Summary
Aqui, um sistema de bicamada lipídica suportado por nanobar é desenvolvido para fornecer uma membrana sintética com uma curvatura definida que permite a caracterização de proteínas com capacidade de detecção de curvatura in vitro.
Abstract
A curvatura da membrana desempenha papéis importantes em vários processos essenciais das células, como migração celular, divisão celular e tráfico de vesículas. Não é apenas gerado passivamente por atividades celulares, mas também regula ativamente as interações proteicas e está envolvido em muitas sinalizações intracelulares. Assim, é de grande valor examinar o papel da curvatura da membrana na regulação da distribuição e dinâmica de proteínas e lipídios. Recentemente, muitas técnicas foram desenvolvidas para estudar a relação entre a membrana curva e a proteína in vitro. Em comparação com as técnicas tradicionais, a recém-desenvolvida bicamada lipídica suportada por nanobarras (SLB) oferece alto rendimento e melhor precisão na geração de curvatura de membrana, formando uma bicamada lipídica contínua em matrizes padronizadas de nanobarras com uma curvatura de membrana pré-definida e controle plano local. Tanto a fluidez lipídica quanto a sensibilidade proteica a membranas curvas podem ser quantitativamente caracterizadas usando microscopia de fluorescência. Aqui, um procedimento detalhado sobre como formar um SLB em superfícies de vidro fabricadas contendo matrizes de nanobarras e a caracterização de proteínas sensíveis à curvatura em tal SLB são introduzidos. Além disso, os protocolos para reutilização de nanochips e processamento de imagens são cobertos. Além do nanobar-SLB, este protocolo é prontamente aplicável a todos os tipos de chips de vidro nanoestruturados para estudos de detecção de curvatura.
Introduction
A curvatura da membrana é um parâmetro físico crítico de uma célula que ocorre em uma variedade de processos celulares, como morfogênese, divisão celular e migração celular1. É amplamente reconhecido agora que a curvatura da membrana está além de um simples resultado de eventos celulares; em vez disso, emergiu como um regulador eficaz das interações proteicas e da sinalização intracelular. Por exemplo, várias proteínas envolvidas na endocitose mediada por clatrina se ligam preferencialmente à membrana curva, resultando na formação de um hotspot para endocitose2. Existem muitas causas diferentes de deformação da membrana, como a tração da membrana pelas forças do citoesqueleto, a presença de assimetria lipídica com grupos de cabeça de diferentes tamanhos, a existência de proteínas transmembranares com forma cônica, o acúmulo de proteínas modeladoras de membrana, como proteínas do domínio BAR (nomeadas após as proteínas Bin, anfifisina e Rvs) e a inserção do domínio das hélices anfipáticas na membrana1 . Curiosamente, essas proteínas e lipídios não apenas deformam a membrana, mas também podem sentir a curvatura da membrana e exibir acúmulo preferencial1. Portanto, é crucial estudar se e como membranas com diferentes curvaturas alteram a distribuição e a dinâmica de proteínas e lipídios ligados a elas e os impactos potenciais nos processos intracelulares relacionados.
Muitas técnicas foram desenvolvidas para analisar a interação entre membrana curva e proteínas em sistemas celulares vivos e in vitro. O sistema celular vivo proporciona um ambiente celular real com rica diversidade lipídica e regulação dinâmica da sinalização proteica 2,3,4,5,6,7. No entanto, um sistema tão sofisticado é difícil de estudar devido às incertezas e flutuações no ambiente intracelular. Assim, os ensaios in vitro utilizando uma membrana artificial composta por espécies lipídicas conhecidas e proteínas purificadas tornaram-se poderosos sistemas de reconstituição para caracterizar a relação entre proteínas e membranas curvas. Tradicionalmente, lipossomas de diferentes diâmetros são gerados por extrusão para detectar proteínas sensíveis à curvatura por meio de um ensaio de co-sedimentação usando força centrífuga ou um ensaio de co-flotação com um gradiente de densidade para evitar a agregação de proteínas 8,9. No entanto, a curvatura dos lipossomas extrudados é limitada pelo tamanho dos poros disponíveis do filtro de membrana utilizado na extrusora10. Está comprovado que o ensaio de curvatura de lipossomo único (SLiC) supera essa limitação, no qual lipossomas com diferentes diâmetros são marcados com fluorescência e imobilizados na superfície para que a curvatura possa ser marcada pela intensidade fluorescente11. Entretanto, tem sido observada forte variabilidade na composição lipídica em pequenas vesículas, o que afeta a acurácia da medida da curvatura12. Experimentos de puxar amarração fornecem uma medida mais precisa da curvatura na corda transitória puxada de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) usando um tweezer óptico, onde a curvatura pode ser bem controlada pela tensão da membrana gerada13,14. Este método é adequado para estudar proteínas de detecção de curvatura positiva ou negativa, mas é limitado pelo rendimento da geração de tubos10. O ensaio de tubos de membrana suportados (SMrT) permite a geração simultânea de múltiplos tubos de membrana que são extrudados do mesmo reservatório lipídico por fluxos microfluídicos. No entanto, a curvatura da membrana varia intrinsecamente ao longo do nanotubo, o que compromete a precisão da medida da curvatura baseada na intensidade de fluorescência15,16. Em comparação, a utilização de pequenas vesículas unilamelares (SUVs, diâmetro <100 nm17) para formar uma bicamada lipídica suportada (SLB) em superfícies contendo topografias projetadas gerou uma única membrana bicamada com curvaturas predeterminadas por nanofabricação ou nanomateriais em alta precisão18,19,20.
Aqui, apresentamos um protocolo para a formação do SLB em superfícies de nanochips fabricadas com matrizes de nanobarras e como ele pode ser usado para sondar a sensibilidade à curvatura de proteínas in vitro. Como mostra a Figura 1, existem seis componentes essenciais do ensaio: A) Limpeza e montagem do chip com câmara microfluídica; B) Preparação de SUVs com composição lipídica definida; C) Formação do SLB em nanochip e ligação com proteínas sensíveis à curvatura; D) Imagem e caracterização do SLB e proteínas sensíveis à curvatura sob microscopia de fluorescência; E) Limpeza do chip para reutilização; F) Processamento de imagens para análise quantitativa da capacidade de detecção da curvatura de proteínas. O protocolo detalhado é descrito passo a passo abaixo.
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Protocol
1. Limpeza de nanochip
- Coloque o nanochip em um copo de 10 mL com o lado padronizado voltado para cima.
NOTA: Este nanochip de quartzo foi fabricado através de litografia por feixe de elétrons, conforme descrito antesdo 21. A geometria e o arranjo da nanoestrutura no chip podem ser projetados sob medida. Os tamanhos das nanobarras de gradiente usadas aqui são de 2000 nm de comprimento, 600 nm de altura e 100 a 1000 nm de largura (conjunto de degraus de 100 nm). - Adicione cuidadosamente 1 mL de ácido sulfúrico a 98% ao copo e certifique-se de que o ácido cubra totalmente a frente e a parte traseira do chip.
NOTA: 98% de ácido sulfúrico é extremamente corrosivo e pode causar rápida destruição tecidual e queimaduras químicas graves em contato com a pele ou os olhos. Use-o no exaustor com proteção adequada. - Gire lentamente o copo e adicione 200 μL de 30% de peróxido de hidrogênio gota a gota até que todo o copo fique quente. Garantir que o ácido sulfúrico e o peróxido de hidrogênio estejam bem misturados para formar solução de piranha para a remoção de moléculas orgânicas do nanochip17. Existem técnicas alternativas para gerar o SLB em superfícies hidrofílicas limpas, como a luz UV e a exposição ao ozônio, conforme descrito anteriormente23.
NOTA: A reação é extremamente exotérmica e pode fazer com que a solução ferva, então adicione peróxido de hidrogênio ao ácido sulfúrico gota a gota e continue girando. - Coloque o copo em um recipiente de vidro secundário e mantenha o nanochip imerso na solução de piranha durante a noite para limpar bem as impurezas.
NOTA: Coloque o copo no exaustor sem qualquer cobertura, caso a reação possa gerar gás. - Retire o copo e pipete cuidadosamente a solução de piranha para um recipiente de resíduos ácidos.
- Carregar 5 mL de água deionizada no copo para diluir o ácido residual e descartá-lo nos resíduos ácidos. Repita este passo cinco vezes e use 5 M NaOH para neutralizar os resíduos ácidos.
- Pegue o chip com uma pinça e lave com um fluxo contínuo de água deionizada para remover completamente o ácido residual. Secar o cavaco com gás nitrogênio a 99,9% para formação de SLB22.
2. Geração de pequenas vesículas unilamelares (SUVs)
- Adicionar 100 μL de clorofórmio a um frasco para injetáveis de âmbar.
NOTA: O clorofórmio é um líquido altamente volátil e incolor, e pode ser tóxico se inalado ou engolido. Use-o no exaustor com a máscara e as luvas. - Dissolver 500 μg da mistura lipídica em clorofórmio. A composição da mistura lipídica usada aqui é de 89,5 mol% de fosfatidilcolinas de ovo (PC), 10 mol% de fosfatidilserina cerebral (PS) e 0,5 mol% de Texas Red 1,2-dihexadecanoil-sn-glycero-3-fosfoethanolamine, sal de trietilamônio (Texas Red DHPE).
- Seque a mistura lipídica no frasco para injetáveis com 99,9% de gás azoto até que o clorofórmio esteja volatilizado e a mistura lipídica esteja seca.
NOTA: Esta etapa deve ser executada no exaustor. Evite respingos líquidos durante a secagem por sopro. - Coloque a mistura lipídica presente no frasco para injetáveis de âmbar sem a tampa no dessecador a vácuo coberto de folha de alumínio. Em seguida, seque a amostra a vácuo com uma bomba por 3 h para volatilizar completamente o clorofórmio.
- Adicione 250 μL de tampão salino tamponada com fosfato (PBS) ao frasco para injetáveis. Vórtice a solução até que fique homogênea.
NOTA: O tampão PBS consiste em 150 mM de NaCl, sem cálcio, magnésio e vermelho de fenol; o pH é ajustado para 7,2 para fazer a bicamada lipídica PC e PS. - Sonicate a mistura lipídica por 30 min a uma frequência de 50 kHz em um sonicator de banho. Em seguida, transfira a mistura lipídica para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e lacre com parafilme.
- Congelar a mistura lipídica em azoto líquido durante 20 s e depois descongelar a 42 °C durante 2 minutos em banho-maria. Repita os ciclos de congelamento-descongelamento 30 vezes. Depois disso, a mistura lipídica parece um líquido claro.
CUIDADO: O nitrogênio líquido tem um ponto de ebulição de cerca de -195,8 °C. Pode causar congelamento ou queimaduras criogênicas. Use-o no espaço não confinado com luvas de isolamento térmico. - Enxaguar duas seringas de vidro à prova de gás e o conector da miniextrusora com etanol, clorofórmio e metanol, respectivamente. Repita a sequência de enxaguamento cinco vezes para pré-limpar o aparelho. Deixe-os no exaustor até que o solvente orgânico esteja completamente volatilizado.
- Monte o aparelho de miniextrusora e passe 500 μL de tampão PBS através do conector para pré-molhar o aparelho, em seguida, descarte o tampão de outra seringa. Esta etapa remove as impurezas e facilita a extrusão.
- Monte o aparelho miniextrusora com uma membrana filtrante de policarbonato de 100 nm.
NOTA: O tamanho dos poros da membrana filtrante determina o diâmetro dos lipossomas. - Tomar 500 μL de tampão PBS com uma das seringas e empurrá-lo suavemente através do filtro para encher a segunda seringa vazia na outra extremidade. Repetir a extrusão para frente e para trás três vezes para verificar a fuga do aparelho e eliminar o tampão da segunda seringa.
- Passe a mistura lipídica através da mini extrusora para substituir o tampão PBS. Em seguida, extruda para frente e para trás 20 vezes para formar SUVs. O caráter multilamelar das vesículas pode ser mantido com número insuficiente de tempos de extrusão, o que afetará a formação de SLB23.
- Recolha os SUV da segunda seringa para reduzir a contaminação com partículas maiores e transfira-os para um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
NOTA: Remova a seringa diretamente do conector caso a seringa se rompa. - Envolva o tubo com papel alumínio para evitar o branqueamento de lípidos marcados com fluorescência e guarde-os a 4 °C. Normalmente, os SUVs podem ser armazenados por até 7 dias.
3. Formação do SLB em um nanochip
- Retire cuidadosamente o nanochip limpo da água desionizada com um par de pinças e seque a seco com gás nitrogênio a 99,9%.
- Realizar a limpeza da superfície do nanochip com tratamento com plasma de ar por 1 h.
- Monte o nanochip em uma câmara de polidimetilsiloxano (PDMS), que consiste em duas peças de PDMS-a PDMS médio e um PDMS superior (Figura 1A). O PDMS médio é fino (~0,5 mm) com uma grande abertura oval no centro para garantir exposição suficiente ao padrão nanobar. O PDMS superior é espesso (~ 4,0 mm) com dois pequenos orifícios dentro da grande abertura oval como uma entrada e uma saída para manuseio de líquidos.
- Coloque o chip em uma superfície limpa com o padrão voltado para cima.
- Cubra suavemente o PDMS médio com o chip e certifique-se de que todo o padrão esteja exposto à área central da grande abertura oval no PDMS médio.
- Cubra o PDMS superior com o PDMS médio e mantenha seus dois pequenos orifícios dentro da região do grande orifício oval do PDMS médio. Em seguida, a câmara PDMS é montada.
NOTA: PDMS é o polímero orgânico à base de silício mais utilizado. É biocompatível, transparente, bem como deformável para ser projetado como uma forma personalizada para montagem de chips e imagem sob o microscópio. Mais importante ainda, ele pode ser covalentemente preso a outra camada PDMS ou vidro firmemente após o tratamento com plasma, tornando-o adequado como a câmara para preparar o SLB. Esta etapa garante que cada camada de PDMS seja bem ajustada para evitar lacunas e vazamentos.
- Carregue os SUVs na câmara PDMS a partir de um dos dois pequenos orifícios no PDMS superior com uma pipeta e incube por 15 minutos à temperatura ambiente para formar o SLB.
- Pipete suavemente o tampão PBS para a câmara PDMS de um lado do pequeno orifício e remova os resíduos com um cotonete do outro orifício para lavar os SUVs não ligados. Em seguida, adquira o SLB formado no nanochip (a qualidade do SLB é testada pela recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP), conforme mostrado na etapa 4.4 e discutido na seção de resultados representativos).
NOTA: Ao canalizar o tampão PBS para a câmara, a ponta da pipeta deve estar cheia do tampão e em contato com a superfície do líquido para evitar a injeção de bolhas.
4. Obtenção de imagens do SLB e da ligação de proteínas de detecção de curvatura no nanochip
NOTA: Esta seção dependerá do sistema de microscópio disponível para o experimento. Aqui, uma diretriz geral sobre como realizar a imagem será descrita. As configurações detalhadas podem ser alteradas entre as diferentes configurações de microscópio.
- Configure a microscopia confocal de varredura a laser usando uma objetiva de óleo de 100x (N.A.1.4). Abra o software ZEN para selecionar a potência do laser de excitação que pode excitar a fluorescência do lipídio e da proteína. Escolha o modo de aquisição > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.
- Ajuste o foco com o botão de foco para localizar as nanobarras no chip até que as bordas da nanobarra estejam afiadas sob o canal lipídico.
- Defina os parâmetros de varredura como abaixo para obter uma imagem de controle do canal lipídico antes de adicionar proteína: Tamanho do quadro = 512 px x 512 px (512 pixels x 512 pixels, um tamanho de pixel de 124 nm), Bits por pixel = 16 (profundidade de 16 bits), Velocidade de digitalização = 5 e Média = 4 (modo de média de quatro vezes / linha).
- Realizar o ensaio FRAP branqueando a bicamada lipídica marcada com fluorescência em uma única área de nanobar aleatória.
- Marque as caixas de seleção Regiões do experimento e branqueamento . Desenhe uma área circular de 5 μm de diâmetro que pode incluir toda a nanobarra no centro (o tamanho da nanobarra é de 2 μm) e adicione às Regiões do Experimento. Insira parâmetros de imagem de lapso de tempo como o exemplo a seguir: escolha Velocidade de varredura = 9 e Média = 1. Escolha Série Temporal > Duração = 100 ciclos e Intervalo = 2 s. Insira parâmetros de branqueamento como o exemplo a seguir: marque a caixa de seleção Iniciar após # imagens e escolha três imagens.
- Marque as caixas de seleção a laser que executam o FRAP e altere a energia para 100,0%. Clique em Iniciar Experimento para o experimento FRAP.
NOTA: O FRAAP é um método comum para caracterizar a mobilidade de moléculas celulares. Se o SLB tiver boa fluidez, a fluorescência na área branqueada se recuperará gradualmente à medida que os fluoróforos branqueados se difundirem e os fluoróforos não branqueados de outras áreas se difundirem.
- Carregar a solução proteica na câmara PDMS e incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente para permitir a ligação da proteína no SLB.
NOTA: As proteínas utilizadas na Figura 2G,H para demonstrar a composição lipídica facilitam a ligação de proteínas em SLBs curvados em nanobarras são 74 μM GFP e 79 μM GFP-His. Estas duas proteínas são proteínas de fluorescência verde sem ou com His-tag. As proteínas utilizadas para o estudo da detecção de curvatura na Figura 4 e na Figura 5 são 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 e 16 μM FBAR+IDRFBP17. Essas três proteínas são os domínios da FBP17, que é uma proteína BAR típica que é intuitivamente assumida como geradores de curvatura e sensores. Cada volume de proteína é de 20 μL. - Reoriente as nanobarras e repita a etapa 4.3 para tirar imagens dos canais lipídicos e proteicos para detecção de detecção de curvatura de proteínas.
- Repita a etapa 4.4 para conduzir o ensaio FRAP nos canais lipídico e proteico e realizar imagens de lapso de tempo para caracterizar a mobilidade da proteína de detecção de curvatura.
5. Reutilização de nanochips
- Pegue o nanochip com uma pinça e separe-o cuidadosamente da câmara PDMS em um copo de 50 mL cheio de água deionizada.
Observação : esta é uma etapa crítica. Evite que a pinça toque na nanoestrutura e não force o chip a se separar para evitar rachaduras. - Lave bem o nanochip com etanol anidro para remover os resíduos orgânicos ligados na superfície.
NOTA: Use papel de seda limpo para remover a água na superfície antes de lavar com etanol anidro.
CUIDADO: O etanol anidro é um produto químico altamente volátil e ligeiramente perigoso. Evite o contato com a pele e os olhos. Use-o no exaustor com a máscara e as luvas. - Lave bem o chip com muita água deionizada para remover o etanol residual. Em seguida, seque o chip com 99,9% de gás nitrogênio.
NOTA: É importante remover todos os vestígios de etanol no chip antes de prosseguir para a próxima etapa, porque o ácido piranha pode reagir violentamente com solvente orgânico e pode causar explosões. - Coloque o chip em um copo limpo de 10 mL com o lado do padrão voltado para cima e limpe o chip com solução de piranha para reutilização, que segue os mesmos passos da "limpeza do nanochip".
6. Quantificação da imagem
- Gire as imagens adquiridas por um microscópio para que a matriz de nanobarras esteja em uma posição vertical para análise subsequente no software de Fiji.
- Use um código MATLAB personalizado 'c_pillarmask_averaging' para localizar a nanobarra individual por uma máscara quadrada (51 pixels x 51 pixels) tanto no canal lipídico quanto no canal de proteínas.
NOTA: Este código MATLAB foi especialmente concebido para o nanochip. Ele pode ser obtido no GitHub através do link: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX. - Subtraia os sinais de fundo de cada imagem com os três ROIs (5 pixels x 5 pixels) nos cantos da imagem pela função de malha no código MATLAB 'BarGra_avg'. Esta operação visa corrigir potenciais ruídos de fundo irregulares causados pela configuração do microscópio ou nivelamento do chip no estágio do microscópio.
- Gere as imagens médias das nanobarras do mesmo tamanho usando o código MATLAB 'BarGra_avg', onde cada ponto é a média dos valores naquele ponto em todas as máscaras quadradas individuais de nanobar. Gere gráficos de superfície 3D das imagens médias no software de Fiji para mostrar a distribuição média do sinal em torno das nanobarras intuitivamente. Escolha Analisar Gráfico de Superfície > > Entrada 100 para Multiplicador de Polígonos e marque as caixas de seleção Sombra, Eixo de Desenho e Suavização.
- Segmente cada nanobar em três áreas, que incluem duas áreas de extremidade de nanobar e uma área de centro de nanobar para extrair suas intensidades de fluorescência, respectivamente, pelo código MATLAB 'avg_nanobar_quantification'. Os tamanhos dos ROIs de nanobarras são ajustados de acordo com a dimensão das nanobarras usando o arquivo de 'posição'.
- Divida as intensidades de proteína por intensidades lipídicas extraídas do código MATLAB 'avg_nanobar_quantification' na área da extremidade da barra para obter a densidade da extremidade da nanobarra que exclui o efeito da área de superfície.
- Plote a densidade da extremidade da nanobarra com diferentes concentrações no GraphPad Prism para obter a curva de ligação. Abra o menu Analisar . Escolha Regressão não linear (ajuste de curva) > Ligação - Saturação > Ligação específica com função de inclinação de Hill para ajustar a curva com a equação de Hill e, em seguida, calcular o valor do coeficiente KD e Hill.
- As intensidades lipídicas e proteicas são normalizadas para suas intensidades correspondentes no centro de nanobarras de 600 nm adquiridas na mesma imagem usando o código MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
- Use os nove pixels mais brilhantes de intensidades de proteína normalizadas na área da extremidade da nanobarra dividida pela área do centro da barra para quantificar a detecção da curvatura da proteína com nanobarras do mesmo tamanho, o valor é nomeado como "relação fim-a-centro". Use a proporção de intensidade de proteína normalizada para normalizar a intensidade lipídica para quantificar a faixa de detecção de curvatura de proteína com nanobarras de tamanhos diferentes, o valor é nomeado como "Densidade Final-Nanobar Normalizada". Esses valores são calculados pelo código MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
- Carregue a imagem da pilha FRAP no software Fiji. Escolha a área FRAP e gere um ROI. Escolha a função Mais > Multimedida para medir a intensidade da área FRAP para cada vez. Plote a intensidade no GraphPad Prism para gerar a curva de recuperação FRAP.
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Representative Results
O projeto de nanobar é recomendado para sondar proteínas de detecção de curvatura positiva, que contém um meio círculo em cada extremidade com curvatura definida pela largura da nanobarra e um controle de curvatura plana/zero localmente no centro (Figura 2A,B). A formação bem-sucedida do SLB em nanobarras resulta em sinais de marcadores lipídicos distribuídos uniformemente em toda a superfície do nanobar, como mostrado na Figura 2C. Os sinais de múltiplas nanobarras podem ser combinados pela média das imagens individuais de nanobarras (Figura 2D) para que as variações aleatórias entre diferentes nanobarras possam ser minimizadas. Um estudo anterior de microscopia eletrônica mostrou que a membrana plasmática celular formou revestimento conformacional em torno de todas as nanoestruturas24. Portanto, acredita-se que a bicamada lipídica sintética também se ligue firmemente à superfície da nanoestrutura, o que fornece linhas limitadas por difração na nanobarra de 200 nm, como observado na Figura 4E. Além disso, a fluidez da membrana no SLB curvo de nanobar também pode ser caracterizada pelo ensaio de FRAP, onde o sinal fluorescente em um único nanobar pode ser branqueado individualmente para caracterização da fluidez da membrana (Figura 2E,F).
A formação do SLB em nanobarras requer a geração de SUVs de forma semelhante à formação SLB em superfícies planas, conforme relatado anteriormente17. A composição lipídica dos SUVs determina a química da superfície do SLB curvo de nanobarras que pode ser alterada para marcação de membrana e diferentes mecanismos de ligação a proteínas. Por exemplo, o Texas Red DHPE pode ser adicionado em ~0,5 mol% em SUVs para que o enriquecimento da área de superfície da membrana em nanobarras possa ser facilmente fotografado por microscopia de fluorescência (Figura 2C). Além da visualização, a composição lipídica também pode ser alterada para facilitar a ligação de proteínas em SLBs curvos em nanobar. Por exemplo, para facilitar a ancoragem de proteínas marcadas com His, o ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA) pode ser trazido para o SLB nas nanobares, incorporando 1,2-dioleoil-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxipentil) ácido iminodiacético) succinil] (sal de níquel) (18:1 DGS-NTA(Ni)) em SUVs (~1 mol%)25. Sem esse grupo funcional sobre lipídios, a proteína de fluorescência verde (GFP) não pode se ligar ao SLB com PS carregado negativamente, resultando em um orifício em forma de barra mais escuro em cada local da nanobarra devido ao esgotamento volumétrico dos sinais de GFP na solução (Figura 2G). Em comparação, ao adicionar 1 mol% 18:1 DGS-NTA(Ni) no SLB, a GFP marcada com His-tag pode ancorar fortemente na membrana para seguir claramente a forma do SLB curvada por nanobarras (Figura 2H). A difusão lipídica não mostrou diferença detectável na ligação proteica investigada pelo ensaio FRAP (Figura 1 Suplementar). Vale a pena notar que a medida do FRAP é baseada apenas na intensidade do DHPE Texas Red a 0,5 mol% no SLB, o que pode não representar o DGS-NTA(Ni) de 1 mol% usado para a ligação da proteína His-tag. Além disso, lipídios carregados, como o PS, podem aumentar a ligação às proteínas por meio da interação eletrostática26, enquanto lipídios de sinalização, como fosfatidilinositol (4,5)-bisfosfato (PIP2), também podem ser integrados em SUVs para facilitar a ligação específica a proteínas (por exemplo, FCHo2, para o qual o PIP2 é considerado essencial para sua detecção de curvatura de membrana27).
A qualidade da formação de SLB em termos de uniformidade superficial e fluidez da membrana é fundamental para sondar a capacidade de detecção de curvatura de proteínas em nanobares. Existem três questões típicas que podem comprometer a uniformidade e fluidez do SLB. Uma delas é a ligação do excesso de SUVs no SLB devido à lavagem ineficiente que gera puncta tanto nas nanobarras quanto na membrana plana entre as nanobarras (Figura 3A,B). Afeta significativamente a quantificação da ligação de proteínas em superfícies curvas ou planas em nanobarras para avaliação de detecção de curvatura. Outra questão é a introdução inesperada de bolhas de ar dentro da câmara PDMS durante a etapa de lavagem, o que pode destruir o SLB ao longo da trajetória da interface ar-líquido e deixar características semelhantes a arranhões facilmente identificáveis com sinais lipídicos extremamente baixos na superfície da nanobarra (Figura 3C,D). Além disso, substratos de nanobarras limpos inadequadamente deixam resíduos químicos distribuídos aleatoriamente na superfície que impedem a adsorção lipídica para a formação de SLB. Leva à geração de defeitos de membrana que podem ou não estar acima da resolução óptica para visualização microscópica (Figura 3E). No entanto, a fluidez da membrana será sensivelmente afetada pela formação de defeitos da membrana28 para que o ensaio FRAP possa ser usado para verificar a limpeza da superfície (Figura 3F,G).
Para demonstrar a caracterização da proteína de detecção de curvatura usando a matriz de nanobares, o domínio típico de F-BAR é comparado com uma região intrinsecamente desordenada recentemente identificada na FBP17 (IDRFBP17). O F-BAR é marcado fluorescentemente com corantes de éster tetrafluorofenílico Alexa Fluor 488, enquanto o IDRFBP17 é marcado com Alexa Fluor 647 C2 Maleimida. Como mostra a Figura 4A, ambos os domínios proteicos apresentam acúmulo aumentado em nanobarras individuais revestidas com SLB com 300 nm de largura. Aqui, o SLB contém 10% de PS para melhorar eletrostaticamente a ligação às proteínas. A capacidade de detecção de curvatura da proteína pode ser identificada pelo enriquecimento preferencial nas extremidades curvas do nanobar com maior intensidade fluorescente do que os sinais nos centros planos de nanobar, o que é mais obviamente mostrado após a média da imagem de mais de 100 nanobares (Figura 4B). A capacidade de detecção de curvatura pode ser quantitativamente refletida calculando a relação fim-centro em cada nanobar (ou seja, a intensidade de fluorescência na extremidade da nanobarra versus o centro da nanobarra). Como mostrado na Figura 4C, ambas as proteínas têm uma maior relação fim-centro do que os lipídios, que é de cerca de 1. Ao comparar o IDR FBP17 e o F-BAR, pode-se observar que a maior relação end-to-center do IDRFBP17 (1,385 ±0,011, média ± EPM) indica maior detecção de curvatura do que F-BAR (1,144 ± 0,004, média ± MEV).
Para examinar a faixa de curvaturas que podem ser detectadas pelas proteínas, o SLB é gerado em matrizes de nanobarras com larguras gradientes de 200 nm a 600 nm (Figura 4D), onde os lipídios apresentaram revestimento homogêneo em nanobarras de diferentes tamanhos (Figura 4E). Três proteínas (IDR FBP17, F-BAR e F-BAR+IDRFBP17) são incubadas na matriz de nanobarras gradiente, e todas apresentaram acúmulo preferencial nos sítios de membrana curva de extremidade de nanobar, quando a curvatura diminuiu abaixo de 400 nm de diâmetro (Figura 4E,F). Entre esses três domínios proteicos, o IDRFBP17 fornece a maior densidade de nanobar-end, indicando sua maior capacidade de detecção de curvatura, enquanto F-BAR mostra o menor valor (Figura 4F). Além disso, a curva de ligação da proteína de detecção de curvatura também pode ser plotada aumentando gradualmente a concentração de proteína (Figura 4G), o que mostra que o IDRFBP17 tem uma forte capacidade de detecção de curvatura cooperativa. Ao ajustar suas curvas de ligação à equação de Hill, a DK é encontrada na faixa μM (0,6 ± 0,1 μM) e o coeficiente de Hill (H) está entre 2 e 3, sugerindo uma ligação ultrassensível do IDRFBP17 às curvaturas de membrana induzidas por nanobar. Quanto mais nítida a curvatura, maior a capacidade de ligação em equilíbrio.
A difusão dinâmica da membrana e a associação da membrana das proteínas de detecção de curvatura ao redor dos sítios SLB em forma de nanobarra também podem ser estudadas pelo FRAP. Em comparação com a rápida recuperação dos sinais lipídicos em nanobarras (Figura 5A,E), a F-BAR não conseguiu se recuperar dentro de 2 min (Figura 5B,E), sugerindo sua diminuição significativa da mobilidade da membrana e dinâmica de associação nos sítios curvos da membrana. Surpreendentemente, diferente do comportamento do F-BAR, IDR FBP17 signal mostrou recuperação óbvia dentro do mesmo período de tempo (Figura 5C,E), indicando a natureza dinâmica do IDRFBP17 acumulado nas membranas curvas. No entanto, após a lavagem do IDR FBP17 não ligado na solução, a mesma recuperação no canal IDRFBP17 não pôde ser observada como antes (Figura 5D,E). Indica que a recuperação é dominada pela troca com as moléculas IDRFBP17 contendo solução e menos pela difusão lateral das moléculas ligadas à membrana.
No geral, estes resultados demonstram que este sistema nanobar-SLB é uma ferramenta poderosa para caracterizar proteínas sensíveis à curvatura da membrana in vitro.
Figura 1: Ilustração do sistema nanobar-SLB . (A) A câmara PDMS consiste nas camadas superior e média com o nanochip limpo montado nela. (B) O Texas Red DHPE rotulou SUVs com detalhes ampliados. (C) O modelo intacto do sistema nanobar-SLB e a área de zoom in ilustram que o SLB se forma em nanobarras com uma única camada uniforme da bicamada lipídica. (D) Processo de imagem e caracterização sob microscopia confocal de varredura a laser. (E) Limpeza do nanochip para posterior reutilização. (F) Processamento de imagens para quantificação de detecção de curvatura de proteínas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A formação do SLB curvo em nanobarras com ligação a proteínas . (A) Imagem MEV de um nanobar individual. (B) Representação esquemática do sistema nanobar-SLB. (C) Imagens fluorescentes do SLB marcadas com Texas Red DHPE no nanochip. (D) Imagem média da distribuição SLB em nanobarras (acima) e um gráfico de superfície 3D da imagem média (abaixo). Esta figura foi modificada de Su et al.22 e reproduzida com permissão. (E) Imagem de lapso de tempo do FRAP SLB na nanobar. A região de branqueamento é indicada por um círculo tracejado amarelo. (F) Gráfico de intensidade de nanobarras normalizado por medida de FRAP. (G) A representação esquemática da GFP não pode se ligar ao SLB com 10 mol% de PS carregado negativo (à esquerda) e uma imagem representativa correspondente à direita. (H) Representação esquemática da GFP rotulada como His-tag ligada ao SLB com 1 mol% DGS-NTA(Ni) (esquerda) e uma imagem representativa correspondente à direita. Barras de escala: 2 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Problemas típicos que comprometem a qualidade do SLB. (A) Esquema da preparação do SLB sem lavagem eficiente. (B) Imagem representativa da ligação SLB com excesso de SUVs. As setas amarelas mostram os puncta que são SUVs em excesso na superfície SLB. (C) Esquema de preparação de SLB com bolhas de ar injetadas. (D) Imagem representativa do SLB destruído pela trajetória da interface ar-líquido. A seta amarela mostra o SLB incompleto no substrato. (E) Esquema da preparação de SLB com substratos de nanobarras não limpos. A área de zoom mostra uma bicamada lipídica descontínua devido aos resíduos superficiais que impedem a adsorção lipídica. (F) Imagem de lapso de tempo da análise de FRAP SLB em substratos de nanobarras não limpos. A região de branqueamento é indicada por um círculo tracejado amarelo. (G) Gráfico de intensidade de nanobarras normalizado por medida de FRAP. Barras de escala: 2 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Caracterização do sensor de curvatura de proteínas pelo sistema nanobar-SLB. (A) Imagens fluorescentes de F-BAR (esquerda) e IDRFBP17 (direita) se acumulam em nanobarras revestidas de SLB (10% PS e 90% PC). Barra de escala: 2 μm. (B) Imagens médias de F-BAR (parte superior esquerda) e IDRFBP17 (parte inferior esquerda) se acumulam em nanobarras e gráficos de superfície 3D correspondentes (parte superior direita e inferior direita, respectivamente). Barra de escala: 2 μm. (C) Relação centro-a-centro da intensidade de fluorescência lipídica bicamada, F-BAR e IDRFBP17 em torno da nanobarra de largura de 300 nm. Para análise estatística, foi realizado o teste t de Welch. p < 0,0001. (n = 3) (D) Imagem SEM de matrizes de nanobarras gradientes com larguras de 200 nm a 600 nm. Barra de escala: 5 μm. (E) Anotação do construto da proteína (topo), imagens médias da distribuição lipídica bicamada, IDR FBP17, F-BAR e F-BAR+IDRFBP17 em nanobarras de gradiente com largura variando de 200 nm a 600 nm (meio) e perfis de intensidade ao longo das nanobarras de cada imagem média (abaixo). Barra de escala: 2 μm. (F) IDR FBP17, F-BAR e F-BAR+IDRFBP17 normalizada densidade nanobar-end quantificada com diferentes larguras de nanobares, respectivamente. Cada dado é apresentado como a média ± MEV (n ≥ 60). (G) A curva de ligação do IDRFBP17 ajustada com a equação de Hill. Cada dado é apresentado como a média ± MEV (n = 3). Esta figura foi modificada de Su et al.22 e reproduzida com permissão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A dinâmica de ligação à membrana de proteínas de detecção de curvatura ao redor da nanobar. (A-D) Imagens de lapso de tempo da análise de FRAP washout (A), F-BAR (B), IDR FBP17 (C) e IDRFBP17 washout (D) na nanobar. A região de branqueamento é indicada por um círculo tracejado vermelho. Barra de escala: 5 μm. (E) Gráfico de intensidade de nanobarra normalizada por medida de FRAP. Esta figura foi modificada de Su et al.22 e reproduzida com permissão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 Suplementar: Difusão da membrana antes e depois da adição de proteínas. (A) Imagem de lapso de tempo do teste FRAP na bicamada lipídica POPC com 1 mol% 18:1 DGS-NTA(Ni) e 0,5 mol% Texas Red DHPE ao redor da nanobarra antes (superior) e depois (inferior) da adição da proteína GFP-He. A região de branqueamento é indicada por um círculo tracejado amarelo. (B) Gráfico de intensidade de nanobarras normalizado por medida de FRAP. Barras de escala: 2 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O sistema nanobar-SLB descrito aqui oferece uma combinação única das vantagens em vários ensaios in vitro existentes. Revela eficientemente a ligação preferencial de proteínas a membranas altamente curvas como o ensaio de flutuação ou sedimentação de lipossomas, mas requer muito menos amostras e oferece curvatura mais precisamente definida em nanobarras individuais 8,29. Ele também oferece uma ampla gama de curvatura precisamente controlada para comparação simultânea como o ensaio SLiC, com menos preocupação com a mudança da composição lipídica em diferentes curvaturas e mudanças morfológicas ou de curvatura indetectáveis com tamanhos abaixo do limite de difração da luz, já que o SLB é móvel e cobre continuamente todos os tamanhos de nanobarras firmemente30 . O Nanobar-SLB também permite a observação de comportamentos dinâmicos de proteína na membrana curva como os ensaios de puxar amarração, mas não limitado pelo rendimento da geração de tubos e experiência em manipulação de armadilhas ópticas13. Embora o ensaio SMrT gere tubos de membrana em alto rendimento, a curvatura da membrana varia ao longo do nanotubo, o que dificulta o estudo da sensibilidade à curvatura das proteínas16. Mais interessante, em comparação com outros sistemas baseados em SLB no substrato padronizado 18,19,20,27, o nanobar-SLB fornece um centro de barra plana ao lado da curvatura definida na extremidade da barra, que efetivamente serve como controle local da curvatura zero para minimizar o impacto das variações de densidade de superfície na análise quantitativa. A capacidade de personalizar combinações de curvatura usando litografia de feixe de elétrons de alta resolução pode gerar não apenas controles locais de curvatura zero, mas também curvaturas positivas e negativas, como demonstrado anteriormente em estudos de células vivas2.
Existem limitações potenciais que vale a pena notar ao usar esse método. Em primeiro lugar, a nanofabricação no chip é um procedimento relativamente complexo, com instalações de sala limpa e equipamentos especializados necessários (em particular, um gravador de feixe de E). Esse alto custo nos levou a reutilizar o chip; isso resulta em um tempo mais longo gasto limpando a superfície do chip e montando o chip com PDMS em comparação com o uso único. A disponibilidade do nanochip é outro tipo de limitação. A operação inadequada ao usar o chip, como a frente da superfície em direção à bancada, pode causar atrito da nanoestrutura, especialmente para as estruturas de alta relação de aspecto. Além disso, a bicamada lipídica formada no substrato é uma membrana contínua; a tensão pode facilmente se propagar em todos os lugares. Para estudos que requerem manipulação da tensão da membrana, técnicas como a corda puxada de GUVs através do sistema de micropipetas acoplado fornecem soluções mais convenientes10.
Para obter os melhores resultados, as etapas a seguir também são críticas. (i) O tamanho da vesícula é crítico para a formação de SLB31,32. A literatura anterior mostra maior propensão à fusão para vesículas de menor porte (< 90 nm) em comparação com o tamanho maior utilizando um teste de microequilíbrio de cristal de quartzo com dissipação (QCM-D)32. Assim, em comparação com LUVs de 300 nm, os diâmetros de ~50 nm serão mais fáceis para a formação de SLB. Considerando esse problema, pelo menos 20 vezes nas etapas de congelamento-descongelamento e extrusão são necessárias para formar SUVs homogêneos para a formação de SLB. O teste FRAP também é necessário em todos os experimentos para validar a mobilidade da membrana. (ii) Durante a preparação do SUV, todo o equipamento deve ser mantido limpo para evitar a contaminação de pequenas partículas semelhantes a poeiras. Especialmente para a mini-extrusora, as agulhas são facilmente entupidas em um ambiente sujo. (iii) Para preparar SUVs com boa qualidade, o clorofórmio na mistura lipídica precisa ser completamente removido para evitar a destruição de vesículas lipídicas. (iv) A limpeza a plasma do chip precisa ser realizada imediatamente antes da formação do SLB para garantir uma superfície altamente hidrofílica para uma quebra eficiente do SUV para formar uma bicamada contínua. A exposição prolongada no ambiente após o tratamento com plasma pode causar ligação inespecífica de partículas de poeira ou resíduos orgânicos à superfície do chip, comprometendo a hidrofilicidade da superfície. (v) Para montar a câmara PDMS para formação de SLB e incubação de proteínas, a limpeza e planicidade de cada peça PDMS são importantes para garantir uma boa vedação do canal fluídico. Qualquer vazamento da câmara pode fazer com que o SLB seque ou altere a concentração de proteína. (vi) O ajuste do foco de imagem é fundamental para garantir uma medição consistente da intensidade, uma vez que a altura da nanobarra (600 nm) é comparável à profundidade focal da microscopia confocal de varredura a laser no eixo z33. O foco deve ser reajustado cada vez que a matriz se move horizontalmente para manter a nitidez das bordas da nanobarra nas imagens.
Acima de tudo, o sistema nanobar-SLB introduzido aqui fornece um método poderoso para estudar as proteínas de detecção de curvatura da membrana. Vários parâmetros que afetam a interação da proteína com a membrana curva podem ser estudados quantitativamente em uma variedade de curvaturas, como domínios sensíveis à curvatura (por exemplo, domínio BAR e hélice anfifílica) da proteína 8,30, composição lipídica (por exemplo, PS e PIP2) da membrana27,34, pH, força iônica e temperatura do ambiente35,36 , bem como a interação proteína-proteína para a formação complexa (por exemplo, CHMP2B e CHMP2A podem contribuir de forma diferente para os processos de remodelamento de membrana catalisados por ESCRT-III)37,38. Estudos dinâmicos também podem ser realizados utilizando o sistema nanobar-SLB para sondar cinética de ligação à membrana11, difusão ou montagem de proteínas de membrana39, bem como reações enzimáticas 40 ou separação de fasescomportada 13,41,42. Além disso, a bicamada lipídica artificial é geralmente considerada simétrica com cada monocamada lipídica contendo a mesma composição lipídica, o que é bastante diferente da membrana celular viva43. A indução de uma bicamada de assimetria para melhor mimetizar a membrana plasmática pode ser obtida alterando-se o material da superfície, a condição tampão, a composição lipídica ou a temperatura44,45,46,47. É de grande valia verificar se uma bicamada assimétrica pode ser formada no sistema nanobar-SLB para estudar o comportamento proteico na membrana curva, o que merece mais estudos.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente neste trabalho.
Acknowledgments
Agradecemos ao Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) e ao Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) da Nanyang Technological University (NTU) por apoiar a fabricação de nanoestruturas e imagens MEV, a Plataforma de Produção de Proteínas (PPP) da Escola de Ciências Biológicas da NTU para purificação de proteínas e a Escola de Engenharia Química e Biomédica NTU para o microscópio confocal. Este trabalho é financiado pelo Ministério da Educação de Singapura (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 e MOE-T2EP30220-0009), pelo Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) apoiado pelo financiamento do MOE ao abrigo do esquema Research Centres of Excellence (W. Zhao), pela Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), pela NTU Start-up Grant (W. Zhao), Escola de Engenharia Química e Biomédica NTU para a bolsa de pesquisa (X. Miao), e Conselho de Bolsas de Estudo da China para a bolsa de pesquisa (J. Wu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
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