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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64340
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology, Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

Qui, viene sviluppato un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per fornire una membrana sintetica con una curvatura definita che consente la caratterizzazione di proteine con capacità di rilevamento della curvatura in vitro.

Abstract

La curvatura della membrana svolge un ruolo importante in vari processi essenziali delle cellule, come la migrazione cellulare, la divisione cellulare e il traffico di vescicole. Non solo è generato passivamente dalle attività cellulari, ma regola anche attivamente le interazioni proteiche ed è coinvolto in molte segnalazioni intracellulari. Pertanto, è di grande valore esaminare il ruolo della curvatura della membrana nella regolazione della distribuzione e della dinamica delle proteine e dei lipidi. Recentemente, molte tecniche sono state sviluppate per studiare la relazione tra la membrana curva e la proteina in vitro. Rispetto alle tecniche tradizionali, il nuovo nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offre sia un throughput elevato che una migliore precisione nella generazione della curvatura della membrana formando un doppio strato lipidico continuo su matrici modellate di nanobar con una curvatura di membrana predefinita e un controllo piatto locale. Sia la fluidità lipidica che la sensibilità proteica alle membrane curve possono essere caratterizzate quantitativamente utilizzando l'imaging al microscopio a fluorescenza. Qui viene introdotta una procedura dettagliata su come formare un SLB su superfici di vetro fabbricate contenenti array di nanobar e la caratterizzazione delle proteine sensibili alla curvatura su tale SLB. Inoltre, sono coperti i protocolli per il riutilizzo dei nanochip e l'elaborazione delle immagini. Oltre al nanobar-SLB, questo protocollo è facilmente applicabile a tutti i tipi di chip di vetro nanostrutturati per studi di rilevamento della curvatura.

Introduction

La curvatura della membrana è un parametro fisico critico di una cellula che si verifica in una varietà di processi cellulari come la morfogenesi, la divisione cellulare e la migrazione cellulare1. È ampiamente riconosciuto ora che la curvatura della membrana è al di là di un semplice risultato di eventi cellulari; Invece, è emerso come un efficace regolatore delle interazioni proteiche e della segnalazione intracellulare. Ad esempio, è stato scoperto che diverse proteine coinvolte nell'endocitosi mediata da clatrina si legano preferenzialmente alla membrana curva, con conseguente formazione di un hotspot per l'endocitosi2. Ci sono molte cause diverse di deformazione della membrana come l'attrazione della membrana da parte delle forze citoscheletriche, la presenza di asimmetria lipidica con gruppi di testa di dimensioni diverse, l'esistenza di proteine transmembrana con forma conica, l'accumulo di proteine che modellano la membrana come le proteine del dominio BAR (dal nome delle proteine Bin, anfifisina e Rvs) e l'inserimento del dominio delle eliche anfipatiche nella membrana1 . È interessante notare che queste proteine e lipidi non solo deformano la membrana, ma possono anche percepire la curvatura della membrana e mostrare un accumulo preferenziale1. Pertanto, è fondamentale studiare se e come membrane con diverse curvature alterano la distribuzione e la dinamica delle proteine e dei lipidi ad esse collegati e i potenziali impatti sui relativi processi intracellulari.

Molte tecniche sono state sviluppate per analizzare l'interazione tra membrana curva e proteine sia in cellule vive che in sistemi in vitro. Il sistema di cellule vive fornisce un ambiente cellulare reale con una ricca diversità lipidica e regolazione dinamica della segnalazione proteica 2,3,4,5,6,7. Tuttavia, un sistema così sofisticato è difficile da studiare a causa delle incertezze e delle fluttuazioni nell'ambiente intracellulare. Quindi, i saggi in vitro che utilizzano una membrana artificiale composta da specie lipidiche note e proteine purificate sono diventati potenti sistemi di ricostituzione per caratterizzare la relazione tra proteine e membrane curve. Tradizionalmente, liposomi di diversi diametri sono generati per estrusione per rilevare proteine sensibili alla curvatura tramite un saggio di co-sedimentazione utilizzando la forza centrifuga o un saggio di co-flottazione con un gradiente di densità per evitare l'aggregazione proteica 8,9. Tuttavia, la curvatura dei liposomi estrusi è limitata dalla dimensione dei pori disponibile del filtro a membrana utilizzato nell'estrusore10. È stato dimostrato che il test di curvatura a liposoma singolo (SLiC) supera questa limitazione, in cui i liposomi con diametri diversi sono marcati con fluorescenza e immobilizzati sulla superficie in modo che la curvatura possa essere contrassegnata dall'intensità fluorescente11. Tuttavia, è stata osservata una forte variabilità nella composizione lipidica nelle piccole vescicole, che influisce sull'accuratezza della misurazione della curvatura12. Gli esperimenti di tirare il tethering forniscono una misurazione più accurata della curvatura sul cavo transitorio tirato da vescicole unilamellari giganti (GUV) utilizzando una pinzetta ottica, dove la curvatura può essere ben controllata dalla tensione della membrana generata13,14. Questo metodo è adatto per studiare proteine sensibili a curvatura positiva o negativa, ma è limitato dal throughput della generazione del tubo10. Il test SMrT (Supported Membrane Tubes) consente la generazione simultanea di più tubi a membrana che vengono estrusi dallo stesso serbatoio lipidico mediante flussi microfluidici. Tuttavia, la curvatura della membrana varia intrinsecamente lungo il nanotubo, il che compromette l'accuratezza della misurazione della curvatura basata sull'intensità di fluorescenza15,16. In confronto, l'utilizzo di piccole vescicole unilamellari (SUV, diametro <100 nm17) per formare un doppio strato lipidico supportato (SLB) su superfici contenenti topografie progettate ha generato una singola membrana a doppio strato con curvature predeterminate da nanofabbricazione o nanomateriali in alta precisione18,19,20.

Qui, presentiamo un protocollo per la formazione dell'SLB su superfici di nanochip fabbricate con array di nanobar e come può essere utilizzato per sondare la sensibilità alla curvatura delle proteine in vitro. Come mostrato in Figura 1, ci sono sei componenti essenziali del test: A) Pulizia e assemblaggio del chip con una camera microfluidica; B) Preparazione di SUV con composizione lipidica definita; C) Formazione dell'SLB su un nanochip e legame con proteine sensibili alla curvatura; D) Imaging e caratterizzazione delle proteine SLB e curvature sensibili al microscopio a fluorescenza; E) Pulizia del chip per il riutilizzo; F) Elaborazione di immagini per l'analisi quantitativa della capacità di rilevamento della curvatura proteica. Il protocollo dettagliato è descritto passo dopo passo di seguito.

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Protocol

1. Pulizia del nanochip

  1. Posizionare il nanochip in un becher da 10 mL con il lato modellato rivolto verso l'alto.
    NOTA: Questo nanochip di quarzo è stato fabbricato mediante litografia a fascio di elettroni come descritto prima21. La geometria e la disposizione della nanostruttura sul chip possono essere progettate su misura. Le dimensioni delle nanobarre di gradiente utilizzate qui sono 2000 nm di lunghezza, 600 nm di altezza e da 100 a 1000 nm di larghezza (100 nm step-set).
  2. Aggiungere con cautela 1 mL di acido solforico al 98% al becher e assicurarsi che l'acido copra completamente la parte anteriore e posteriore del chip.
    NOTA: l'acido solforico al 98% è estremamente corrosivo e può causare una rapida distruzione dei tessuti e gravi ustioni chimiche a contatto con la pelle o gli occhi. Utilizzarlo nella cappa aspirante con un'adeguata protezione.
  3. Ruotare lentamente il becher e aggiungere 200 μL di perossido di idrogeno al 30% goccia a goccia fino a quando l'intero becher diventa caldo. Assicurarsi che l'acido solforico e il perossido di idrogeno siano ben miscelati per formare una soluzione di piranha per la rimozione delle molecole organiche dal nanochip17. Esistono tecniche alternative per generare l'SLB su superfici idrofile pulite, come la luce UV e l'esposizione all'ozono come descritto in precedenza23.
    NOTA: La reazione è estremamente esotermica e può far bollire la soluzione, quindi aggiungi il perossido di idrogeno all'acido solforico goccia a goccia e continua a ruotare.
  4. Posizionare il becher in un contenitore di vetro secondario e mantenere il nanochip immerso nella soluzione di piranha durante la notte per pulire accuratamente le impurità.
    NOTA: Posizionare il becher nella cappa aspirante senza alcun coperchio nel caso in cui la reazione possa generare gas.
  5. Estrarre il becher e pipettare con cura la soluzione di piranha in un contenitore per rifiuti acidi.
  6. Caricare 5 ml di acqua deionizzata nel becher per diluire l'acido residuo e gettarlo nei rifiuti acidi. Ripetere questo passaggio cinque volte e utilizzare 5 M NaOH per neutralizzare i rifiuti acidi.
  7. Afferrare il chip con una pinzetta e lavare con un flusso continuo di acqua deionizzata per rimuovere accuratamente l'acido residuo. Asciugare il chip con azoto gassoso al 99,9% per la formazione di SLB22.

2. Generazione di piccole vescicole unilamellari (SUV)

  1. Aggiungere 100 μL di cloroformio in un flaconcino ambrato.
    NOTA: Il cloroformio è un liquido altamente volatile, incolore e può essere tossico se inalato o ingerito. Usalo nella cappa aspirante con la maschera e i guanti.
  2. Sciogliere 500 μg della miscela lipidica in cloroformio. La composizione della miscela lipidica utilizzata qui è 89,5 mol% di fosfatidilcoline d'uovo (PC), 10 mol% di fosfatidilserina cerebrale (PS) e 0,5 mol% di Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, sale di trietilammonio (Texas Red DHPE).
  3. Asciugare la miscela lipidica nel flaconcino con azoto gassoso al 99,9% fino a quando il cloroformio è volatilizzato e la miscela lipidica è asciutta.
    NOTA: questo passaggio deve essere eseguito nella cappa aspirante. Evitare spruzzi di liquidi durante l'asciugatura.
  4. Introdurre la miscela lipidica presente nel flaconcino ambrato senza coperchio nell'essiccatore sottovuoto ricoperto di fogli di alluminio. Quindi asciugare sottovuoto il campione con una pompa per 3 ore per volatilizzare completamente il cloroformio.
  5. Aggiungere 250 μL di tampone salino tampone fosfato (PBS) al flaconcino. Vortice la soluzione fino a quando non è omogenea.
    NOTA: il tampone PBS è costituito da 150 mM NaCl, senza calcio, magnesio e rosso fenolo; il pH è regolato a 7,2 per rendere il doppio strato lipidico PC e PS.
  6. Sonicare la miscela lipidica per 30 minuti ad una frequenza di 50 kHz in un sonicatore da bagno. Quindi trasferire la miscela lipidica in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e sigillare con parafilm.
  7. Congelare la miscela lipidica in azoto liquido per 20 secondi e poi scongelare a 42 °C per 2 minuti a bagnomaria. Ripetere i cicli di congelamento-disgelo 30 volte. Dopo di ciò, la miscela lipidica sembra un liquido chiaro.
    ATTENZIONE: L'azoto liquido ha un punto di ebollizione di circa -195,8 °C. Può causare congelamento o ustioni criogeniche. Usalo nello spazio non confinato con i guanti di isolamento termico.
  8. Risciacquare due siringhe a tenuta di gas di vetro e il connettore del miniestrusore rispettivamente con etanolo, cloroformio e metanolo. Ripetere la sequenza di risciacquo cinque volte per pre-pulire l'apparecchio. Lasciarli nella cappa aspirante fino a quando il solvente organico è completamente volatilizzato.
  9. Assemblare l'apparecchio miniestrusore e far passare 500 μL di tampone PBS attraverso il connettore per pre-bagnare l'apparecchio, quindi gettare il tampone da un'altra siringa. Questo passaggio rimuove le impurità e facilita l'estrusione.
  10. Assemblare l'apparato miniestrusore con una membrana filtrante in policarbonato di dimensioni pore da 100 nm.
    NOTA: La dimensione dei pori della membrana filtrante determina il diametro dei liposomi.
  11. Prelevare 500 μL di tampone PBS con una delle siringhe e spingerlo delicatamente attraverso il filtro per riempire la seconda siringa vuota all'altra estremità. Ripetere l'estrusione avanti e indietro tre volte per controllare la perdita dell'apparecchio ed eliminare il tampone dalla seconda siringa.
  12. Far passare la miscela lipidica attraverso il mini estrusore per sostituire il tampone PBS. Quindi estrudere avanti e indietro 20 volte per formare SUV. Il carattere multilamellare delle vescicole può essere mantenuto con un numero insufficiente di tempi di estrusione, che influenzerà la formazione di SLB23.
  13. Raccogliere i SUV dalla seconda siringa per ridurre la contaminazione con particelle più grandi e trasferirla in un tubo da centrifuga da 1,5 ml.
    NOTA: Rimuovere la siringa direttamente dal connettore nel caso in cui la siringa si rompa.
  14. Avvolgere il tubo con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento dei lipidi marcati con fluorescenza e conservarli a 4 °C. Di solito, i SUV possono essere conservati per un massimo di 7 giorni.

3. Formazione dell'SLB su un nanochip

  1. Estrarre accuratamente il nanochip pulito dall'acqua deionizzata con un paio di pinzette e asciugare con il 99,9% di azoto gassoso.
  2. Eseguire la pulizia superficiale del nanochip con trattamento al plasma ad aria per 1 ora.
  3. Assemblare il nanochip in una camera di polidimetilsilossano (PDMS), che consiste di due pezzi di PDMS: un PDMS medio e un PDMS superiore (Figura 1A). Il PDMS centrale è sottile (~ 0,5 mm) con una grande apertura di forma ovale al centro per garantire un'esposizione sufficiente al modello nanobar. Il PDMS superiore è spesso (~ 4,0 mm) con due piccoli fori all'interno della grande apertura ovale come ingresso e uscita per la manipolazione dei liquidi.
    1. Posizionare il chip su una superficie pulita con il motivo rivolto verso l'alto.
    2. Coprire delicatamente il PDMS centrale con il chip e assicurarsi che l'intero modello sia esposto all'area centrale della grande apertura di forma ovale nel PDMS centrale.
    3. Coprire il PDMS superiore con il PDMS centrale e mantenere i suoi due piccoli fori all'interno della regione del grande foro ovale del PDMS centrale. Quindi viene assemblata la camera PDMS.
      NOTA: PDMS è il polimero organico a base di silicio più utilizzato. È biocompatibile, trasparente e deformabile per essere progettato come una forma personalizzata per l'assemblaggio di chip e l'imaging al microscopio. Ancora più importante, può essere incollato covalentemente a un altro strato PDMS o vetro saldamente dopo il trattamento al plasma, rendendolo adatto come camera per preparare l'SLB. Questo passaggio garantisce che ogni strato di PDMS sia ben montato per evitare spazi vuoti e perdite.
  4. Caricare i SUV nella camera PDMS da uno dei due piccoli fori nel PDMS superiore con una pipetta e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente per formare l'SLB.
  5. Pipettare delicatamente il tampone PBS nella camera PDMS da un lato del piccolo foro e rimuovere i rifiuti con un batuffolo di cotone dall'altro foro per lavare via i SUV non legati. Quindi acquisire l'SLB formato sul nanochip (la qualità dell'SLB viene testata mediante recupero di fluorescenza dopo fotosbiancamento (FRAP) come mostrato nel punto 4.4 e discusso nella sezione dei risultati rappresentativi).
    NOTA: quando si inserisce il tampone PBS nella camera, la punta della pipetta deve essere piena del tampone e a contatto con la superficie del liquido per evitare l'iniezione di bolle.

4. Imaging dell'SLB e del legame della proteina sensibile alla curvatura sul nanochip

NOTA: questa sezione dipende dal sistema di microscopio disponibile per l'esperimento. Qui, verrà descritta una linea guida generale su come eseguire l'imaging. Le impostazioni dettagliate possono essere modificate tra le diverse configurazioni del microscopio.

  1. Impostare la microscopia confocale a scansione laser utilizzando un obiettivo olio 100x (N.A.1.4). Apri il software ZEN per selezionare la potenza del laser di eccitazione che può eccitare la fluorescenza dei lipidi e delle proteine. Scegli la modalità di acquisizione > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.
  2. Regolare la messa a fuoco con la manopola di messa a fuoco per individuare le nanobarre sul chip fino a quando i bordi delle nanobarre sono nitidi sotto il canale lipidico.
  3. Impostare i parametri di scansione come di seguito per ottenere un'immagine di controllo del canale lipidico prima di aggiungere proteine: Dimensione fotogramma = 512 px x 512 px (512 pixel x 512 pixel, una dimensione pixel di 124 nm), Bit per pixel = 16 (profondità a 16 bit), Velocità di scansione = 5 e Media = 4 (modalità media di quattro volte / linea).
  4. Condurre il test FRAP sbiancando il doppio strato lipidico marcato con fluorescenza su una singola area nanobar casuale.
    1. Seleziona le caselle di controllo Aree dell'esperimento e Sbiancamento . Disegna un'area circolare di 5 μm di diametro che può includere l'intera nanobarra al centro (la dimensione della nanobarra è di 2 μm) e aggiungi alle regioni dell'esperimento. Immettere i parametri di imaging time-lapse come nell'esempio seguente: scegliere Velocità di scansione = 9 e Media = 1. Scegliere Serie temporali > Durata = 100 cicli e Intervallo = 2 s. Immettere i parametri di sbiancamento come nell'esempio seguente: selezionare la casella di controllo Inizia dopo # immagini e scegliere tre immagini.
    2. Selezionare le caselle di controllo laser che eseguono FRAP e modificare la potenza al 100,0%. Fai clic su Avvia esperimento per l'esperimento FRAP.
      NOTA: FRAP è un metodo comune per caratterizzare la mobilità delle molecole cellulari. Se l'SLB ha una buona fluidità, la fluorescenza nell'area sbiancata si riprenderà gradualmente man mano che i fluorofori sbiancati si diffondono e i fluorofori non sbiancati provenienti da altre aree si diffondono.
  5. Caricare la soluzione proteica nella camera PDMS e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per consentire il legame della proteina sull'SLB.
    NOTA: Le proteine utilizzate nella Figura 2G,H per dimostrare che la composizione lipidica facilita il legame proteico su SLB curvati a nanobar sono 74 μM GFP e 79 μM GFP-His. Queste due proteine sono proteine a fluorescenza verde senza o con His-tag. Le proteine utilizzate per lo studio del rilevamento della curvatura in Figura 4 e Figura 5 sono 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 e 16 μM FBAR+IDRFBP17. Queste tre proteine sono i domini di FBP17, che è una tipica proteina BAR che viene intuitivamente assunta sia come generatori di curvatura che come sensori. Ogni volume proteico è di 20 μL.
  6. Rifocalizzare le nanobarre e ripetere il passaggio 4.3 per acquisire immagini dei canali lipidici e proteici per il rilevamento della curvatura proteica.
  7. Ripetere il passaggio 4.4 per condurre il test FRAP su entrambi i canali lipidici e proteici ed eseguire l'imaging time-lapse per caratterizzare la mobilità della proteina sensibile alla curvatura.

5. Riutilizzo dei nanochip

  1. Afferrare il nanochip con una pinzetta e staccarlo con attenzione dalla camera PDMS in un becher da 50 ml riempito con acqua deionizzata.
    NOTA: questo è un passaggio critico. Evitare che le pinzette tocchino la nanostruttura e non forzare il chip a separarsi per evitare crepe.
  2. Lavare accuratamente il nanochip con etanolo anidro per rimuovere i residui organici attaccati sulla superficie.
    NOTA: Utilizzare carta velina pulita per rimuovere l'acqua sulla superficie prima di lavare con etanolo anidro.
    ATTENZIONE: L'etanolo anidro è una sostanza chimica altamente volatile e leggermente pericolosa. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Usalo nella cappa aspirante con la maschera e i guanti.
  3. Lavare accuratamente il chip con abbondante acqua deionizzata per rimuovere l'etanolo residuo. Quindi asciugare il chip con azoto gassoso al 99,9%.
    NOTA: È importante rimuovere tutte le tracce di etanolo sul chip prima di procedere alla fase successiva perché l'acido piranha può reagire violentemente con il solvente organico e può causare esplosioni.
  4. Collocare il chip in un becher pulito da 10 mL con il lato del modello rivolto verso l'alto e pulire il chip con una soluzione piranha per il riutilizzo che segue le stesse fasi della "pulizia del nanochip".

6. Quantificazione dell'immagine

  1. Ruotare le immagini acquisite da un microscopio in modo che l'array di nanobar sia in posizione verticale per la successiva analisi nel software Fiji.
  2. Utilizza un codice MATLAB personalizzato 'c_pillarmask_averaging' per localizzare la singola nanobar da una maschera quadrata (51 pixel x 51 pixel) sia nel canale lipidico che nel canale proteico.
    NOTA: Questo codice MATLAB è appositamente progettato per il nanochip. Può essere ottenuto su GitHub tramite il link: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
  3. Sottrarre i segnali di sfondo di ogni immagine con i tre ROI (5 pixel x 5 pixel) agli angoli dell'immagine dalla funzione meshgrid nel codice MATLAB 'BarGra_avg'. Questa operazione mira a correggere potenziali rumori di fondo irregolari causati dalla configurazione del microscopio o dal livellamento del chip sullo stadio del microscopio.
  4. Genera le immagini medie delle nanobarre delle stesse dimensioni utilizzando il codice MATLAB 'BarGra_avg', dove ogni punto è la media dei valori in quel punto in tutte le singole maschere quadrate nanobar. Genera grafici di superficie 3D delle immagini medie nel software Fiji per mostrare la distribuzione media del segnale intorno alle nanobarre in modo intuitivo. Selezionate Analizza > plottaggio superficie > Input 100 per moltiplicatore poligono e selezionate le caselle di controllo Ombra (Shade), Draw Axis (Draw Axis) e Arrotonda (Smooth).
  5. Segmenta ogni nanobar in tre aree, che includono due aree di estremità di nanobar e un'area di centro di nanobar per estrarre le loro intensità di fluorescenza rispettivamente mediante codice MATLAB 'avg_nanobar_quantification'. Le dimensioni dei ROI delle nanobarre vengono regolate in base alla dimensione delle nanobarre utilizzando il file "posizione".
  6. Dividere le intensità proteiche per le intensità lipidiche estratte dal codice MATLAB 'avg_nanobar_quantification' nell'area bar-end per ottenere la densità nanobar-end che esclude l'effetto area superficiale.
  7. Tracciare la densità dell'estremità della nanobarra con diverse concentrazioni in GraphPad Prism per ottenere la curva di legame. Aprire il menu Analizza . Scegliere Regressione non lineare (adattamento alla curva) > Binding - Saturazione > Binding specifico con funzione di pendenza di Hill per adattare la curva all'equazione di Hill e quindi calcolare il valore del coefficiente KD e Hill.
  8. Le intensità lipidiche e proteiche sono normalizzate alle loro intensità corrispondenti al centro dei nanobar a 600 nm acquisite nella stessa immagine utilizzando il codice MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
  9. Utilizzare i nove pixel più luminosi di intensità proteiche normalizzate nell'area di estremità della nanobarra divisa per l'area del centro della barra per quantificare il rilevamento della curvatura della proteina con nanobar delle stesse dimensioni, il valore è chiamato "rapporto end-to-center". Utilizzare il rapporto tra l'intensità proteica normalizzata per normalizzare l'intensità lipidica per quantificare l'intervallo di rilevamento della curvatura proteica con nanobar di dimensioni diverse, il valore è denominato "Normalized Nanobar-End Density". Questi valori sono calcolati dal codice MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
  10. Caricare l'immagine dello stack FRAP nel software Fiji. Scegli l'area FRAP e genera un ROI. Scegliere la funzione Più > Multimisura per misurare l'intensità dell'area FRAP per ogni volta. Tracciare l'intensità in GraphPad Prism per generare la curva di recupero FRAP.

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Representative Results

Il design Nanobar è raccomandato per sondare le proteine sensibili alla curvatura positiva, che contiene un semicerchio a ciascuna estremità con curvatura definita dalla larghezza della nanobarra e un controllo della curvatura piatta / zero localmente al centro (Figura 2A, B). La formazione riuscita dell'SLB sui nanobar si traduce in segnali di marcatori lipidici uniformemente distribuiti su tutta la superficie dei nanobar, come mostrato nella Figura 2C. I segnali provenienti da più nanobar possono essere combinati facendo la media delle singole immagini di nanobar (Figura 2D) in modo da ridurre al minimo le variazioni casuali tra diversi nanobar. Un precedente studio di microscopia elettronica ha dimostrato che la membrana plasmatica cellulare ha formato un rivestimento conforme attorno all'intera nanostruttura24. Pertanto, si ritiene che il doppio strato lipidico sintetico si attacchi saldamente anche sulla superficie della nanostruttura, il che fornisce linee limitate alla diffrazione sulla nanobarra di 200 nm come osservato nella Figura 4E. Inoltre, la fluidità della membrana sull'SLB curvato a nanobar può anche essere caratterizzata dal saggio FRAP, in cui il segnale fluorescente su una singola nanobarra può essere sbiancato individualmente per la caratterizzazione della fluidità della membrana (Figura 2E,F).

La formazione dell'SLB su nanobar richiede la generazione di SUV in modo simile alla formazione di SLB su superfici piane come riportato in precedenza17. La composizione lipidica dei SUV determina la chimica superficiale dell'SLB curvato a nanobarre che può essere modificata per l'etichettatura della membrana e diversi meccanismi di legame proteico. Ad esempio, Texas Red DHPE può essere aggiunto in ~ 0,5 mol% nei SUV in modo che l'arricchimento della superficie della membrana su nanobar possa essere facilmente visualizzato mediante microscopia a fluorescenza (Figura 2C). Oltre alla visualizzazione, la composizione lipidica può anche essere modificata per facilitare il legame proteico su SLB curvati a nanobar. Ad esempio, per facilitare l'ancoraggio delle proteine marcate con His, l'acido nichel-nitrilotriacetico (Ni-NTA) può essere portato all'SLB sulle nanobarre incorporando 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-ammino-1-carbossipentil) acido iminodiacetico) succinil] (sale di nichel) (18:1 DGS-NTA(Ni)) nei SUV (~1 mol%)25. Senza questo gruppo funzionale sui lipidi, la proteina di fluorescenza verde (GFP) non può legarsi all'SLB con PS caricato negativamente, risultando in un foro a forma di barra più scuro in ogni posizione di nanobar a causa dell'esaurimento volumetrico dei segnali GFP nella soluzione (Figura 2G). In confronto, aggiungendo 1 mol% 18:1 DGS-NTA(Ni) nell'SLB, la GFP marcata con His-tag può ancorarsi fortemente sulla membrana per seguire chiaramente la forma SLB curva da nanobar (Figura 2H). La diffusione lipidica non ha mostrato una differenza rilevabile sul legame proteico come sondato dal saggio FRAP (Figura supplementare 1). Vale la pena notare che la misurazione del FRAP si basa solo sull'intensità dello 0,5% di DHPE rosso del Texas nell'SLB, che potrebbe non rappresentare l'1 mol% DGS-NTA(Ni) utilizzato per il legame della proteina His-tag. Inoltre, i lipidi carichi come il PS possono migliorare il legame proteico attraverso l'interazione elettrostatica26, mentre i lipidi di segnalazione come il fosfatidilinositolo (4,5)-bisfosfato (PIP2) possono anche essere integrati nei SUV per facilitare il legame proteico specifico (ad esempio, FCHo2, per il quale PIP2 è essenziale per il suo rilevamento della curvatura della membrana27).

La qualità della formazione di SLB in termini di uniformità superficiale e fluidità della membrana è fondamentale per sondare la capacità di rilevamento della curvatura proteica sui nanobar. Ci sono tre problemi tipici che possono compromettere l'uniformità e la fluidità di SLB. Uno è il legame dei SUV in eccesso sulla SLB a causa di un lavaggio inefficiente che genera puncta sia sulle nanobar che sulla membrana piatta tra le nanobarre (Figura 3A,B). Influisce in modo significativo sulla quantificazione del legame proteico su superfici curve o piane su nanobar per la valutazione del rilevamento della curvatura. Un altro problema è l'introduzione inaspettata di bolle d'aria all'interno della camera PDMS durante la fase di lavaggio, che possono distruggere l'SLB lungo la traiettoria dell'interfaccia aria-liquido e lasciare caratteristiche simili a graffi facilmente identificabili con segnali lipidici estremamente bassi sulla superficie del nanobar (Figura 3C, D). Inoltre, substrati nanobar puliti in modo improprio lasciano residui chimici distribuiti casualmente sulla superficie che impediscono l'adsorbimento lipidico per la formazione di SLB. Porta alla generazione di difetti di membrana che possono o meno essere al di sopra della risoluzione ottica per la visualizzazione al microscopio (Figura 3E). Tuttavia, la fluidità della membrana sarà sensibilmente influenzata dalla formazione di difetti di membrana28 in modo che il saggio FRAP possa essere utilizzato per verificare la pulizia della superficie (Figura 3F,G).

Per dimostrare la caratterizzazione della proteina di rilevamento della curvatura utilizzando nanobar array, il tipico dominio F-BAR viene confrontato con una regione intrinsecamente disordinata recentemente identificata in FBP17 (IDRFBP17). F-BAR è marcato in modo fluorescente con coloranti estere tetrafluorofenilico Alexa Fluor 488 mentre IDRFBP17 è etichettato con Alexa Fluor 647 C2 Maleimide. Come mostrato nella Figura 4A, entrambi i domini proteici mostrano un maggiore accumulo su singole nanobarre rivestite di SLB con larghezza di 300 nm. Qui, l'SLB contiene il 10% di PS per migliorare elettrostaticamente il legame proteico. La capacità di rilevamento della curvatura della proteina può essere identificata dall'arricchimento preferenziale alle estremità della nanobarra curva con un'intensità fluorescente più elevata rispetto ai segnali ai centri piatti dei nanobar, che è più evidente dopo la media dell'immagine da più di 100 nanobar (Figura 4B). La capacità di rilevamento della curvatura può essere riflessa quantitativamente calcolando il rapporto end-to-center su ciascun nanobar (cioè l'intensità della fluorescenza all'estremità della nanobarra rispetto al centro della nanobarra). Come mostrato nella Figura 4C, entrambe le proteine hanno un rapporto end-to-center più elevato rispetto ai lipidi, che è di circa 1. Confrontando IDR FBP17 e F-BAR, si può vedere che il rapporto end-to-center più elevato di IDRFBP17 (1,385 ±0,011, media ± SEM) indica un rilevamento della curvatura più forte rispetto a F-BAR (1,144 ± 0,004, media ± SEM).

Per esaminare la gamma di curvature che possono essere rilevate dalle proteine, l'SLB viene generato su array di nanobar con larghezze di gradiente da 200 nm a 600 nm (Figura 4D) dove i lipidi hanno mostrato un rivestimento omogeneo su nanobar di dimensioni diverse (Figura 4E). Tre proteine (IDR FBP17, F-BAR e F-BAR+IDRFBP17) sono incubate sull'array di nanobar a gradiente, e tutte hanno mostrato un accumulo preferenziale nei siti di membrana curva dell'estremità della nanobarra quando la curvatura è diminuita al di sotto di 400 nm di diametro (Figura 4E, F). Tra questi tre domini proteici, IDRFBP17 fornisce la più alta densità di nanobar-end, indicando la sua più forte capacità di rilevamento della curvatura, mentre F-BAR mostra il valore più basso (Figura 4F). Inoltre, la curva di legame della proteina sensibile alla curvatura può anche essere tracciata aumentando gradualmente la concentrazione proteica (Figura 4G), il che mostra che IDRFBP17 ha una forte capacità cooperativa di rilevamento della curvatura. Quando si adattano le sue curve di legame all'equazione di Hill, il KD si trova nell'intervallo μM (0,6 ± 0,1 μM) e il coefficiente di Hill (H) è compreso tra 2 e 3, suggerendo un legame ultrasensibile di IDRFBP17 alle curvature di membrana indotte da nanobar. Più nitida è la curvatura, maggiore è la capacità di legame all'equilibrio.

La diffusione dinamica della membrana e l'associazione di membrana delle proteine sensibili alla curvatura attorno ai siti SLB a forma di nanobar possono anche essere studiate da FRAP. Rispetto al rapido recupero dei segnali lipidici sui nanobar (Figura 5A,E), l'F-BAR non è riuscito a recuperare entro 2 minuti (Figura 5B,E), suggerendo la sua mobilità di membrana significativamente ridotta e la dinamica di associazione nei siti curvi della membrana. Sorprendentemente, a differenza del comportamento di F-BAR, il segnale IDR FBP17 ha mostrato un evidente recupero nello stesso lasso di tempo (Figura 5C, E), indicando la natura dinamica di IDRFBP17 accumulata sulle membrane curve. Tuttavia, dopo aver lavato via l'IDR FBP17 non legato nella soluzione, non è stato possibile osservare lo stesso recupero nel canale IDRFBP17 di prima (Figura 5D,E). Indica che il recupero è dominato dallo scambio con le molecole IDRFBP17 contenenti soluzione e meno dalla diffusione laterale delle molecole legate alla membrana.

Nel complesso, questi risultati dimostrano che questo sistema nanobar-SLB è un potente strumento per caratterizzare le proteine sensibili alla curvatura di membrana in vitro.

Figure 1
Figura 1: Illustrazione del sistema nanobar-SLB . (A) La camera PDMS è costituita dagli strati superiore e intermedio con il nanochip pulito assemblato su di esso. (B) I SUV etichettati Texas Red DHPE con dettagli ingranditi. (C) Il modello intatto del sistema nanobar-SLB e l'area di zoom illustrano che l'SLB si forma su nanobar con un singolo strato uniforme del doppio strato lipidico. (D) Processo di imaging e caratterizzazione al microscopio confocale a scansione laser. (E) Pulizia del nanochip per un ulteriore riutilizzo. (F) Elaborazione di immagini per la quantificazione del rilevamento della curvatura proteica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: La formazione dell'SLB curvo su nanobar con legame proteico . (A) Immagine SEM di un singolo nanobar. (B) Rappresentazione schematica del sistema nanobar-SLB. (C) Immagini fluorescenti dell'SLB etichettate con Texas Red DHPE sul nanochip. (D) Immagine media della distribuzione SLB su nanobar (in alto) e un grafico della superficie 3D dell'immagine media (in basso). Questa figura è stata modificata da Su et al.22 e riprodotta con il permesso. (E) Imaging time-lapse del FRAP SLB sulla nanobarra. La regione di sbiancamento è indicata da un cerchio tratteggiato giallo. (F) Grafico normalizzato dell'intensità dei nanobar mediante misurazione FRAP. (G) La rappresentazione schematica della GFP non può essere collegata all'SLB con 10 mol% di carica negativa PS (a sinistra) e un'immagine rappresentativa corrispondente a destra. (H) Rappresentazione schematica del tag His-etichettato GFP legato all'SLB con 1 mol% DGS-NTA(Ni) (a sinistra) e un'immagine rappresentativa corrispondente a destra. Barre di scala: 2 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Problemi tipici che compromettono la qualità dell'SLB . (A) Schema della preparazione SLB senza lavaggio efficiente. (B) Immagine rappresentativa della SLB legata ai SUV in eccesso. Le frecce gialle mostrano i puncta quali sono i SUV in eccesso sulla superficie SLB. (C) Schema della preparazione di SLB con bolle d'aria iniettate. (D) Immagine rappresentativa di SLB distrutta dalla traiettoria dell'interfaccia aria-liquido. La freccia gialla mostra l'SLB incompleto sul substrato. (E) Schema della preparazione di SLB con substrati nanobar non puliti. L'area di zoom mostra un doppio strato lipidico discontinuo a causa dei residui superficiali che impediscono l'adsorbimento lipidico. (F) Imaging time-lapse dell'analisi FRAP SLB su substrati nanobar non puliti. La regione di sbiancamento è indicata da un cerchio tratteggiato giallo. (G) Grafico normalizzato dell'intensità dei nanobar mediante misurazione FRAP. Barre di scala: 2 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Caratterizzazione del rilevamento della curvatura delle proteine mediante il sistema nanobar-SLB. (A) Le immagini fluorescenti di F-BAR (a sinistra) e IDRFBP17 (a destra) si accumulano su nanobar rivestiti di SLB (10% PS e 90% PC). Barra della scala: 2 μm. (B) Le immagini medie di F-BAR (in alto a sinistra) e IDRFBP17 (in basso a sinistra) si accumulano su nanobar e corrispondenti grafici di superficie 3D (rispettivamente in alto a destra e in basso a destra). Barra della scala: 2 μm. (C) Rapporto end-to-center del doppio strato lipidico, F-BAR e IDRFBP17 intensità di fluorescenza intorno alla nanobar di larghezza 300 nm. Un t-test di Welch è stato eseguito per l'analisi statistica. p < 0,0001. (n = 3) (D) Immagine SEM di array di nanobarre a gradiente con larghezze da 200 nm a 600 nm. Barra della scala: 5 μm. (E) Annotazione del costrutto proteico (in alto), immagini medie del doppio strato lipidico, distribuzione IDR FBP17, F-BAR e F-BAR+IDRFBP17 su nanobarre di gradiente con larghezza compresa tra 200 nm e 600 nm (al centro) e profili di intensità lungo le nanobarre di ciascuna immagine media (in basso). Barra di scala: 2 μm. (F) IDR FBP17, F-BAR e F-BAR + IDRFBP17 hanno normalizzato la densità di estremità delle nanobarre quantificata rispettivamente con diverse larghezze di nanobar. Ogni dato è indicato come media ± SEM (n ≥ 60). (G) La curva di legame di IDRFBP17 dotata dell'equazione di Hill. Ogni dato è indicato come media ± SEM (n = 3). Questa figura è stata modificata da Su et al.22 e riprodotta con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: La dinamica di legame della membrana delle proteine sensibili alla curvatura attorno alla nanobarra. (A-D) Imaging time-lapse dell'analisi FRAP a doppio strato lipidico (A), F-BAR (B), IDR FBP17 (C) e IDRFBP17 lavato (D) sulla nanobarra. La regione di sbiancamento è indicata da un cerchio tratteggiato rosso. Barra di scala: 5 μm. (E) Grafico normalizzato dell'intensità dei nanobar mediante misurazione FRAP. Questa figura è stata modificata da Su et al.22 e riprodotta con il permesso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Diffusione della membrana prima e dopo l'aggiunta di proteine. (A) Imaging time-lapse del test FRAP sul doppio strato lipidico POPC con 1 mol% 18:1 DGS-NTA(Ni) e 0,5 mol% Texas Red DHPE attorno alla nanobarra prima (in alto) e dopo (in basso) aggiungendo la proteina GFP-His 18:1. La regione di sbiancamento è indicata da un cerchio tratteggiato giallo. (B) Grafico normalizzato dell'intensità dei nanobar mediante misurazione FRAP. Barre scala: 2 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il sistema nanobar-SLB qui descritto offre una combinazione unica dei vantaggi in diversi saggi in vitro esistenti. Rivela in modo efficiente il legame preferenziale delle proteine a membrane altamente curve come il test di galleggiamento o sedimentazione dei liposomi, ma richiede molti meno campioni e offre una curvatura definita con maggiore precisione su singole nanobarre 8,29. Offre inoltre una vasta gamma di curvature controllate con precisione per il confronto simultaneo come il saggio SLiC, con meno preoccupazione per il cambiamento della composizione lipidica in diverse curvature e cambiamenti morfologici o di curvatura non rilevabili con dimensioni inferiori al limite di diffrazione della luce, poiché l'SLB è mobile e copre continuamente tutte le dimensioni dei nanobar30 . Nanobar-SLB consente anche l'osservazione dei comportamenti dinamici delle proteine sulla membrana curva come i saggi di tither-pulling, ma non limitato dal throughput della generazione del tubo e dall'esperienza nella manipolazione dell'intrappolamento ottico13. Sebbene il test SMrT generi tubi di membrana ad alto rendimento, la curvatura della membrana varia lungo il nanotubo, il che rende più difficile studiare la sensibilità alla curvatura delle proteine16. Ancora più interessante, rispetto ad altri sistemi basati su SLB sul substrato modellato18,19,20,27, il nanobar-SLB fornisce un centro barra piatta accanto alla curvatura definita all'estremità della barra, che funge efficacemente da controllo locale della curvatura zero per ridurre al minimo l'impatto delle variazioni di densità superficiale sull'analisi quantitativa. La possibilità di personalizzare le combinazioni di curvature utilizzando la litografia a fascio di elettroni ad alta risoluzione può generare non solo controlli locali di curvatura zero, ma anche curvature positive e negative, come dimostrato in precedenza negli studi sulle cellule vive2.

Ci sono potenziali limitazioni che vale la pena notare quando si utilizza questo metodo. In primo luogo, la nanofabbricazione sul chip è una procedura relativamente complessa, con strutture per camere bianche e attrezzature specializzate necessarie (in particolare, un E-beam writer). Questo costo elevato ci ha portato a riutilizzare il chip; ciò si traduce in un tempo più lungo dedicato alla pulizia della superficie del chip e all'assemblaggio del chip con PDMS rispetto all'uso una tantum. La disponibilità del nanochip è un altro tipo di limitazione. Un funzionamento improprio quando si utilizza il chip, come rivolto verso la superficie verso il banco, può causare l'attrito della nanostruttura, specialmente per le strutture ad alto rapporto di aspetto. Inoltre, il doppio strato lipidico formato sul substrato è una membrana continua; La tensione può facilmente propagarsi ovunque. Per gli studi che richiedono la manipolazione della tensione della membrana, tecniche come il cavo tirato dai GUV tramite il sistema di micropipette collegato forniscono soluzioni più convenienti10.

Per ottenere risultati ottimali, anche i seguenti passaggi sono fondamentali. (i) La dimensione della vescicola è critica per la formazione di SLB31,32. La letteratura precedente mostra una maggiore propensione alla fusione per vescicole di dimensioni più piccole (< 90 nm) rispetto alle dimensioni più grandi utilizzando un test di microbilancia a cristalli di quarzo con dissipazione (QCM-D)32. Pertanto, rispetto ai LUV di 300 nm, i diametri di ~ 50 nm saranno più facili per la formazione di SLB. Considerando questo problema, sono necessarie almeno 20 volte in entrambe le fasi di congelamento-disgelo ed estrusione per formare SUV omogenei per la formazione di SLB. Il test FRAP è anche necessario in ogni esperimento per convalidare la mobilità della membrana. ii) Durante la preparazione dei SUV, tutte le attrezzature devono essere mantenute pulite per evitare la contaminazione di piccole particelle simili alla polvere. Soprattutto per il mini-estrusore, gli aghi sono facilmente ostruiti in un ambiente sporco. iii) Per preparare SUV di buona qualità, il cloroformio nella miscela lipidica deve essere completamente rimosso per evitare di distruggere le vescicole lipidiche. (iv) La pulizia al plasma del chip deve essere effettuata di fresco prima della formazione di SLB per garantire una superficie altamente idrofila per un'efficiente rottura del SUV per formare un doppio strato continuo. L'esposizione prolungata nell'ambiente dopo il trattamento al plasma può causare un legame non specifico di particelle di polvere o residui organici alla superficie del truciolo, compromettendo l'idrofilia della superficie. (v) Per assemblare la camera PDMS per la formazione di SLB e l'incubazione delle proteine, la pulizia e la planarità di ciascun pezzo PDMS sono importanti per garantire una buona tenuta del canale fluidico. Qualsiasi perdita della camera può causare l'essiccazione dell'SLB o modificare la concentrazione proteica. (vi) La regolazione della messa a fuoco dell'imaging è fondamentale per garantire una misurazione costante dell'intensità, poiché l'altezza della nanobarra (600 nm) è paragonabile alla profondità focale della microscopia confocale a scansione laser nell'asse z33. La messa a fuoco deve essere regolata nuovamente ogni volta che l'array si sposta orizzontalmente per mantenere la nitidezza dei bordi delle nanobarre nelle immagini.

Soprattutto, il sistema nanobar-SLB introdotto qui fornisce un potente metodo per studiare le proteine sensibili alla curvatura di membrana. Vari parametri che influenzano l'interazione proteica con la membrana curva possono essere studiati quantitativamente attraverso una gamma di curvature, come domini sensibili alla curvatura (ad esempio, dominio BAR ed elica anfifilica) della proteina 8,30, composizione lipidica (ad esempio, PS e PIP2) della membrana27,34, pH, forza ionica e temperatura dell'ambiente35,36 , così come l'interazione proteina-proteina per la formazione di complessi (ad esempio, CHMP2B e CHMP2A potrebbero contribuire in modo diverso ai processi di rimodellamento della membrana catalizzata da ESCRT-III)37,38. Gli studi dinamici possono anche essere condotti utilizzando il sistema nanobar-SLB per sondare la cinetica di legame della membrana 11, la diffusione o l'assemblaggio della proteina di membrana39, così come le reazioni enzimatiche40 o la separazione di fase comportante 13,41,42. Inoltre, il doppio strato lipidico artificiale è generalmente considerato simmetrico con ogni monostrato lipidico contenente la stessa composizione lipidica, che è molto diversa dalla membrana cellulare viva43. L'induzione di un doppio strato di asimmetria per imitare meglio la membrana plasmatica può essere ottenuta cambiando il materiale della superficie, la condizione del tampone, la composizione lipidica o la temperatura44,45,46,47. È di grande valore verificare se un doppio strato asimmetrico può essere formato sul sistema nanobar-SLB per studiare il comportamento delle proteine sulla membrana curva, che merita ulteriori studi.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrente in quest'opera.

Acknowledgments

Ringraziamo il Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) e il Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) della Nanyang Technological University (NTU) per aver supportato la fabbricazione di nanostrutture e l'imaging SEM, la Protein Production Platform (PPP) presso la School of Biological Sciences NTU per la purificazione delle proteine e la School of Chemical and Biomedical Engineering NTU per il microscopio confocale. Questo lavoro è finanziato dal Ministero della Pubblica Istruzione di Singapore (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 e MOE-T2EP30220-0009), dall'Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) supportato dal finanziamento MOE nell'ambito del programma Research Centres of Excellence (W. Zhao), dalla Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), dalla NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU per la borsa di studio di ricerca (X. Miao) e China Scholarship Council per la borsa di studio di ricerca (J. Wu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in <em>vitro</em> di proteine sensibili alla curvatura di membrana
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Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A… More

Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).

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