Her er et nanobar-støttet lipid dobbeltlagssystem utviklet for å gi en syntetisk membran med en definert krumning som muliggjør karakterisering av proteiner med krumningsfølerevne in vitro.
Membrankrumning spiller viktige roller i ulike essensielle prosesser av celler, for eksempel cellemigrasjon, celledeling og vesikkelhandel. Det genereres ikke bare passivt av cellulære aktiviteter, men regulerer også aktivt proteininteraksjoner og er involvert i mange intracellulære signaleringer. Dermed er det av stor verdi å undersøke rollen som membrankrumning i regulering av fordelingen og dynamikken til proteiner og lipider. Nylig har mange teknikker blitt utviklet for å studere forholdet mellom den buede membranen og protein in vitro. Sammenlignet med tradisjonelle teknikker tilbyr det nyutviklede nanobar-støttede lipid-dobbeltlaget (SLB) både høy gjennomstrømning og bedre nøyaktighet i membrankrumningsgenerering ved å danne et kontinuerlig lipid-dobbeltlag på mønstrede arrays av nanobarer med en forhåndsdefinert membrankrumning og lokal flat kontroll. Både lipidfluiditeten og proteinfølsomheten for buede membraner kan kvantitativt karakteriseres ved hjelp av fluorescensmikroskopiavbildning. Her introduseres en detaljert prosedyre for hvordan man danner en SLB på fabrikkerte glassflater som inneholder nanobararrayer og karakterisering av krumningsfølsomme proteiner på slike SLB. I tillegg dekkes protokoller for gjenbruk av nanobrikker og bildebehandling. Utover nanobar-SLB, er denne protokollen lett anvendelig for alle typer nanostrukturerte glassbrikker for krumningssensorstudier.
Membrankrumning er en kritisk fysisk parameter for en celle som forekommer i en rekke cellulære prosesser som morfogenese, celledeling og cellemigrasjon1. Det er allment anerkjent nå at membrankrumning er utenfor et enkelt resultat av cellulære hendelser; I stedet har det dukket opp som en effektiv regulator av proteininteraksjoner og intracellulær signalering. For eksempel ble flere proteiner involvert i clathrin-mediert endocytose funnet å fortrinnsvis binde seg til den buede membranen, noe som resulterte i dannelsen av et hotspot for endocytose2. Det er mange forskjellige årsaker til membrandeformasjon som membrantrekking av cytoskeletale krefter, tilstedeværelsen av lipidasymmetri med forskjellige størrelseshodegrupper, eksistensen av transmembranproteiner med konisk form, akkumulering av membranformende proteiner som BAR-domeneproteiner (oppkalt etter Bin, amfifysin og Rvs-proteiner) og innsetting av amfipatiske helices-domenet i membranen1 . Interessant nok deformerer disse proteinene og lipidene ikke bare membranen, men kan også fornemme membrankrumningen og utvise fortrinnsrettakkumulering 1. Derfor er det avgjørende å studere om og hvordan membraner med forskjellige krumninger endrer fordelingen og dynamikken til proteiner og lipider festet til dem og de potensielle effektene på de relaterte intracellulære prosessene.
Mange teknikker er utviklet for å analysere samspillet mellom buet membran og proteiner i både levende celler og in vitro-systemer. Det levende cellesystemet gir et ekte cellemiljø med rikt lipiddiversitet og dynamisk proteinsignalregulering 2,3,4,5,6,7. Et slikt sofistikert system er imidlertid vanskelig å studere på grunn av usikkerhetene og svingningene i det intracellulære miljøet. Derfor har in vitro-analysene ved bruk av en kunstig membran sammensatt av kjente lipidarter og rensede proteiner blitt kraftige rekonstitueringssystemer for å karakterisere forholdet mellom proteiner og buede membraner. Tradisjonelt genereres liposomer med forskjellige diametre ved ekstrudering for å oppdage krumningsfølsomme proteiner via enten en ko-sedimenteringsanalyse ved bruk av sentrifugalkraft eller en samflotasjonsanalyse med en tetthetsgradient for å unngå proteinaggregering 8,9. Krumningen til de ekstruderte liposomene er imidlertid begrenset av den tilgjengelige porestørrelsen til membranfilteret som brukes i ekstruderen10. Enkelt liposomkurvatur (SLiC) -analyse har vist seg å overvinne denne begrensningen, der liposomer med forskjellige diametre er fluorescensmerket og immobilisert på overflaten slik at krumningen kan markeres med fluorescerende intensitet11. Imidlertid er det observert sterk variasjon i lipidsammensetningen i små vesikler, noe som påvirker nøyaktigheten av krumningsmålingen12. Tether-pulling eksperimenter gir en mer nøyaktig måling av krumningen på den forbigående tether trukket fra gigantiske unilamellar vesikler (GUVs) ved hjelp av en optisk pinsett, hvor krumningen kan styres godt av membranspenningen generert13,14. Denne metoden er egnet til å studere enten positive eller negative krumningsfølende proteiner, men er begrenset av gjennomstrømningen av rørgenerering10. Støttede membranrør (SMrT) -analyse gir samtidig generering av flere membranrør som ekstruderes fra samme lipidreservoar ved mikrofluidiske strømmer. Likevel varierer membrankrumningen iboende langs nanorøret, noe som kompromitterer nøyaktigheten av fluorescensintensitetsbasert krumningsmåling15,16. Til sammenligning genererte bruk av små unilamellære vesikler (SUVer, diameter <100 nm17) for å danne et støttet lipid dobbeltlag (SLB) på overflater som inneholder designede topografier en enkelt dobbeltlagsmembran med krumninger forhåndsbestemt av nanofabrikasjon eller nanomaterialer med høy nøyaktighet18,19,20.
Her presenterer vi en protokoll for dannelsen av SLB på fabrikkerte nanochipflater med nanobararrayer og hvordan den kan brukes til å undersøke krumningsfølsomheten til proteiner in vitro. Som vist i figur 1, er det seks viktige komponenter i analysen: A) Rengjøring og montering av brikken med et mikrofluidisk kammer; B) Fremstilling av SUVer med definert lipidsammensetning; C) Dannelse av SLB på en nanochip og binding med krumningsfølsomme proteiner; D) Avbildning og karakterisering av SLB og krumningsfølsomme proteiner under fluorescensmikroskopi; E) Rengjøring av brikken for gjenbruk; F) Bildebehandling for kvantitativ analyse av proteinkrumningssensorevne. Den detaljerte protokollen er beskrevet trinn for trinn nedenfor.
Nanobar-SLB-systemet beskrevet her tilbyr en unik kombinasjon av fordelene i flere eksisterende in vitro-analyser. Det avslører effektivt den foretrukne bindingen av proteiner til høyt buede membraner som liposomflytning eller sedimenteringsanalyse, men krever mye færre prøver og gir mer nøyaktig definert krumning på individuelle nanobarer 8,29. Det tilbyr også et bredt spekter av nøyaktig kontrollert krumning for samtidig sammenligning som SLiC-…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) og Senter for forstyrrende fotoniske teknologier (CDPT) ved Nanyang Technological University (NTU) for å støtte nanostrukturfabrikasjon og SEM-avbildning, Protein Production Platform (PPP) ved School of Biological Sciences NTU for proteinrensing, og School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for konfokalmikroskopet. Dette arbeidet er finansiert av Singapore Ministry of Education (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 og MOE-T2EP30220-0009), Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) støttet av MOE-finansiering under Research Centres of Excellence-ordningen (W. Zhao), Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for forskningsstipendet (X. Miao), og China Scholarship Council for forskningsstipendet (J. Wu).
Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
Cotton buds | Watsons | ||
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
MATLAB | Mathworks | R2018b | |
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
Voterx | Scientific Industries | G560E | |
Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
Water Bath | Julabo | TW8 |