  18. Yoder, S. M., Yang, Q., Kindel, T. L., Tso, P. Stimulation of incretin secretion by dietary lipid: Is it dose dependent. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (2), 299-305 (2009).
  19. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PLoS One. 4 (12), 8442 (2009).
  20. Vors, C., et al. Postprandial endotoxemia linked with chylomicrons and lipopolysaccharides handling in obese versus lean men: A lipid dose-effect trial. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (9), 3427-3435 (2015).
  21. Ghoshal, S., Witta, J., Zhong, J., de Villiers, W., Eckhardt, E. Chylomicrons promote intestinal absorption of lipopolysaccharides. Journal of Lipid Research. 50 (1), 90-97 (2009).
  22. Jandacek, R. J., Rider, T., Keller, E. R., Tso, P. The effect of olestra on the absorption, excretion and storage of 2,2',5,5' tetrachlorobiphenyl; 3,3',4,4' tetrachlorobiphenyl; and perfluorooctanoic acid. Environment International. 36 (8), 880-883 (2010).
  23. Jandacek, R. J., Tso, P. Organochlorine compounds are absorbed via lymph and portal circulation. The FASEB Journal. 22, (2008).
  24. Utermann, G., Beisiegel, U. Apolipoprotein A-IV: A protein occurring in human mesenteric lymph chylomicrons and free in plasma. Isolation and quantification. European Journal of Biochemistry. 99 (2), 333-344 (1979).
  25. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 33 (10), 1349-1352 (1948).
  26. Tso, P., Balint, J. A., Rodgers, J. B. Effect of hydrophobic surfactant (pluronic L-81) on lymphatic lipid transport in the rat. American Journal of Physiology. 239 (5), 348-353 (1980).
  27. Liu, M., et al. Sexual dimorphism in intestinal absorption and lymphatic transport of dietary lipids. Journal of Physiology. 599 (22), 5015-5030 (2021).
  28. Manolas, K. J., et al. Lymph, pancreatic and gastrointestinal hormones in response to feeding in the conscious pig. European Surgical Research. 17 (5), 324-332 (1985).
  29. Lascelles, A. K., Morris, B. Surgical techniques for the collection of lymph from unanaesthetized sheep. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 46, 199-205 (1961).
  30. Jensen, L. T., Olesen, H. P., Risteli, J., Lorenzen, I. External thoracic duct-venous shunt in conscious pigs for long term studies of connective tissue metabolites in lymph. Laboratory Animal Science. 40 (6), 620-624 (1990).
  31. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 45-60 (2001).
  32. Yasunaga, K., Saito, S., Zhang, Y. -L., Hernandez-Ono, A., Ginsberg, H. N. Effects of triacylglycerol and diacylglycerol oils on blood clearance, tissue uptake, and hepatic apolipoprotein B secretion in mice. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1108-1121 (2007).
  33. Curtin, A., et al. Elevated triglyceride-rich lipoproteins in diabetes. A study of apolipoprotein B-48. Acta Diabetologica. 33 (3), 205-210 (1996).
  34. Gordts, P. L. S. M., et al. ApoC-III inhibits clearance of triglyceride-rich lipoproteins through LDL family receptors. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2855-2866 (2016).
  35. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78 (5), 1287-1295 (1986).
  36. Ormai, S., Palkovits, M. Size distribution of lymphocytes in the thoracic duct lymph in rat after lymphocyte mobilization induced by polymethacrylic acid. Blut Zeitschrift für die Gesamte Blutforschung. 24 (3), 161-165 (1972).
  37. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19565-19572 (1999).
  38. Nollevaux, G., et al. Development of a serum-free co-culture of human intestinal epithelium cell-lines (Caco-2/HT29-5M21). BMC Cell Biology. 7 (1), 20 (2006).
  39. Li, D., Dong, H., Kohan, A. B. The Isolation, Culture, and Propagation of Murine Intestinal Enteroids for the Study of Dietary Lipid Metabolism. Organoids. Methods in Molecular Biology. 1576, Humana. New York, NY. 195-204 (2019).
  40. Jattan, J. J., et al. Using murine-derived primary intestinal enteroids for studies of dietary triglyceride absorption and lipoprotein synthesis, and to determine the role of intestine-specific ApoC-III in the intestine. Journal of Lipid Research. 58 (5), 853-865 (2017).
  41. Haring, E., et al. Bile acids regulate intestinal antigen presentation and reduce graft-versus-host disease without impairing the graft-versus-leukemia effect. Haematologica. 106 (8), 2131-2146 (2021).
  42. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: Reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 269-289 (2015).
  43. Deacon, C. F. Circulation and degradation of GIP and GLP-1. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 761-765 (2004).
  44. Dedousis, N., Teng, L., Kanshana, J. S., Kohan, A. B. A single-day mouse mesenteric lymph surgery in mice: an updated approach to study dietary lipid absorption, chylomicron secretion, and lymphocyte dynamics. J Lipid Res. 63 (11), 100284 (2022).
  45. Li, D., et al. Intestinal basolateral lipid substrate transport is linked to chylomicron secretion and is regulated by ApoC-III. Journal of Lipid Research. 60 (9), 1503-1515 (2019).
  46. Glatzle, J., et al. Chylomicron components mediate intestinal lipid-induced inhibition of gastric motor function. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 282 (1), 86-91 (2002).
  47. Huang, J., Sloop, C. H., Roheim, P. S., Wong, L. Lipoprotein lipase and hepatic triacylglycerol lipase activities in peripheral and skeletal muscle lymph. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 10 (5), 720-726 (1990).
  48. Wang, F., et al. Overexpression of apolipoprotein C-III decreases secretion of dietary triglyceride into lymph. Physiological Reports. 2 (3), 00247 (2014).
  49. Kohan, A. B., et al. Apolipoprotein A-IV regulates chylomicron metabolism-Mechanism and function. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (6), 628-636 (2012).
  50. Hayashi, H., et al. Fat feeding increases size, but not number, of chylomicrons produced by small intestine. American Journal of Physiology. 259 (5), 709-719 (1990).
  51. Tso, P., Balint, J. A. Formation and transport of chylomicrons by enterocytes to the lymphatics. American Journal of Physiology. 250 (6), 715-726 (1986).
  52. Bhattacharya, S., Redgrave, T. G. The content of apolipoprotein B in chylomicron particles. Journal of Lipid Research. 22 (5), 820-828 (1981).
  53. Björkegren, J., Karpe, F., Milne, R. W., Hamsten, A. Differences in apolipoprotein and lipid composition between human chylomicron remnants and very low density lipoproteins isolated from fasting and postprandial plasma. Journal of Lipid Research. 39 (7), 1412-1420 (1998).
  54. Martins, I. J., Sainsbury, A. J., Mamo, J. C., Redgrave, T. G. Lipid and apolipoprotein B48 transport in mesenteric lymph and the effect of hyperphagia on the clearance of chylomicron-like emulsions in insulin-deficient rats. Diabetologia. 37 (3), 238-246 (1994).
  55. Mar, R., et al. Association of the APOLIPOPROTEIN A1/C3/A4/A5 gene cluster with triglyceride levels and LDL particle size in familial combined hyperlipidemia. Circulation Research. 94 (7), 993-999 (2004).
  56. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 086005 (2012).
  57. Nauli, A. M., et al. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiological Reports. 2 (6), 192-196 (2014).
  58. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1290-1297 (2005).
  59. Kohan, A. B., et al. Is apolipoprotein A-IV rate limiting in the intestinal transport and absorption of triglyceride. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (12), 1128-1135 (2013).
  60. De Lisle, R. C. Altered transit and bacterial overgrowth in the cystic fibrosis mouse small intestine. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (1), 104-111 (2007).
  61. Debas, H. T., Farooq, O., Grossman, M. I. Inhibition of gastric emptying is a physiological action of cholecystokinin. Gastroenterology. 68 (5), 1211-1217 (1975).
  62. Spiller, R. C., et al. Further characterisation of the 'ileal brake' reflex in man--Effect of ileal infusion of partial digests of fat, protein, and starch on jejunal motility and release of neurotensin, enteroglucagon, and peptide YY. Gut. 29 (8), 1042-1051 (1988).
  63. Battle, M. A., et al. GATA4 is essential for jejunal function in mice. Gastroenterology. 135 (5), 1676-1686 (2008).
  64. Morgan, R. G., Borgström, B. The mechanism of fat absorption in the bile fistula rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 228-243 (1969).
  65. Davidson, N. O., Kollmer, M. E., Glickman, R. M. Apolipoprotein B synthesis in rat small intestine: Regulation by dietary triglyceride and biliary lipid. Journal of Lipid Research. 27 (1), 30-39 (1986).
  66. Bouchi, R., et al. FOXO1 inhibition yields functional insulin-producing cells in human gut organoid cultures. Nature Communications. 5, 4242 (2014).
  67. Bijvelds, M. J. C., et al. Fat absorption in cystic fibrosis mice is impeded by defective lipolysis and post-lipolytic events. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 288 (4), 646-653 (2005).
  68. Struyvenberg, M. R., Martin, C. R., Freedman, S. D. Practical guide to exocrine pancreatic insufficiency - Breaking the myths. BMC Medicine. 15 (1), 29 (2017).
  69. Tickell, K. D., Atlas, H. E., Walson, J. L. Environmental enteric dysfunction: A review of potential mechanisms, consequences and management strategies. BMC Medicine. 17 (1), 181 (2019).
  70. Lo, C. M., et al. Cholecystokinin knockout mice are resistant to high-fat diet-induced obesity. Gastroenterology. 138 (5), 1997-2005 (2010).

Tags

Biologi nummer 189
Isoleringen av flytande mesenterisk lymf hos möss för att kvantifiera <em>in vivo-kinetik</em> för lipidabsorption i kosten och chylomikronsekretion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. … More

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. B. The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion. J. Vis. Exp. (189), e64338, doi:10.3791/64338 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter