Summary

Um Modelo de Rato de Intubação Orotraqueal e Cirurgia de Reperfusão de Isquemia Pulmonar Ventilada

Published: September 09, 2022
doi:

Summary

Um modelo cirúrgico de camundongo para criar lesão de reperfusão (RI) de isquemia pulmonar esquerda, mantendo a ventilação e evitando a hipóxia.

Abstract

A lesão por isquemia reperfusão (RI) frequentemente resulta de processos que envolvem um período transitório de fluxo sanguíneo interrompido. No pulmão, a RI isolada permite o estudo experimental desse processo específico com ventilação alveolar continuada, evitando, assim, os processos agravantes prejudiciais de hipóxia e atelectasia. No contexto clínico, a lesão de reperfusão por isquemia pulmonar (também conhecida como IRI pulmonar ou LIRI) é causada por inúmeros processos, incluindo, entre outros, embolia pulmonar, trauma hemorrágico ressuscitado e transplante pulmonar. Atualmente, existem opções de tratamento eficazes limitadas para o LIRI. Aqui, apresentamos um modelo cirúrgico reversível de RI pulmonar envolvendo a primeira intubação orotraqueal seguida de isquemia pulmonar esquerda unilateral e reperfusão com ventilação alveolar preservada ou troca gasosa. Os camundongos são submetidos a uma toracotomia esquerda, através da qual a artéria pulmonar esquerda é exposta, visualizada, isolada e comprimida usando um nó escorregadio reversível. A incisão cirúrgica é então fechada durante o período isquêmico, e o animal é despertado e extubado . Com o rato respirando espontaneamente, a reperfusão é estabelecida liberando o nó deslizante ao redor da artéria pulmonar. Este modelo de sobrevida clinicamente relevante permite a avaliação da lesão da RI pulmonar, da fase de resolução, dos efeitos a jusante sobre a função pulmonar, bem como de modelos de dois acertos envolvendo pneumonia experimental. Embora tecnicamente desafiador, esse modelo pode ser dominado ao longo de algumas semanas a meses com uma eventual taxa de sobrevivência ou sucesso de 80% a 90%.

Introduction

A lesão por isquemia reperfusão (RI) pode ocorrer quando o fluxo sanguíneo é restaurado para um leito de órgão ou tecido após algum período de interrupção. No pulmão, a RI pode ocorrer isoladamente ou em associação com outros processos prejudiciais, como infecção, hipóxia, atelectasia, volutrauma (de volumes correntes elevados durante a ventilação mecânica), barotrauma (alto pico ou pressões sustentadas durante a ventilação mecânica) ou lesão por contusão pulmonar contusa contundente (não penetrante) 1,2,3 . Ainda existem várias lacunas em nosso conhecimento sobre os mecanismos do LIRI e o impacto dos processos simultâneos (por exemplo, infecção) nos desfechos do LIRI, e também as opções de tratamento para o LIRI são limitadas. Um modelo in vivo de LIRI puro é necessário para identificar a fisiopatologia da lesão da RI pulmonar isoladamente e para estudar sua contribuição para qualquer processo multi-hit do qual a lesão pulmonar seja um componente.

Modelos de RI pulmonar murina podem ser usados para estudar a fisiopatologia pulmonar específica de múltiplos processos, incluindo transplante pulmonar3, embolia pulmonar4 e lesão pulmonar após trauma hemorrágico com ressuscitação5. Os modelos atualmente utilizados incluem transplante pulmonar cirúrgico6, pinçamento hilar7, perfusão pulmonar ex vivo 8 e RI pulmonar ventilada9. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para um modelo de RI pulmonar ventilada murina de lesão pulmonar estéril. Existem múltiplos benefícios dessa abordagem (Figura 2), incluindo que ela induz hipóxia mínima e atelectasia mínima, e é um modelo de cirurgia de sobrevida que permite estudos de longo prazo.

As razões para escolher este modelo de LIRI em detrimento de outros modelos, como os modelos de pinçamento hilar e perfusão ex vivo , são as seguintes: este modelo minimiza as contribuições inflamatórias da atelectasia, ventilação mecânica e hipóxia; preserva a ventilação cíclica; mantém um sistema imunológico circulatório in vivo intacto que pode responder à lesão por RI; e, finalmente, como procedimento de sobrevida, permite a análise a longo prazo dos mecanismos de geração de lesão secundária (modelos 2-hit) e resolução da lesão. No geral, acreditamos que este modelo de IR pulmonar ventilado fornece a forma “mais pura” de lesão de IR que pode ser estudada experimentalmente.

Outras publicações descreveram o uso da intubação orotraqueal de camundongos para a realização de injeções ou instalações de TI10,11, mas não como ponto de partida para uma cirurgia de sobrevida como neste modelo. A colocação de um tubo orotraqueal permite a realização de cirurgia pulmonar, permitindo o colapso do pulmão operatório. Também permite a reinsuflação do pulmão no final do procedimento, o que é crítico para o pneumotórax e para a capacidade do rato de retornar à ventilação espontânea na conclusão dos procedimentos. Finalmente, a remoção do tubo orotraqueal seguro é um procedimento simples que, ao contrário de uma traqueostomia invasiva, é compatível com uma cirurgia de sobrevivência. Isso permite estudos de pesquisa de longo prazo focados na compreensão da progressão e resolução do LIRI e distúrbios associados, bem como a criação de modelos de lesões crônicas.

Protocol

Todos os procedimentos e etapas descritos abaixo foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade da Califórnia em São Francisco. Qualquer cepa de camundongo pode ser usada, embora algumas cepas tenham uma resposta inflamatória IR pulmonar mais robusta em comparação comoutras 12. Ratos que são aproximadamente 12-15 semanas de idade (30-40 g) ou mais velhos toleram e sobrevivem à cirurgia de IR pulmonar melhor do que os ratos mais jovens. Camund…

Representative Results

Inflamação gerada pela lesão unilateral de reperfusão de isquemia pulmonar estéril ventilada (RI): Após 1 h de isquemia, observamos níveis aumentados de citocinas no soro e no tecido pulmonar por ELISA e qRT-PCR que atingiram o pico em 1 h após a reperfusão e rapidamente retornaram à linha de base dentro de 12-24 h após a reperfusão13. Para as amostras coletadas às 3 h após a reperfusão, observamos intensa infiltração de neutrófilos no interior do tecido pulmonar esquerdo e obser…

Discussion

Este manuscrito detalha as etapas envolvidas na realização do modelo de RI pulmonar ventilada desenvolvido por Dodd-o et al.9. Esse modelo ajudou a identificar as vias moleculares envolvidas na geração e resolução da inflamação da RI pulmonar isoladamente 14,15,16,17, da RI pulmonar em combinação com a infecção coexistente 18 e da RI pulmonar em relação ao eixo intestino-pulmão e à contribuição do microbioma intestinal13,18,19<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo apoio departamental do Departamento de Anestesia e Cuidados Perioperatórios, Universidade da Califórnia em São Francisco e San Francisco General Hospital, bem como por um prêmio NIH R01 (para AP): 1R01HL146753.

Materials

Equipment
Fiber Optic Light Pipe Cole-Parmer UX-41720-65 Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source AmScope SKU: CL-HL250-B Light source for fiberoptic lights
Germinator 500 Cell Point Scientific, Inc. No.5-1450 Bead Sterilizer
Heating Pad AIMS 14-370-223 Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper) WAHL home products SKU 09854-600B To remove mouse hair on surgical site
Microscope Nikon SMZ-10 Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator Havard Apparatus Model 845 Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner Cole-Parmer UX-08895-05 Clean tools that been used in operation
Warming Pad Kent Scientific RT-0501 To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale Cole-Parmer UX-11003-41 Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture Ethicon 683G For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture Ethicon Industry EP8734H Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use) Aspen Surgical 372611 For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel Aspen Surgical 372612 For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps FST 11150-10 Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System FST 1. Base Plate (Nos. 18200-03)
2. Fixators (Nos. 18200-01)
3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12)
4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)
Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle COVIDIEN 05-561-20 For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps FST 11002-12 Skin level forceps
Needle holder/Needle driver FST 12565-14 for holding needles
Needles BD 305110 26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps FST 00125-11 To hold PA; non-damaging gripper
Scissors FST 14060-09 Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps FST 11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm) For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine Hospira, Inc. 0409-1159-02 Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) Sigma-Aldrich T48402-25G Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine Covetrus North America 59122 Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant BAUSCH+LOMB Soothe Lubricant Eye Ointment Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution MEDLINE INDUSTRIES INC SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic) Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab BD brand  BD 326895 for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film KIRKLAND Stretch-Tite premium Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes Stoelting 50981 Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application Pwi-Wnaps 703033 used for applying eye lubricant
Top Sponges Dukal Corporaton Reorder # 5360 Stopping bleeding from skin/muscle

References

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Liao, W., Maruyama, D., Kianian, F., Tat, C., Tian, X., Hellman, J., Dodd-o, J. M., Prakash, A. A Mouse Model of Orotracheal Intubation and Ventilated Lung Ischemia Reperfusion Surgery. J. Vis. Exp. (187), e64383, doi:10.3791/64383 (2022).

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