Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Et nanobar-understøttet lipiddobbeltlagssystem til undersøgelse af membrankrumningsfølende proteiner in vitro

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64340
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology, Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

Her er et nanobar-understøttet lipid dobbeltlagssystem udviklet til at give en syntetisk membran med en defineret krumning, der muliggør karakterisering af proteiner med krumningssensorevne in vitro.

Abstract

Membrankrumning spiller vigtige roller i forskellige vigtige processer af celler, såsom cellemigration, celledeling og vesikelhandel. Det genereres ikke kun passivt af cellulære aktiviteter, men regulerer også aktivt proteininteraktioner og er involveret i mange intracellulære signalering. Det er således af stor værdi at undersøge membrankrumningens rolle i reguleringen af fordelingen og dynamikken af proteiner og lipider. For nylig er der udviklet mange teknikker til at studere forholdet mellem den buede membran og protein in vitro. Sammenlignet med traditionelle teknikker tilbyder det nyudviklede nanobar-understøttede lipiddobbeltlag (SLB) både høj kapacitet og bedre nøjagtighed i membrankrumningsgenerering ved at danne et kontinuerligt lipiddobbeltlag på mønstrede arrays af nanobarer med en foruddefineret membrankrumning og lokal flad kontrol. Både lipidfluiditeten og proteinfølsomheden over for buede membraner kan kvantitativt karakteriseres ved hjælp af fluorescensmikroskopibilleddannelse. Her introduceres en detaljeret procedure for, hvordan man danner en SLB på fabrikerede glasoverflader indeholdende nanobararrays og karakterisering af krumningsfølsomme proteiner på sådanne SLB. Derudover er protokoller til genbrug af nanochip og billedbehandling dækket. Ud over nanobar-SLB er denne protokol let anvendelig på alle typer nanostrukturerede glaschips til krumningssensorundersøgelser.

Introduction

Membrankrumning er en kritisk fysisk parameter for en celle, der forekommer i en række cellulære processer såsom morfogenese, celledeling og cellemigration1. Det er almindeligt anerkendt nu, at membrankrumning er ud over et simpelt resultat af cellulære begivenheder; i stedet er det opstået som en effektiv regulator af proteininteraktioner og intracellulær signalering. For eksempel viste det sig, at flere proteiner involveret i clathrinmedieret endocytose fortrinsvis binder til den buede membran, hvilket resulterer i dannelsen af et hotspot for endocytose2. Der er mange forskellige årsager til membrandeformation, såsom membrantrækning af cytoskeletale kræfter, tilstedeværelsen af lipidasymmetri med hovedgrupper af forskellig størrelse, eksistensen af transmembranproteiner med konisk form, akkumulering af membranformende proteiner som BAR-domæneproteiner (opkaldt efter Bin-, amphiphysin- og Rvs-proteiner) og indsættelse af amfipatiske helices-domæne i membranen1 . Interessant nok deformerer disse proteiner og lipider ikke kun membranen, men kan også mærke membrankrumningen og udvise præferenceakkumulering1. Derfor er det afgørende at undersøge, om og hvordan membraner med forskellige krumninger ændrer fordelingen og dynamikken af proteiner og lipider, der er knyttet til dem, og de potentielle virkninger på de relaterede intracellulære processer.

Mange teknikker er udviklet til at analysere interaktionen mellem buet membran og proteiner i både levende celle- og in vitro-systemer. Det levende cellesystem giver et ægte cellemiljø med rig lipiddiversitet og dynamisk proteinsignalregulering 2,3,4,5,6,7. Et sådant sofistikeret system er imidlertid vanskeligt at studere på grund af usikkerheder og udsving i det intracellulære miljø. Derfor er in vitro-assays ved hjælp af en kunstig membran sammensat af kendte lipidarter og oprensede proteiner blevet kraftfulde rekonstitutionssystemer til at karakterisere forholdet mellem proteiner og buede membraner. Traditionelt genereres liposomer med forskellige diametre ved ekstrudering for at detektere krumningsfølsomme proteiner via enten et co-sedimentationsassay ved hjælp af centrifugalkraft eller et co-flotationsassay med en densitetsgradient for at undgå proteinaggregering 8,9. Krumningen af de ekstruderede liposomer er imidlertid begrænset af den tilgængelige porestørrelse på membranfilteret, der anvendes i ekstruderen10. Single liposome curvature (SLiC) assay har vist sig at overvinde denne begrænsning, hvor liposomer med forskellige diametre fluorescensmærkes og immobiliseres på overfladen, så krumningen kan markeres af fluorescerende intensitet11. Imidlertid er der observeret stærk variation i lipidsammensætning i små vesikler, hvilket påvirker nøjagtigheden af krumningsmålingen12. Tether-pulling eksperimenter giver en mere præcis måling af krumningen på den forbigående tether, der trækkes fra gigantiske unilamellar vesikler (GUV'er) ved hjælp af en optisk pincet, hvor krumningen godt kan styres af membranspændingen genereret13,14. Denne metode er egnet til at studere enten positive eller negative krumningsfølende proteiner, men er begrænset af gennemstrømningen af rørgenerering10. Understøttede membranrør (SMrT) assay giver samtidig generering af flere membranrør, der ekstruderes fra det samme lipidreservoir ved mikrofluidiske strømme. Ikke desto mindre varierer membrankrumningen iboende langs nanorøret, hvilket kompromitterer nøjagtigheden af fluorescensintensitetsbaseret krumningsmåling15,16. Til sammenligning genererede brug af små unilamellar vesikler (SUV'er, diameter <100 nm17) til dannelse af et understøttet lipiddobbeltlag (SLB) på overflader indeholdende designede topografier en enkelt dobbeltlagsmembran med krumninger forudbestemt af nanofabrikation eller nanomaterialer med høj nøjagtighed18,19,20.

Her præsenterer vi en protokol for dannelsen af SLB på fabrikerede nanochipoverflader med nanobar-arrays, og hvordan den kan bruges til at undersøge krumningsfølsomheden af proteiner in vitro. Som vist i figur 1 er der seks væsentlige komponenter i analysen: A) Rengøring og samling af chippen med et mikrofluidisk kammer; B) Fremstilling af SUV'er med defineret lipidsammensætning; C) Dannelse af SLB på en nanochip og binding med krumningsfølsomme proteiner; D) Billeddannelse og karakterisering af SLB og krumningsfølsomme proteiner under fluorescensmikroskopi; E) Rengøring af chippen til genbrug; F) Billedbehandling til kvantitativ analyse af proteinkrumningssensorevne. Den detaljerede protokol er beskrevet trin for trin nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rengøring af nanochip

  1. Nanochippen anbringes i et 10 ml bægerglas med den mønstrede side opad.
    BEMÆRK: Denne kvarts nanochip er fremstillet via elektronstrålelitografi som beskrevet før21. Geometrien og arrangementet af nanostrukturen på chippen kan specialdesignes. Størrelserne på de gradient nanobarer, der anvendes her, er 2000 nm i længden, 600 nm i højden og 100 til 1000 nm i bredden (100 nm trinsæt).
  2. Tilsæt forsigtigt 1 ml 98% svovlsyre til bægerglasset, og sørg for, at syren dækker spånens for- og bagside fuldt ud.
    BEMÆRK: 98% svovlsyre er ekstremt ætsende og kan forårsage hurtig vævsdestruktion og alvorlige kemiske forbrændinger ved kontakt med hud eller øjne. Brug den i røghætten med korrekt beskyttelse.
  3. Bægerglasset drejes langsomt, og der tilsættes 200 μL 30 % hydrogenperoxid dråbe for dråbe, indtil hele bægerglasset bliver varmt. Sørg for, at svovlsyre og hydrogenperoxid blandes godt for at danne piranhaopløsning til fjernelse af organiske molekyler fra nanochip17. Der findes alternative teknikker til generering af SLB på rene hydrofile overflader, såsom UV-lys og ozoneksponering som beskrevet tidligere23.
    BEMÆRK: Reaktionen er ekstremt eksoterm og kan få opløsningen til at koge, så tilsæt hydrogenperoxid til svovlsyre dråbe for dråbe og fortsæt med at rotere.
  4. Læg bægerglasset i en sekundær glasbeholder, og hold nanochippen nedsænket i piranha-opløsningen natten over for at rense urenhederne grundigt.
    BEMÆRK: Anbring bægerglasset i stinkskabet uden dæksel, hvis reaktionen kan generere gas.
  5. Tag bægerglasset ud og pipetter forsigtigt piranha-opløsningen i en sur affaldsbeholder.
  6. Der hældes 5 ml deioniseret vand i bægerglasset for at fortynde restsyren, og det kasseres i syreaffaldet. Gentag dette trin fem gange, og brug 5 M NaOH til at neutralisere syreaffaldet.
  7. Grib chippen med pincet og vask med en kontinuerlig strøm af deioniseret vand for at fjerne resterende syre grundigt. Føntør chippen med 99,9% nitrogengas til SLB-dannelse22.

2. Generation af små unilamellar vesikler (SUV'er)

  1. Tilsæt 100 μL chloroform i et ravfarvet hætteglas.
    BEMÆRK: Chloroform er en meget flygtig, farveløs væske, og den kan være giftig, hvis den indåndes eller sluges. Brug den i røghætten med masken og handskerne på.
  2. 500 μg af lipidblandingen opløses i chloroform. Sammensætningen af lipidblandingen, der anvendes her, er 89,5 mol% ægphosphatidylcholiner (PC), 10 mol% hjernephosphatidylserin (PS) og 0,5 mol% Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, triethylammoniumsalt (Texas Red DHPE).
  3. Lipidblandingen i hætteglasset føntørres med 99,9% nitrogengas, indtil chloroformen er fordampet, og lipidblandingen er tør.
    BEMÆRK: Dette trin skal udføres i røghætten. Undgå væskesprøjt ved føntørring.
  4. Anbring lipidblandingen i det gule hætteglas uden låg i den aluminiumsfoliedækkede vakuumtørrer. Støvsug derefter prøven med en pumpe i 3 timer for fuldstændigt at fordampe chloroformen.
  5. Der tilsættes 250 μL phosphatbufferet saltvand (PBS) til hætteglasset. Vortex opløsningen, indtil den er homogen.
    BEMÆRK: PBS-buffer består af 150 mM NaCl uden calcium, magnesium og phenolrød; pH justeres til 7,2 for at gøre pc'en og PS lipid dobbeltlag.
  6. Soniker lipidblandingen i 30 minutter med en frekvens på 50 kHz i en badesonikator. Overfør derefter lipidblandingen til et 1,5 ml centrifugerør og forsegl med parafilm.
  7. Frys lipidblandingen i flydende nitrogen i 20 s og tø derefter op ved 42 ° C i 2 minutter i et vandbad. Gentag fryse-optøningscyklusserne 30 gange. Derefter ser lipidblandingen ud som en klar væske.
    FORSIGTIG: Flydende nitrogen har et kogepunkt på ca. -195,8 °C. Det kan forårsage frostskader eller kryogene forbrændinger. Brug den i det ubegrænsede rum med varmeisoleringshandsker på.
  8. Skyl to gastætte glassprøjter og stikket på miniekstruderen med henholdsvis ethanol, chloroform og methanol. Gentag skyllesekvensen fem gange for at forrense apparatet. Lad dem stå i røghætten, indtil det organiske opløsningsmiddel er helt fordampet.
  9. Saml miniekstruderapparatet, og før 500 μL PBS-buffer gennem stikket for at forvæde apparatet, og kassér derefter bufferen fra en anden sprøjte. Dette trin fjerner urenheder og letter ekstrudering.
  10. Saml mini-ekstruderapparatet med en 100 nm pore-størrelse polycarbonatfiltermembran.
    BEMÆRK: Filtermembranens porestørrelse bestemmer diameteren af liposomer.
  11. Tag 500 μL PBS-buffer med en af sprøjterne, og skub den forsigtigt gennem filteret for at fylde den anden tomme sprøjte i den anden ende. Gentag ekstruderingen frem og tilbage tre gange for at kontrollere apparatets lækage, og kassér bufferen fra den anden sprøjte.
  12. Før lipidblandingen gennem miniekstruderen for at erstatte PBS-bufferen. Ekstruder derefter frem og tilbage 20 gange for at danne SUV'er. Vesiklernes multilamellære karakter kan bevares med utilstrækkeligt antal ekstruderingstider, hvilket vil påvirke SLB-dannelse23.
  13. Saml SUV'erne fra den anden sprøjte for at reducere forureningen med større partikler og overfør den til et 1,5 ml centrifugerør.
    BEMÆRK: Fjern sprøjten lige ud af stikket, hvis sprøjten går i stykker.
  14. Pak røret ind med aluminiumsfolie for at forhindre blegning af fluorescerende mærkede lipider, og opbevar dem ved 4 °C. Normalt kan SUV'erne opbevares i op til 7 dage.

3. Dannelse af SLB på en nanochip

  1. Tag den rensede nanochip ud af deioniseret vand forsigtigt med en pincet og føntør med 99,9% nitrogengas.
  2. Udfør overfladerensning af nanochippen med luftplasmabehandling i 1 time.
  3. Saml nanochippen i et polydimethylsiloxan (PDMS) kammer, som består af to stykker PDMS - en midterste PDMS og en top PDMS (figur 1A). Den midterste PDMS er tynd (~ 0,5 mm) med en stor ovalformet åbning i midten for at sikre tilstrækkelig eksponering for nanobarmønsteret. Den øverste PDMS er tyk (~4,0 mm) med to små huller i den store ovale åbning som indløb og udløb til væskehåndtering.
    1. Placer chippen på en ren overflade med mønsteret opad.
    2. Dæk forsigtigt det midterste PDMS med chippen, og sørg for, at hele mønsteret udsættes for det centrale område af den store ovale åbning i det midterste PDMS.
    3. Dæk det øverste PDMS med det midterste PDMS, og hold dets to små huller inden for området for det store ovale hul i det midterste PDMS. Derefter samles PDMS-kammeret.
      BEMÆRK: PDMS er den mest anvendte siliciumbaserede organiske polymer. Det er biokompatibelt, gennemsigtigt såvel som deformerbart til at blive designet som en tilpasset form til chipsamling og billeddannelse under mikroskopet. Endnu vigtigere kan det kovalent klæbes til et andet PDMS-lag eller glas tæt efter plasmabehandling, hvilket gør det velegnet som kammeret til at forberede SLB. Dette trin sikrer, at hvert lag af PDMS er tæt monteret for at undgå huller og lækage.
  4. Læg SUV'erne i PDMS-kammeret fra et af de to små huller i det øverste PDMS med en pipette, og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur for at danne SLB.
  5. Pipetter forsigtigt PBS-bufferen ind i PDMS-kammeret fra den ene side af det lille hul, og fjern affaldet med en vatpind fra det andet hul for at vaske de ubundne SUV'er væk. Derefter erhverves SLB dannet på nanochip (kvaliteten af SLB testes ved fluorescensgendannelse efter fotoblegning (FRAP) som vist i trin 4.4 og diskuteret i afsnittet om repræsentative resultater).
    BEMÆRK: Når PBS-bufferen pipetteres ind i kammeret, skal pipettespidsen være fuld af bufferen og i kontakt med væskeoverfladen for at undgå at injicere bobler.

4. Billeddannelse af SLB og krumningsfølende proteinbinding på nanochippen

BEMÆRK: Dette afsnit afhænger af det mikroskopsystem, der er tilgængeligt for eksperimentet. Her vil der blive beskrevet en overordnet retningslinje for, hvordan billeddannelsen skal udføres. De detaljerede indstillinger kan ændres mellem de forskellige mikroskopopsætninger.

  1. Konfokalmikroskopi til laserscanning opsættes ved hjælp af et 100x (N.A.1.4) oliemål. Åbn ZEN-softwaren for at vælge excitationslaserkraften, der kan ophidse fluorescensen af lipidet og proteinet. Vælg Anskaffelsestilstand > Smart opsætning > Texas Red DHPE / EGFP.
  2. Juster fokus med fokusknappen for at lokalisere nanobarerne på chippen, indtil nanobarkanterne er skarpe under lipidkanalen.
  3. Indstil scanningsparametrene som nedenfor for at få et kontrolbillede af lipidkanalen, før du tilføjer protein: Rammestørrelse = 512 px x 512 px (512 pixels x 512 pixels, en pixelstørrelse på 124 nm), Bits pr. pixel = 16 (16-bit dybde), scanningshastighed = 5 og gennemsnit = 4 (gennemsnitstilstand på fire gange / linje).
  4. Udfør FRAP-analysen ved at blege det fluorescerende mærkede lipiddobbeltlag på et tilfældigt enkelt nanobarområde.
    1. Markér afkrydsningsfelterne Eksperimentområder og blegning . Tegn et cirkulært område med en diameter på 5 μm, som kan omfatte hele nanobaren i midten (nanobarstørrelse er 2 μm) og føj til eksperimentregionerne. Indtast time-lapse-billeddannelsesparametre som følgende eksempel: Vælg Scanningshastighed = 9 og Gennemsnit = 1. Vælg Tidsserie > Varighed = 100 cyklusser og Interval = 2 s. Indtast blegningsparametre som følgende eksempel: Markér afkrydsningsfeltet Start efter # billeder, og vælg tre billeder.
    2. Marker laserafkrydsningsfelterne, der udfører FRAP, og skift strømmen til 100,0 %. Klik på Start eksperiment for FRAP-eksperimentet.
      BEMÆRK: FRAP er en almindelig metode til at karakterisere mobiliteten af cellulære molekyler. Hvis SLB har god fluiditet, vil fluorescensen i det blegede område gradvist komme sig, efterhånden som blegede fluorophorer diffunderer ud og ublegede fluorophorer fra andre områder diffunderer ind.
  5. Læg proteinopløsningen i PDMS-kammeret og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur for at tillade binding af proteinet på SLB.
    BEMÆRK: De proteiner, der anvendes i figur 2G, H til at demonstrere lipidsammensætning, letter proteinbinding på nanobarbuede SLB'er, er 74 μM GFP og 79 μM GFP-His. Disse to proteiner er grønne fluorescensproteiner uden eller med His-tag. De proteiner, der anvendes til krumningsfølingsundersøgelse i figur 4 og figur 5, er 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 og 16 μM FBAR +IDR FBP17. Disse tre proteiner er domænerne fra FBP17, som er et typisk BAR-protein, der intuitivt antages som både krumningsgeneratorer og sensorer. Hvert proteinvolumen er 20 μL.
  6. Fokuser nanobarerne igen, og gentag trin 4.3 for at tage billeder af både lipid- og proteinkanaler til detektion af proteinkrumningssensor.
  7. Gentag trin 4.4 for at udføre FRAP-analysen på både lipid- og proteinkanaler og udføre time-lapse-billeddannelse for at karakterisere mobiliteten af krumningsfølende protein.

5. Genbrug af nanochip

  1. Grib nanochippen med en pincet og fjern den forsigtigt fra PDMS-kammeret i et 50 ml bægerglas fyldt med deioniseret vand.
    BEMÆRK: Dette er et kritisk skridt. Undgå, at pincetten rører ved nanostrukturen, og tving ikke chippen til at adskille for at undgå revner.
  2. Vask nanochippen grundigt med vandfri ethanol for at fjerne organiske rester, der er fastgjort på overfladen.
    BEMÆRK: Brug rent silkepapir til at fjerne vand på overfladen inden vask med vandfri ethanol.
    FORSIGTIG: Vandfri ethanol er et meget flygtigt og lidt farligt kemikalie. Undgå kontakt med hud og øjne. Brug den i røghætten med masken og handskerne på.
  3. Vask chippen grundigt med rigeligt deioniseret vand for at fjerne resterende ethanol. Føntør derefter chippen med 99,9% nitrogengas.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne alle spor af ethanol på chippen, før du går videre til næste trin, fordi piranhasyren kan reagere voldsomt med organisk opløsningsmiddel og kan forårsage eksplosioner.
  4. Læg chippen i et rent 10 ml bægerglas med mønstersiden opad, og rengør chippen med piranha-opløsning til genbrug, der følger de samme trin som 'rengøring af nanochip'.

6. Billedkvantificering

  1. Drej de billeder, der er erhvervet af et mikroskop, så nanobar-arrayet er i lodret position til efterfølgende analyse i Fiji-software.
  2. Brug en specialskrevet MATLAB-kode 'c_pillarmask_averaging' til at lokalisere den enkelte nanobar ved hjælp af en firkantet maske (51 pixels x 51 pixels) både i lipidkanalen og proteinkanalen.
    BEMÆRK: Denne MATLAB-kode er specielt designet til nanochippen. Det kan fås på GitHub via linket: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
  3. Træk baggrundssignalerne for hvert billede med de tre ROI'er (5 pixels x 5 pixels) i hjørnerne af billedet ved hjælp af meshgrid-funktionen i MATLAB-koden 'BarGra_avg'. Denne operation har til formål at korrigere potentielle ujævne baggrundsstøj forårsaget af mikroskopopsætningen eller chipnivellering på mikroskoptrinnet.
  4. Generer de gennemsnitlige billeder af nanobarer af samme størrelse ved hjælp af MATLAB-koden 'BarGra_avg', hvor hvert punkt er gennemsnittet af værdierne på det tidspunkt i alle de enkelte nanobar-firkantede masker. Generer 3D-overfladeplots af de gennemsnitlige billeder i Fiji-software for intuitivt at vise den gennemsnitlige signalfordeling omkring nanobarerne. Vælg Analyser > Surface Plot > Input 100 for Polygon Multiplier, og vælg Afkrydsningsfelterne Skygge, Tegn akse og Udjævn.
  5. Segmenter hver nanobar i tre områder, som omfatter to nanobar-endeområder og et nanobar-centerområde for at udtrække deres fluorescensintensiteter henholdsvis ved hjælp af MATLAB-koden 'avg_nanobar_quantification'. Størrelserne på nanobar-ROI'erne justeres i henhold til nanobarernes dimension ved hjælp af 'position'-filen.
  6. Opdel proteinintensiteterne med lipidintensiteter ekstraheret fra MATLAB-koden 'avg_nanobar_quantification' i bar-end-området for at få nanobar-end-tætheden, som udelukker overfladearealeffekten.
  7. Afbild nanobar-end-densiteten med forskellige koncentrationer i GraphPad Prism for at få bindingskurven. Åbn menuen Analysér . Vælg Ikke-lineær regression (kurvetilpasning) > Binding - Mætning > Specifik binding med Hill-hældningsfunktion for at tilpasse kurven til Hill-ligningen, og beregn derefter KD- og Hill-koefficientværdien.
  8. Lipid- og proteinintensiteterne normaliseres til deres tilsvarende intensiteter ved 600 nm nanobarcentret erhvervet i samme billede ved hjælp af MATLAB-koden 'avg_nanobar_quantification'.
  9. Brug de lyseste ni pixels normaliserede proteinintensiteter ved nanobar-end-området divideret med bar-centerområdet til at kvantificere proteinkrumningssensoren med nanobarer af samme størrelse, værdien er navngivet som "ende-til-center-forhold". Brug forholdet mellem normaliseret proteinintensitet til at normalisere lipidintensiteten til at kvantificere proteinkrumningssensorområdet med nanobarer af forskellig størrelse, værdien hedder "Normaliseret Nanobar-End Density". Disse værdier beregnes ved hjælp af MATLAB-koden 'avg_nanobar_quantification'.
  10. Indlæs FRAP-stakbilledet i Fiji-software. Vælg FRAP-området, og generer et investeringsafkast. Vælg funktionen Mere > multimåling for at måle intensiteten af FRAP-området for hver gang. Afbild intensiteten i GraphPad Prism for at generere FRAP-gendannelseskurven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nanobar-design anbefales til sondering af positive krumningsfølende proteiner, som indeholder en halvcirkel i hver ende med krumning defineret af nanobarbredden og en flad / nul krumningskontrol lokalt i midten (figur 2A, B). Vellykket dannelse af SLB på nanobarer resulterer i jævnt fordelte lipidmarkørsignaler over hele nanobaroverfladen som vist i figur 2C. Signaler fra flere nanobarer kan kombineres ved at beregne gennemsnittet af de enkelte nanobarbilleder (figur 2D), så tilfældige variationer mellem forskellige nanobarer kan minimeres. En tidligere elektronmikroskopiundersøgelse viste, at celleplasmamembran dannede konform belægning omkring hele nanostrukturerne24. Derfor menes det syntetiske lipiddobbeltlag også at fastgøre tæt på nanostrukturoverfladen, hvilket giver diffraktionsbegrænsede linjer på 200 nm nanobaren som observeret i figur 4E. Derudover kan membranfluiditeten på den nanobarbuede SLB også karakteriseres ved FRAP-assay, hvor det fluorescerende signal på en enkelt nanobar kan bleges individuelt til membranfluiditetskarakterisering (figur 2E,F).

Dannelsen af SLB på nanobars kræver generering af SUV'er på samme måde som SLB-formationen på flade overflader som rapporteret tidligere17. Lipidsammensætningen af SUV'er bestemmer overfladekemien i den nanobar-buede SLB, der kan ændres til membranmærkning og forskellige proteinbindingsmekanismer. For eksempel kan Texas Red DHPE tilsættes i ~ 0,5 mol% i SUV'er, så berigelsen af membranoverfladearealet på nanobarer let kan afbildes ved fluorescensmikroskopi (figur 2C). Udover visualisering kan lipidsammensætningen også ændres for at lette proteinbinding på nanobar-buede SLB'er. For at lette forankringen af his-mærkede proteiner kan nikkel-nitrilotrieddikesyre (Ni-NTA) f.eks. bringes til SLB på nanobarerne ved at inkorporere 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl) iminoeddikesyre) succinyl] (nikkelsalt) (18:1 DGS-NTA(Ni)) i SUV'er (~1 mol%)25. Uden denne funktionelle gruppe på lipider kan grønt fluorescensprotein (GFP) ikke binde til SLB med negativt ladet PS, hvilket resulterer i et mørkere stangformet hul på hver nanobarplacering på grund af volumetrisk udtømning af GFP-signaler i opløsningen (figur 2G). Til sammenligning kan His-mærket GFP ved at tilføje 1 mol% 18: 1 DGS-NTA (Ni) i SLB stærkt forankres på membranen for tydeligt at følge SLB-formen buet af nanobarer (figur 2H). Lipiddiffusionen viste ikke en påviselig forskel på proteinbinding som undersøgt ved FRAP-assay (supplerende figur 1). Det er værd at bemærke, at FRAP-målingen kun er baseret på intensiteten af 0,5 mol% Texas Red DHPE i SLB, som muligvis ikke repræsenterer den 1 mol% DGS-NTA (Ni), der anvendes til binding af His-tag-proteinet. Derudover kan ladede lipider såsom PS forbedre proteinbinding gennem elektrostatisk interaktion26, mens signallipider såsom phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphat (PIP2) også kan integreres i SUV'er for at lette specifik proteinbinding (f.eks. FCHo2, for hvilken PIP2 findes afgørende for dens membrankrumningssensor27).

Kvaliteten af SLB-dannelse med hensyn til overfladeensartethed og membranfluiditet er afgørende for at undersøge proteinkrumningssensorevnen på nanobarer. Der er tre typiske problemer, der kan kompromittere SLB-ensartethed og fluiditet. Den ene er bindingen af overskydende SUV'er på SLB på grund af ineffektiv vask, der genererer puncta både på nanobarerne og på den flade membran mellem nanobarerne (figur 3A, B). Det påvirker signifikant kvantificeringen af proteinbinding på buede eller flade overflader på nanobarer til vurdering af krumningsregistrering. Et andet problem er den uventede introduktion af luftbobler inde i PDMS-kammeret under vasketrinnet, hvilket kan ødelægge SLB langs banen for luft-væske-grænsefladen og efterlade ridselignende funktioner, der let kan identificeres med ekstremt lave lipidsignaler på nanobaroverfladen (figur 3C, D). Desuden efterlader forkert rensede nanobarsubstrater tilfældigt fordelte kemiske rester på overfladen, der forhindrer lipidadsorption til SLB-dannelse. Det fører til generering af membranfejl, der måske eller måske ikke er over den optiske opløsning til mikroskopivisualisering (figur 3E). Imidlertid vil membranfluiditeten blive følsomt påvirket af dannelse af membrandefekter28 , således at FRAP-assay kan bruges til at verificere overfladens renhed (figur 3F, G).

For at demonstrere karakteriseringen af krumningsfølende protein ved hjælp af nanobararray sammenlignes det typiske F-BAR-domæne med et nyligt identificeret iboende uordnet område i FBP17 (IDRFBP17). F-BAR er fluorescerende mærket med Alexa Fluor 488 tetrafluorphenylesterfarvestoffer, mens IDRFBP17 er mærket med Alexa Fluor 647 C2 Maleimid. Som vist i figur 4A viser begge proteindomæner øget akkumulering på SLB-belagte individuelle nanobarer med 300 nm bredde. Her indeholder SLB 10% PS for elektrostatisk at forbedre proteinbindingen. Proteinets krumningssensorevne kan identificeres ved præferenceberigelsen ved de buede nanobarender med højere fluorescerende intensitet end signalerne ved de flade nanobarcentre, hvilket er mere tydeligt vist efter billedgennemsnit fra mere end 100 nanobarer (figur 4B). Krumningssensorevnen kan afspejles kvantitativt ved at beregne ende-til-center-forholdet på hver nanobar (dvs. fluorescensintensiteten i nanobar-enden versus nanobarcentret). Som vist i figur 4C har begge proteiner et højere ende-til-center-forhold end lipider, hvilket er omkring 1. Når man sammenligner IDR FBP17 og F-BAR, kan det ses, at det højere ende-til-center-forhold forIDR FBP17 (1,385 ±0,011, gennemsnit ± SEM) indikerer stærkere krumningsføling end F-BAR (1,144 ± 0,004, gennemsnit ± SEM).

For at undersøge rækkevidden af krumninger, der kan mærkes af proteinerne, genereres SLB på nanobararrays med gradientbredder fra 200 nm til 600 nm (figur 4D), hvor lipider viste homogen belægning på nanobarer af forskellig størrelse (figur 4E). Tre proteiner (IDR FBP17, F-BAR og F-BAR +IDR FBP17) inkuberes på gradient nanobar-arrayet, og alle viste præferenceakkumulering på nanobar-enden buede membransteder, når krumningen faldt til under 400 nm i diameter (figur 4E, F). Blandt disse tre proteindomæner giverIDR FBP17 den højeste nanobar-endetæthed, hvilket indikerer dens stærkeste krumningssensorevne, mens F-BAR viser den laveste værdi (figur 4F). Desuden kan bindingskurven for krumningssensorproteinet også afbildes ved gradvist at øge proteinkoncentrationen (figur 4G), hvilket viser, at IDRFBP17 har en stærk kooperativ krumningssensorevne. Ved tilpasning af dens bindingskurve til Hill-ligningen findes KD i μM-området (0,6 ± 0,1 μM), og Hill-koefficienten (H) er mellem 2 og 3, hvilket tyder på en ultrasensitiv binding afIDR FBP17 til nanobar-inducerede membrankrumninger. Jo skarpere krumningen er, desto højere er bindingskapaciteten ved ligevægt.

Den dynamiske membrandiffusion og membranassociation af krumningsfølende proteiner omkring de nanobarformede SLB-steder kan også studeres af FRAP. Sammenlignet med den hurtige genopretning af lipidsignaler på nanobarer (figur 5A, E) kunne F-BAR ikke komme sig inden for 2 minutter (figur 5B, E), hvilket tyder på dens signifikant nedsatte membranmobilitet og associeringsdynamik på de buede membransteder. Overraskende, forskellig fra F-BAR's opførsel, viste idr FBP17-signalet åbenbar genopretning inden for samme tidsramme (figur 5C, E), hvilket indikerer den dynamiske karakter afIDR FBP17 akkumuleret ved de buede membraner. Efter at have vasket den ubundne IDR FBP17 væk i opløsningen, kunne den samme gendannelse iIDR FBP17-kanalen imidlertid ikke observeres som før (figur 5D, E). Det indikerer, at genopretningen domineres af udvekslingen med de opløsningsholdigeIDR FBP17-molekyler og mindre af lateral diffusion af de membranbundne molekyler.

Samlet set viser disse resultater, at dette nanobar-SLB-system er et kraftfuldt værktøj til at karakterisere membrankrumningsfølende proteiner in vitro.

Figure 1
Figur 1: Illustration af nanobar-SLB-systemet . (A) PDMS-kammeret består af de øverste og midterste lag med den rensede nanochip samlet på den. (B) Texas Red DHPE-mærkede SUV'er med zoomede detaljer. (C) Den intakte model af nanobar-SLB-systemet og zoom-in-området illustrerer, at SLB dannes på nanobarer med et ensartet enkelt lag af lipiddobbeltlaget. (D) Billeddannelses- og karakteriseringsproces under laserscanning af konfokal mikroskopi. (E) Rengøring af nanochippen med henblik på yderligere genbrug. (F) Billedbehandling til kvantificering af proteinkrumningsregistrering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Dannelsen af den buede SLB på nanobarer med proteinbinding . (A) SEM-billede af en individuel nanobar. (B) Skematisk afbildning af nanobar-SLB-systemet. (C) Fluorescerende billeder af SLB mærket med Texas Red DHPE på nanochippen. (D) Gennemsnitligt billede af SLB-fordeling på nanobarer (øverst) og et 3D-overfladediagram af det gennemsnitlige billede (nederst). Dette tal er blevet ændret fra Su et al.22 og gengivet med tilladelse. (E) Time-lapse-billeddannelse af SLB FRAP på nanobaren. Blegningsområdet er angivet med en gul stiplet cirkel. (F) Normaliseret nanobarintensitetsplot ved FRAP-måling. (G) Skematisk afbildning af GFP kan ikke bindes til SLB med 10 mol% negativ ladet PS (venstre) og et tilsvarende repræsentativt billede til højre. (H) Skematisk afbildning af His-tag mærket GFP bundet til SLB med 1 mol% DGS-NTA (Ni) (venstre) og et tilsvarende repræsentativt billede til højre. Vægtstænger: 2 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Typiske problemer, der kompromitterer SLB-kvaliteten . (A) Skematisk for SLB-forberedelse uden effektiv vask. (B) Repræsentativt billede af SLB binder med overskydende SUV'er. De gule pile viser puncta, som er overskydende SUV'er på SLB-overfladen. C) Skematisk fremstilling af SLB med indsprøjtede luftbobler. (D) Repræsentativt billede af SLB ødelagt af banen for luft-væske-grænsefladen. Den gule pil viser den ufuldstændige SLB på underlaget. (E) Skematisk over SLB-præparat med urensede nanobarsubstrater. Zoom-in-området viser et diskontinuerligt lipiddobbeltlag på grund af overfladeresterne, der forhindrer lipidadsorption. (F) Time-lapse-billeddannelse af SLB FRAP-analyse på urensede nanobarsubstrater. Blegningsområdet er angivet med en gul stiplet cirkel. (G) Normaliseret nanobarintensitetsplot ved FRAP-måling. Vægtstænger: 2 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Proteinkrumningsfølende karakterisering af nanobar-SLB-systemet. (A) Fluorescerende billeder af F-BAR (venstre) og IDRFBP17 (højre) akkumuleres på SLB-belagte nanobarer (10% PS og 90% PC). Skalalinje: 2 μm. (B) Gennemsnitlige billeder af F-BAR (venstre top) og IDRFBP17 (venstre bund) akkumuleres på nanobarer og tilsvarende 3D-overfladeplots (henholdsvis højre top og højre bund). Skalastang: 2 μm. (C) End-to-center-forholdet mellem lipiddobbeltlaget, F-BAR og IDRFBP17 fluorescensintensitet omkring nanobaren på 300 nm bredde. En Welchs t-test blev udført til statistisk analyse. p < 0,0001. (n = 3) (D) SEM-billede af gradient nanobar arrays med bredder fra 200 nm til 600 nm. Skalabar: 5 μm. (E) Annotation af proteinkonstruktion (øverst), gennemsnitlige billeder af lipiddobbeltlag, IDR FBP17, F-BAR og F-BAR +IDR FBP17 fordeling på gradient nanobarer med bredde fra 200 nm til 600 nm (midten) og intensitetsprofiler langs nanobarerne for hvert gennemsnitligt billede (nederst). Skala bar: 2 μm. (F) IDR FBP17, F-BAR og F-BAR +IDR FBP17 normaliseret nanobar-end densitet kvantificeret med forskellige bredder af nanobarer henholdsvis. Hver data vises som middelværdien ± SEM (n ≥ 60). (G) Bindingskurven forIDR FBP17 udstyret med Hill-ligningen. Hver data vises som middelværdien ± SEM (n = 3). Dette tal er blevet ændret fra Su et al.22 og gengivet med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Den membranbindende dynamik af krumningsfølende proteiner omkring nanobaren. (A-D) Time-lapse-billeddannelse af lipiddobbeltlaget (A), F-BAR (B), IDR FBP17 (C) og IDRFBP17 udvaskede (D) FRAP-analyse på nanobaren. Blegningsområdet er angivet med en rød stiplet cirkel. Skala bar: 5 μm. (E) Normaliseret nanobar intensitet plot ved FRAP måling. Dette tal er blevet ændret fra Su et al.22 og gengivet med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Membrandiffusion før og efter tilsætning af protein. (A) Time-lapse-billeddannelse af FRAP-test på POPC-lipiddobbeltlaget med 1 mol% 18: 1 DGS-NTA (Ni) og 0,5 mol% Texas Red DHPE omkring nanobaren før (øverst) og efter (nederst) tilsætning af GFP-His protein. Blegningsområdet er angivet med en gul stiplet cirkel. (B) Normaliseret nanobarintensitetsplot ved FRAP-måling. Vægtstænger: 2 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nanobar-SLB-systemet, der er beskrevet her, tilbyder en unik kombination af fordelene ved flere eksisterende in vitro-assays. Det afslører effektivt den foretrukne binding af proteiner til stærkt buede membraner som liposomflådning eller sedimenteringsassay, men kræver meget færre prøver og tilbyder mere præcist defineret krumning på individuelle nanobarer 8,29. Det tilbyder også en bred vifte af præcist kontrolleret krumning til samtidig sammenligning som SLiC-analysen, med mindre bekymring for lipidsammensætningsændring i forskellige krumninger og uopdagelige morfologiske eller krumningsændringer med størrelser under diffraktionsgrænsen for lys, da SLB er mobil og kontinuerligt dækker alle størrelser af nanobarer tæt30 . Nanobar-SLB tillader også observation af dynamisk opførsel af protein på den buede membran som de tether-trækkende assays, men ikke begrænset af gennemstrømningen af rørgenerering og erfaring med optisk fangstmanipulation13. Selvom SMrT-analysen genererer membranrør i høj gennemstrømning, varierer membrankrumningen langs nanorøret, hvilket gør det sværere at studere krumningsfølsomheden af proteiner16. Mere interessant sammenlignet med andre SLB-baserede systemer på det mønstrede substrat18,19,20,27 giver nanobar-SLB et fladt stangcenter ved siden af den definerede krumning i stangenden, som effektivt tjener som lokal kontrol af nulkrumning for at minimere virkningen af overfladetæthedsvariationer på kvantitativ analyse. Evnen til at tilpasse krumningskombinationer ved hjælp af elektronstrålelitografi med høj opløsning kan generere ikke kun lokale nulkrumningskontroller, men også positive og negative krumninger som vist tidligere i levende cellestudier2.

Der er potentielle begrænsninger, der er værd at bemærke, når du bruger denne metode. For det første er nanofabrikation på chippen en relativt kompleks procedure med renrumsfaciliteter og specialudstyr, der er nødvendige (især en E-stråleforfatter). Denne høje pris fik os til at genbruge chippen; dette resulterer i længere tid brugt på rengøring af spånoverfladen og samling af chippen med PDMS sammenlignet med engangsbrug. Tilgængeligheden af nanochip er en anden type begrænsning. Forkert betjening ved brug af chippen, såsom at vende overfladen mod bænken, kan forårsage nedslidning af nanostrukturen, især for strukturer med højt aspektforhold. Desuden er lipiddobbeltlaget dannet på substratet en kontinuerlig membran; spændingen kan let forplante sig overalt. For undersøgelser, der kræver manipulation af membranspændingen, giver teknikker som tether trukket fra GUV'er via det vedhæftede mikropipettesystem mere bekvemme løsninger10.

For at opnå optimale resultater er følgende trin også kritiske. (i) Vesikelstørrelse er afgørende for SLB-dannelse31,32. Tidligere litteratur viser en højere tilbøjelighed til fusion til mindre vesikler (< 90 nm) sammenlignet med større størrelse ved hjælp af en kvartskrystalmikrobalance med spredning (QCM-D) test32. Sammenlignet med LUV'er på 300 nm vil diametrene på ~ 50 nm således være lettere for SLB-dannelse. I betragtning af dette problem er der behov for mindst 20 gange i både fryse-optønings- og ekstruderingstrin for at danne homogene SUV'er til SLB-dannelse. FRAP-test er også nødvendig i hvert eksperiment for at validere membranmobiliteten. (ii) Under SUV-forberedelsen skal alt udstyr holdes rent for at undgå forurening af støvlignende små partikler. Især for mini-ekstruderen er nålene let tilstoppede i et snavset miljø. iii) For at forberede SUV'er af god kvalitet skal chloroformen i lipidblandingen fjernes fuldstændigt for at undgå at ødelægge lipidvesikler. (iv) Plasmarensning af chippen skal udføres frisk før SLB-dannelse for at sikre en meget hydrofil overflade for effektiv SUV-brud for at danne et kontinuerligt dobbeltlag. Langvarig eksponering i miljøet efter plasmabehandling kan forårsage uspecifik binding af støvpartikler eller organiske rester til spånoverfladen, hvilket kompromitterer overfladens hydrofilicitet. (v) For at samle PDMS-kammeret til SLB-dannelse og proteininkubation er renheden og fladheden af hvert PDMS-stykke vigtigt for at sikre en god forsegling af den flydende kanal. Enhver lækage af kammeret kan få SLB til at tørre ud eller ændre proteinkoncentrationen. (vi) Justering af billedfokusfokus er afgørende for at sikre ensartet intensitetsmåling, da nanobarens højde (600 nm) kan sammenlignes med brændvidden af laserscanningskonfokalmikroskopien i z-aksen33. Fokus skal justeres igen, hver gang arrayet bevæger sig vandret for at bevare skarpheden af nanobarkanterne i billederne.

Frem for alt giver nanobar-SLB-systemet, der introduceres her, en kraftfuld metode til at studere membrankrumningsfølende proteiner. Forskellige parametre, der påvirker proteininteraktionen med den buede membran, kan undersøges kvantitativt på tværs af en række krumninger, såsom krumningsfølsomme domæner (f.eks. BAR-domæne og amfifilisk helix) af proteinet 8,30, lipidsammensætning (f.eks. PS og PIP2) af membranen27,34, pH, ionstyrke og temperatur i miljøet35,36 samt protein-protein-interaktionen for kompleks dannelse (f.eks. kan CHMP2B og CHMP2A bidrage forskelligt til ESCRT-III-katalyserede membranombygningsprocesser)37,38. Dynamiske undersøgelser kan også udføres ved hjælp af nanobar-SLB-systemet til at sondere membranbindende kinetisk11, membranproteindiffusion eller samling39 samt enzymatiske reaktioner 40 eller faseseparation opfører sig 13,41,42. Derudover betragtes det kunstige lipiddobbeltlag generelt som symmetrisk med hvert lipidmonolag, der indeholder samme lipidsammensætning, hvilket er helt forskelligt fra den levende cellemembran43. Inducering af et asymmetridobbeltlag for bedre at efterligne plasmamembranen kan opnås ved at ændre overfladematerialet, buffertilstanden, lipidsammensætningen eller temperaturen44,45,46,47. Det er af stor værdi at kontrollere, om der kan dannes et asymmetrisk dobbeltlag på nanobar-SLB-systemet for at studere proteinadfærd på den buede membran, hvilket fortjener yderligere undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse i dette arbejde.

Acknowledgments

Vi takker Nanyang NanoFabrication Center (N2FC) og Center for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) ved Nanyang Technological University (NTU) for at støtte nanostrukturfabrikation og SEM-billeddannelse, Protein Production Platform (PPP) på School of Biological Sciences NTU for proteinrensning og School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for det konfokale mikroskop. Dette arbejde finansieres af Singapore Ministry of Education (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 og MOE-T2EP30220-0009), Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) støttet af MOE-finansiering under Research Centres of Excellence-ordningen (W. Zhao), Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for forskningsstipendiet (X. Miao) og China Scholarship Council for forskningsstipendiet (J. Wu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

Tags

Biokemi udgave 189 nanobar array membrankrumning krumningsfølende protein understøttet lipiddobbeltlag in vitro-assay
Et nanobar-understøttet lipiddobbeltlagssystem til undersøgelse af membrankrumningsfølende proteiner <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A… More

Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter