Här utvecklas ett nanobarstödt lipid-dubbelskiktssystem för att tillhandahålla ett syntetiskt membran med en definierad krökning som möjliggör karakterisering av proteiner med krökningsavkänningsförmåga in vitro.
Membrankrökning spelar viktiga roller i olika väsentliga processer av celler, såsom cellmigration, celldelning och vesikelhandel. Det genereras inte bara passivt av cellulära aktiviteter, utan reglerar också aktivt proteininteraktioner och är involverat i många intracellulära signaleringar. Således är det av stort värde att undersöka membrankrökningens roll för att reglera fördelningen och dynamiken hos proteiner och lipider. Nyligen har många tekniker utvecklats för att studera förhållandet mellan det krökta membranet och proteinet in vitro. Jämfört med traditionella tekniker erbjuder det nyutvecklade nanobarstödda lipid-dubbelskiktet (SLB) både hög genomströmning och bättre noggrannhet i membrankrökningsgenerering genom att bilda ett kontinuerligt lipid-dubbelskikt på mönstrade arrays av nanobarer med en fördefinierad membrankrökning och lokal platt kontroll. Både lipidfluiditeten och proteinkänsligheten för krökta membran kan karakteriseras kvantitativt med hjälp av fluorescensmikroskopiavbildning. Här introduceras en detaljerad procedur för hur man bildar en SLB på tillverkade glasytor som innehåller nanobarmatriser och karakteriseringen av krökningskänsliga proteiner på sådan SLB. Dessutom omfattas protokoll för återanvändning av nanochip och bildbehandling. Utöver nanobar-SLB är detta protokoll lätt tillämpligt på alla typer av nanostrukturerade glasflisor för krökningsavkänningsstudier.
Membrankrökning är en kritisk fysisk parameter för en cell som förekommer i en mängd olika cellulära processer såsom morfogenes, celldelning och cellmigration1. Det är allmänt erkänt nu att membrankrökningen är bortom ett enkelt resultat av cellulära händelser; Istället har det framstått som en effektiv regulator för proteininteraktioner och intracellulär signalering. Till exempel visade sig flera proteiner som är involverade i clathrinmedierad endocytos företrädesvis binda till det krökta membranet, vilket resulterade i bildandet av en hotspot för endocytos2. Det finns många olika orsaker till membrandeformation såsom membrandragning av cytoskelettkrafterna, närvaron av lipidasymmetri med olika stora huvudgrupper, förekomsten av transmembranproteiner med konisk form, ackumulering av membranformande proteiner som BAR-domänproteiner (uppkallad efter Bin-, amfifysin- och Rvs-proteiner) och införandet av amfipatiska helicesdomän i membranet1 . Intressant nog deformerar dessa proteiner och lipider inte bara membranet utan kan också känna av membrankrökningen och uppvisa preferensackumulering1. Därför är det viktigt att studera om och hur membran med olika krökningar förändrar fördelningen och dynamiken hos proteiner och lipider som är fästa vid dem och de potentiella effekterna på de relaterade intracellulära processerna.
Många tekniker har utvecklats för att analysera interaktionen mellan krökt membran och proteiner i både levande celler och in vitro-system. Det levande cellsystemet ger en verklig cellmiljö med rik lipiddiversitet och dynamisk proteinsignalreglering 2,3,4,5,6,7. Ett sådant sofistikerat system är emellertid svårt att studera på grund av osäkerheter och fluktuationer i den intracellulära miljön. Därför har in vitro-analyserna med hjälp av ett artificiellt membran bestående av kända lipidarter och renade proteiner blivit kraftfulla rekonstitueringssystem för att karakterisera förhållandet mellan proteiner och krökta membran. Traditionellt genereras liposomer med olika diametrar genom extrudering för att detektera krökningskänsliga proteiner via antingen en samsedimenteringsanalys med användning av centrifugalkraft eller en samflotationsanalys med en densitetsgradient för att undvika proteinaggregering 8,9. Krökningen hos de extruderade liposomerna begränsas emellertid av den tillgängliga porstorleken hos membranfiltret som används i extrudern10. SLiC-analys (Single liposome curvatur) har visat sig övervinna denna begränsning, där liposomer med olika diametrar fluorescensmärks och immobiliseras på ytan så att krökningen kan markeras av den fluorescerande intensiteten11. Emellertid har stark variation i lipidkompositionen observerats i små vesiklar, vilket påverkar noggrannheten hos krökningsmätningen12. Tether-pulling-experiment ger en mer exakt mätning av krökningen på den övergående tjudern som dras från gigantiska unilamellära vesiklar (GUV) med hjälp av en optisk pincett, där krökningen kan kontrolleras väl av membranspänningen som genereras13,14. Denna metod är lämplig för att studera antingen positiva eller negativa krökningsavkänningsproteiner, men begränsas av genomströmningen av rörgenerering10. SMrT-analys (Supported Membrane Tubes) ger samtidig generering av flera membranrör som strängsprutas från samma lipidreservoar genom mikrofluidiska flöden. Ändå varierar membrankrökningen i sig längs nanoröret, vilket äventyrar noggrannheten hos fluorescensintensitetsbaserad krökningsmätning15,16. Som jämförelse genererade användning av små unilamellära vesiklar (SUV, diameter <100 nm17) för att bilda ett stödd lipid-dubbelskikt (SLB) på ytor som innehåller designade topografier ett enda dubbelskiktsmembran med krökningar förutbestämda av nanofabrikation eller nanomaterial med hög noggrannhet18,19,20.
Här presenterar vi ett protokoll för bildandet av SLB på tillverkade nanochipytor med nanobarmatriser och hur det kan användas för att undersöka krökningskänsligheten hos proteiner in vitro. Som visas i figur 1 finns det sex väsentliga komponenter i analysen: A) Rengöring och montering av chipet med en mikrofluidisk kammare; B) Framställning av stadsjeepar med definierad lipidsammansättning; C) Bildning av SLB på ett nanochip och bindning med krökningskänsliga proteiner; D) Avbildning och karakterisering av SLB- och krökningskänsliga proteiner under fluorescensmikroskopi; E) Rengöring av chipet för återanvändning; F) Bildbehandling för kvantitativ analys av proteinkrökningsavkänningsförmåga. Det detaljerade protokollet beskrivs steg för steg nedan.
Nanobar-SLB-systemet som beskrivs här erbjuder en unik kombination av fördelarna i flera befintliga in vitro-analyser. Det avslöjar effektivt den föredragna bindningen av proteiner till mycket krökta membran som liposomflytning eller sedimenteringsanalys men kräver mycket färre prover och erbjuder mer exakt definierad krökning på enskilda nanobarer 8,29. Det erbjuder också ett brett utbud av exakt kontrollerad krökning för samtidig jämförel…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) och Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) vid Nanyang Technological University (NTU) för att stödja nanostrukturtillverkning och SEM-avbildning, Protein Production Platform (PPP) vid School of Biological Sciences NTU för proteinrening och School of Chemical and Biomedical Engineering NTU för konfokalmikroskopet. Detta arbete finansieras av Singapore Ministry of Education (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 och MOE-T2EP30220-0009), Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) som stöds av MOE-finansiering under Research Centres of Excellence-systemet (W. Zhao), Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao), Skolan för kemisk och biomedicinsk teknik NTU för forskningsstipendiet (X. Miao) och China Scholarship Council för forskningsstipendiet (J. Wu).
Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
Cotton buds | Watsons | ||
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
MATLAB | Mathworks | R2018b | |
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
Voterx | Scientific Industries | G560E | |
Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
Water Bath | Julabo | TW8 |