Her er et nanobar-understøttet lipid dobbeltlagssystem udviklet til at give en syntetisk membran med en defineret krumning, der muliggør karakterisering af proteiner med krumningssensorevne in vitro.
Membrankrumning spiller vigtige roller i forskellige vigtige processer af celler, såsom cellemigration, celledeling og vesikelhandel. Det genereres ikke kun passivt af cellulære aktiviteter, men regulerer også aktivt proteininteraktioner og er involveret i mange intracellulære signalering. Det er således af stor værdi at undersøge membrankrumningens rolle i reguleringen af fordelingen og dynamikken af proteiner og lipider. For nylig er der udviklet mange teknikker til at studere forholdet mellem den buede membran og protein in vitro. Sammenlignet med traditionelle teknikker tilbyder det nyudviklede nanobar-understøttede lipiddobbeltlag (SLB) både høj kapacitet og bedre nøjagtighed i membrankrumningsgenerering ved at danne et kontinuerligt lipiddobbeltlag på mønstrede arrays af nanobarer med en foruddefineret membrankrumning og lokal flad kontrol. Både lipidfluiditeten og proteinfølsomheden over for buede membraner kan kvantitativt karakteriseres ved hjælp af fluorescensmikroskopibilleddannelse. Her introduceres en detaljeret procedure for, hvordan man danner en SLB på fabrikerede glasoverflader indeholdende nanobararrays og karakterisering af krumningsfølsomme proteiner på sådanne SLB. Derudover er protokoller til genbrug af nanochip og billedbehandling dækket. Ud over nanobar-SLB er denne protokol let anvendelig på alle typer nanostrukturerede glaschips til krumningssensorundersøgelser.
Membrankrumning er en kritisk fysisk parameter for en celle, der forekommer i en række cellulære processer såsom morfogenese, celledeling og cellemigration1. Det er almindeligt anerkendt nu, at membrankrumning er ud over et simpelt resultat af cellulære begivenheder; i stedet er det opstået som en effektiv regulator af proteininteraktioner og intracellulær signalering. For eksempel viste det sig, at flere proteiner involveret i clathrinmedieret endocytose fortrinsvis binder til den buede membran, hvilket resulterer i dannelsen af et hotspot for endocytose2. Der er mange forskellige årsager til membrandeformation, såsom membrantrækning af cytoskeletale kræfter, tilstedeværelsen af lipidasymmetri med hovedgrupper af forskellig størrelse, eksistensen af transmembranproteiner med konisk form, akkumulering af membranformende proteiner som BAR-domæneproteiner (opkaldt efter Bin-, amphiphysin- og Rvs-proteiner) og indsættelse af amfipatiske helices-domæne i membranen1 . Interessant nok deformerer disse proteiner og lipider ikke kun membranen, men kan også mærke membrankrumningen og udvise præferenceakkumulering1. Derfor er det afgørende at undersøge, om og hvordan membraner med forskellige krumninger ændrer fordelingen og dynamikken af proteiner og lipider, der er knyttet til dem, og de potentielle virkninger på de relaterede intracellulære processer.
Mange teknikker er udviklet til at analysere interaktionen mellem buet membran og proteiner i både levende celle- og in vitro-systemer. Det levende cellesystem giver et ægte cellemiljø med rig lipiddiversitet og dynamisk proteinsignalregulering 2,3,4,5,6,7. Et sådant sofistikeret system er imidlertid vanskeligt at studere på grund af usikkerheder og udsving i det intracellulære miljø. Derfor er in vitro-assays ved hjælp af en kunstig membran sammensat af kendte lipidarter og oprensede proteiner blevet kraftfulde rekonstitutionssystemer til at karakterisere forholdet mellem proteiner og buede membraner. Traditionelt genereres liposomer med forskellige diametre ved ekstrudering for at detektere krumningsfølsomme proteiner via enten et co-sedimentationsassay ved hjælp af centrifugalkraft eller et co-flotationsassay med en densitetsgradient for at undgå proteinaggregering 8,9. Krumningen af de ekstruderede liposomer er imidlertid begrænset af den tilgængelige porestørrelse på membranfilteret, der anvendes i ekstruderen10. Single liposome curvature (SLiC) assay har vist sig at overvinde denne begrænsning, hvor liposomer med forskellige diametre fluorescensmærkes og immobiliseres på overfladen, så krumningen kan markeres af fluorescerende intensitet11. Imidlertid er der observeret stærk variation i lipidsammensætning i små vesikler, hvilket påvirker nøjagtigheden af krumningsmålingen12. Tether-pulling eksperimenter giver en mere præcis måling af krumningen på den forbigående tether, der trækkes fra gigantiske unilamellar vesikler (GUV’er) ved hjælp af en optisk pincet, hvor krumningen godt kan styres af membranspændingen genereret13,14. Denne metode er egnet til at studere enten positive eller negative krumningsfølende proteiner, men er begrænset af gennemstrømningen af rørgenerering10. Understøttede membranrør (SMrT) assay giver samtidig generering af flere membranrør, der ekstruderes fra det samme lipidreservoir ved mikrofluidiske strømme. Ikke desto mindre varierer membrankrumningen iboende langs nanorøret, hvilket kompromitterer nøjagtigheden af fluorescensintensitetsbaseret krumningsmåling15,16. Til sammenligning genererede brug af små unilamellar vesikler (SUV’er, diameter <100 nm17) til dannelse af et understøttet lipiddobbeltlag (SLB) på overflader indeholdende designede topografier en enkelt dobbeltlagsmembran med krumninger forudbestemt af nanofabrikation eller nanomaterialer med høj nøjagtighed18,19,20.
Her præsenterer vi en protokol for dannelsen af SLB på fabrikerede nanochipoverflader med nanobar-arrays, og hvordan den kan bruges til at undersøge krumningsfølsomheden af proteiner in vitro. Som vist i figur 1 er der seks væsentlige komponenter i analysen: A) Rengøring og samling af chippen med et mikrofluidisk kammer; B) Fremstilling af SUV’er med defineret lipidsammensætning; C) Dannelse af SLB på en nanochip og binding med krumningsfølsomme proteiner; D) Billeddannelse og karakterisering af SLB og krumningsfølsomme proteiner under fluorescensmikroskopi; E) Rengøring af chippen til genbrug; F) Billedbehandling til kvantitativ analyse af proteinkrumningssensorevne. Den detaljerede protokol er beskrevet trin for trin nedenfor.
Nanobar-SLB-systemet, der er beskrevet her, tilbyder en unik kombination af fordelene ved flere eksisterende in vitro-assays. Det afslører effektivt den foretrukne binding af proteiner til stærkt buede membraner som liposomflådning eller sedimenteringsassay, men kræver meget færre prøver og tilbyder mere præcist defineret krumning på individuelle nanobarer 8,29. Det tilbyder også en bred vifte af præcist kontrolleret krumning til samtidig samme…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Nanyang NanoFabrication Center (N2FC) og Center for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) ved Nanyang Technological University (NTU) for at støtte nanostrukturfabrikation og SEM-billeddannelse, Protein Production Platform (PPP) på School of Biological Sciences NTU for proteinrensning og School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for det konfokale mikroskop. Dette arbejde finansieres af Singapore Ministry of Education (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 og MOE-T2EP30220-0009), Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) støttet af MOE-finansiering under Research Centres of Excellence-ordningen (W. Zhao), Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for forskningsstipendiet (X. Miao) og China Scholarship Council for forskningsstipendiet (J. Wu).
Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
Cotton buds | Watsons | ||
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
MATLAB | Mathworks | R2018b | |
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
Voterx | Scientific Industries | G560E | |
Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
Water Bath | Julabo | TW8 |