Summary
Ventilasyonu korurken ve hipoksiden kaçınırken sol akciğer iskemisi reperfüzyonu (IR) hasarı oluşturmak için bir fare cerrahi modeli.
Abstract
İskemi reperfüzyonu (IR) hasarı sıklıkla kan akışının kesintiye uğradığı geçici bir dönemi içeren süreçlerden kaynaklanır. Akciğerde, izole IR, devam eden alveoler ventilasyon ile bu spesifik sürecin deneysel çalışmasına izin verir, böylece hipoksi ve atelektazi bileşik zararlı süreçlerinden kaçınır. Klinik bağlamda, akciğer iskemisi reperfüzyon hasarı (akciğer IRI veya LIRI olarak da bilinir), pulmoner emboli, resüsite hemorajik travma ve akciğer transplantasyonu dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çok sayıda süreçten kaynaklanır. Şu anda LIRI için sınırlı etkili tedavi seçenekleri vardır. Burada, akciğer IR'nin ilk orotrakeal entübasyon, ardından tek taraflı sol akciğer iskemisi ve korunmuş alveoler ventilasyon veya gaz değişimi ile reperfüzyonu içeren geri dönüşümlü bir cerrahi modeli sunulmuştur. Fareler, sol pulmoner arterin maruz kaldığı, görselleştirildiği, izole edildiği ve geri dönüşümlü bir kayma notu kullanılarak sıkıştırıldığı bir sol torakotomiye uğrar. Cerrahi kesi daha sonra iskemik dönemde kapatılır ve hayvan uyandırılır ve ekstübe edilir. Fare kendiliğinden nefes alırken, pulmoner arter etrafındaki kayma düğümünü serbest bırakarak reperfüzyon kurulur. Klinik olarak ilgili bu sağkalım modeli, akciğer IR hasarının, çözüm evresinin, akciğer fonksiyonu üzerindeki aşağı akış etkilerinin ve deneysel pnömoni içeren iki vuruşlu modellerin değerlendirilmesine izin verir. Teknik olarak zor olsa da, bu model% 80 -% 90'lık bir nihai hayatta kalma veya başarı oranı ile birkaç hafta ila ay boyunca ustalaşılabilir.
Introduction
İskemi reperfüzyonu (IR) hasarı, bir süre kesintiden sonra kan akımı bir organ veya doku yatağına geri yüklendiğinde ortaya çıkabilir. Akciğerde, IR izolasyonda veya enfeksiyon, hipoksi, atelektazi, volutravma (mekanik ventilasyon sırasında yüksek gelgit hacimlerinden), barotravma (mekanik ventilasyon sırasında yüksek pik veya sürekli basınçlar) veya künt (penetran olmayan) akciğer kontüzyonu hasarı gibi diğer zararlı süreçlerle birlikte ortaya çıkabilir 1,2,3 . LIRI'nin mekanizmaları ve eşzamanlı süreçlerin (örneğin enfeksiyon) LIRI sonuçları üzerindeki etkisi hakkındaki bilgimizde birkaç boşluk kalmaktadır ve ayrıca LIRI için tedavi seçenekleri sınırlıdır. İzolasyonda akciğer IR hasarının patofizyolojisini tanımlamak ve akciğer hasarının bir bileşeni olduğu herhangi bir çoklu vuruş sürecine katkısını incelemek için saf LIRI'nin in vivo bir modeli gereklidir.
Murin akciğer IR modelleri, resüsitasyon5 ile hemorajik travma sonrası akciğer transplantasyonu3, pulmoner emboli4 ve akciğer hasarı dahil olmak üzere birçok sürecin akciğere özgü patofizyolojisini incelemek için kullanılabilir. Günümüzde kullanılan modeller arasında cerrahi akciğer transplantasyonu6, hiler clamping7, ex vivo akciğer perfüzyonu8 ve ventilasyonlu akciğer IR9 bulunmaktadır. Burada, steril akciğer hasarının murin ventilasyonlu akciğer IR modeli için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımın (Şekil 2), minimal hipoksi ve minimal atelektaziye neden olması da dahil olmak üzere birçok faydası vardır ve uzun süreli çalışmalara izin veren bir sağkalım cerrahisi modelidir.
Bu LIRI modelini hiler kelepçeleme ve ex vivo perfüzyon modelleri gibi diğer modellere göre seçme nedenleri şunlardır: Bu model atelektazi, mekanik ventilasyon ve hipoksinin enflamatuar katkılarını en aza indirir; döngüsel ventilasyonu korur; IR hasarına cevap verebilecek sağlam bir in vivo dolaşım bağışıklık sistemini korur; ve son olarak, bir sağkalım prosedürü olarak, ikincil yaralanma oluşturma mekanizmalarının (2 vuruşlu modeller) ve yaralanma çözünürlüğünün uzun vadeli analizine izin verir. Genel olarak, bu ventilasyonlu akciğer IR modelinin deneysel olarak çalışılabilecek "en saf" IR hasarı formunu sağladığına inanıyoruz.
Diğer yayınlar, BT enjeksiyonlarını veya kurulumlarını gerçekleştirmek için farelerin orotrakeal entübasyonunun kullanımını10,11, ancak bu modelde olduğu gibi bir hayatta kalma cerrahisi için başlangıç noktası olarak tanımlamamıştır. Bir orotrakeal tüpün yerleştirilmesi, ameliyat akciğerinin çökmesine izin vererek akciğer cerrahisinin gerçekleştirilmesine izin verir. Ayrıca, prosedürün sonunda akciğerin yeniden enflasyonuna izin verir, bu da pnömotoraks için ve farenin prosedürlerin sonunda kendiliğinden ventilasyona geri dönme kabiliyeti için kritik öneme sahiptir. Son olarak, güvenli orotrakeal tüpün çıkarılması, invaziv trakeotomiden farklı olarak, hayatta kalma ameliyatı ile uyumlu basit bir prosedürdür. Bu, LIRI ve ilişkili bozuklukların ilerlemesini ve çözülmesini anlamaya ve ayrıca kronik yaralanma modellerinin oluşturulmasına odaklanan daha uzun vadeli araştırma çalışmalarına izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan tüm prosedürler ve adımlar, California San Francisco Üniversitesi'ndeki kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Herhangi bir fare suşu kullanılabilir, ancak bazı suşlar diğerlerine kıyasla daha sağlam bir akciğer IR enflamatuar yanıtına sahiptir12. Yaklaşık 12-15 haftalık (30-40 g) veya daha büyük olan fareler, akciğer IR ameliyatını genç farelerden daha iyi tolere eder ve hayatta kalır. Bu ameliyatlar için hem erkek hem de dişi fareler kullanılabilir.
1. Fare Entübasyon Protokolü
- Anestezi ve entübasyon için hazırlık
- Fare karnını bir etanol çubukla silin. Fareyi intraperitoneal tribromoetanol (250-400 mg / kg) enjeksiyonu ile anestezikleştirin. Uygun anestezi derinliğini pedal çekilme refleksinin eksikliği ile değerlendirin. Göz yağlama merhemini şimdi veya daha sonra yerleştirin (adım 2.1.4).
NOT: Bu prosedür için, tribromoetanol (ve alternatif bir seçenek olarak etomid), bu ameliyat için gerekli hemodinamik koşulları etkilemeden stabil bir anestezik düzlem sağlar. Bu anestezik, periton yapışıklığı riskini önlemek için sadece bir kez kullanılır. İzofluran da kullanılabilir, ancak burada kullanmıyoruz. Uygulayıcı, uygun gördüğü anestezik reçeteyi kullanmakta özgürdür. - Anestezi uygulanan fareyi bir entübasyon standına veya plastik desteğe sırtüstü pozisyonda, üst kesici dişleri tarafından iki destek ankrajı boyunca ilmekli 4-0 dikişlere (ipek veya diğer) asılı olarak yerleştirin.
- Entübasyon prosedürü sırasında fareyi hareketsiz tutmak için, göğsün alt kısmını (veya her iki üst ekstremite) platforma gevşek bir şekilde bantlayın.
- Fiberoptik esnek ışığı, ses tellerinin biraz altında, farenin trakeasına hafifçe yerleştirin. Aydınlatma seviyesini, ses tellerinin altından yayılan kırmızı ışık dışında, fare orofarenksine bakarken yalnızca karanlık bir alan görünecek şekilde ayarlayın ve endotrakeal tüpün nihai yerleşimi için hedefi gösterin. Ses teli hareketlerinin çıplak gözle veya gerekirse büyütme altında görülebilmesi gerektiğini unutmayın.
- Fare karnını bir etanol çubukla silin. Fareyi intraperitoneal tribromoetanol (250-400 mg / kg) enjeksiyonu ile anestezikleştirin. Uygun anestezi derinliğini pedal çekilme refleksinin eksikliği ile değerlendirin. Göz yağlama merhemini şimdi veya daha sonra yerleştirin (adım 2.1.4).
- Entübasyon prosedürü
- Cımbızları baskın elinizle tutun ve dili yavaşça kavramak ve ağız boşluğundan çıkarmak için kullanın.
- Baskın olmayan el tarafından tutulan forseps kullanarak alt çeneyi açın ve ardından epiglottis hafifçe kaldırmak için forsepsleri larinkse doğru itin. Şu anda, dili cımbızdan serbest bırakın.
- Ses tellerini arayın. Her nefese göre açılıp kapanmalıdırlar. Kanülü kılavuz tel önceden yüklenmiş olarak tutarak, telin ucunu ses tellerinden geçirin.
- Telin kanülün dışında kalan ancak ses tellerinin hemen üstünde olan bir kısmını tutarak hareket ettirmemeye çok dikkat ederek, kanülü geri çekin, sadece teli trakea içindeki distal ucuyla yerinde bırakın.
- Bu noktada, tel distal ucunun aydınlatılmış ses tellerinden ve trakeadan geçtiğini ve aydınlatılmamış yemek borusunda olmadığını doğrulamak için ses tellerinin ikinci bir görselleştirmesini yapın.
- Teli sol elinizdeki kavisli forseps ile ağzın dışında tutun, sert bir yüzeye karşı stabilize edin ve 20G kateteri tel üzerinde bant kanatlarıyla dikkatlice ilerletin.
- Telin distal ucu 20G kateterin veya endotrakeal tüpün arka ucundan çıktığında, bu ucu kavisli forseps ile tutun ve 20G kateteri trakeaya düzgün bir şekilde ilerletin.
- Kateterin yerleştirilmesini yerinden oynatmadan teli 20G kateterin distal ucundan kavisli forseps ile dikkatlice çıkarın.
- Yemek borusuna değil, trakeaya uygun yerleşimi onaylamak için sabitlemeden önce kateteri ventilatöre kısaca bağlayın. Mekanik ventilasyona bağımlı bilateral göğüs duvarı hareketlerini ve midenin şişirilmesinin yokluğunu gözlemleyerek trakea yerleşimini onaylayın.
- Entübasyon sonrası
- Kateteri ventilatörden ayırın. Sonraki tüm prosedürler / manipülasyonlar sırasında endotrakeal tüpü (ETT) fareye sıkıca sabitlemek için bant kanatlarını (katetere bağlı) farenin alt dudağından 4-0 vicryl sütür kullanarak sabitleyin.
NOT: Alternatif olarak, ETT'yi sabitlemek için ipek bant veya başka bir bant kullanılabilir, ancak hayvanın entübasyon kızağından cerrahi yüzeye hareketi sırasında ETT'nin yerinden çıkmasını önlemek için özen gösterilmelidir. - Fareyi entübasyon kızağından dikkatlice çıkarın. Orotrakeal tüpün doğru trakeal yerleşimini doğrulamak için kateteri 0.2-0.225 mL'lik bir gelgit hacmine ve dakikada 120-150 nefes solunum hızına ayarlanmış ventilatöre kısaca bağlayın ve ardından orotrakeal tüpten kendiliğinden nefes alan fare ile bağlantıyı kesin.
- Hayvanı bu noktadan itibaren, prosedürün sonunda sternal yatışı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakmayın.
- Kateteri ventilatörden ayırın. Sonraki tüm prosedürler / manipülasyonlar sırasında endotrakeal tüpü (ETT) fareye sıkıca sabitlemek için bant kanatlarını (katetere bağlı) farenin alt dudağından 4-0 vicryl sütür kullanarak sabitleyin.
2. Akciğer iskemisi ve reperfüzyon (IR) cerrahi protokolü
- Analjezi ve cerrahi bölgenin hazırlanması
- Fare karnını bir etanol sürüntüsü ile silin ve intraperitoneal olarak buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg) enjekte edin.
- Sol toraks bölgesi üzerindeki saçları sol kürek kemiğine kadar tıraş edin. Alkollü çubuklar kullanarak fazla tıraş edilmiş saçları çıkarın.
NOT: Adım 2.1.1 ve 2.1.2, ipek bantla sabitlendiğinde ETT'nin yerinden çıkması endişesi varsa, entübasyondan önce de gerçekleştirilebilir. - Fareyi sol yanal veya 3/4 dönmüş pozisyonda bir ısıtma yastığına yerleştirin ve trakea tüpünü ventilatör üzerinde 0.2-0.225 mL (~ 8 mg / kg) gelgit hacmi ve dakikada 120-150 nefes solunum hızı ile bağlayın. Bu işlem için ek oksijen kullanmayın.
- Göz yağlayıcısını steril pamuk uçlu çubukla uygulayın. Fareyi 3/4 sol tarafa yukarı çevirin ve dört uzuvun tamamını ve kuyruğu laboratuvar bandıyla hareketsiz hale getirin.
- Tıraş edilmiş cilt bölgesini ve çevresindeki kürkü povidon-iyotla dezenfekte edin ve çözeltinin kurumasını bekleyin. Daha sonra cerrahi alanı steril bir örtü veya şeffaf plastik film ile örtün ve cerrahi alan için örtü veya plastik filmde dikdörtgen bir açıklık oluşturun.
- Cerrahi prosedür
- Ayak parmağı sıkışmasına verilen yanıtı test ederek uygun anestezi seviyesini (daha önce tarif edildiği gibi tribromoetanol ve buprenorfin uygulaması ile sağlanan) onaylayın.
- Bir çift keskin makas ve bir çift daha büyük forseps (dar desenli forseps veya benzeri) kullanarak, sol lateral torakstaki kürek kemiğinin alt açısının altında 2 cm'lik enine bir cilt kesisi yapın. Kas tabakasını kesmek ve kaburgalara kadar incelemek için makas ve daha ince bir çift forseps (ekstra ince graefe forseps veya benzeri) kullanın.
- İkinci interkostal boşluğu tanımlayın ve ikinci kaburgayı ekstra ince forsepslerle tutun. Kaburgayı yukarı doğru çekerek, 2. ve 3. boşluğun interkostal kaslarını ayırarakve keserek plevral boşluğa girmek için steril bir #11 veya #12 (kavisli) neşter bıçağı (tutamak gerekmez) kullanın. Sol akciğer tepesindeki yaralanmayı azaltmak için ventilasyonu duraklatmayı düşünün.
- Üç sterilize retraktör takın. Kaburgaların yönü boyunca en küçük / en dar retraktör sefaladını, 2. kaburga boyunca sola orta boy retraktörü ve 3. kaburganın yüzeyi boyunca sağa en büyük retraktörü kullanın.
- Elastik retraktör kordonlarını kullanarak göğsü yavaş ve ilerleyici geri çekilme ile açın. Sol akciğer tepesini steril pamuk uçlu bir çubukla hareket ettirerek sol pulmoner arteri (PA) açığa çıkarın ve tanımlayın.
- Sol PA ve bronşun her ikisinin de görünür olduğu alanı nazikçe ortaya çıkarmak ve oluşturmak için mikro forsepsleri, sağ eldeki ultra ince forsepsleri ve sol eldeki PA veya damar genişletici forsepsleri kullanın.
- PA forsepslerini kullanarak, sol PA'yı alın ve aşağıdaki şeffaf bronşu görselleştirmek için yavaşça ama sıkıca yukarı doğru ve sefalad çekin. Bu noktada diseksiyon mikroskobundaki büyütmeyi (daha fazla ayrıntı için ekipman listesine bakın) maksimuma (2x) yükseltin.
NOT: Kullanmadan önce tüm ekipmanı sterilize edin. Ek olarak, steriliteyi korumak için, steril cerrahi alana sadece cerrahi aletlerin uçları girmelidir. - PA'yı bronştan uzaklaştırırken, kapalı ultra ince forsepsleri sol PA ve bronş arasındaki boşluktan dikkatlice geçirin. Ardından, 7-0 veya 8-0'ı tutmak ve çekmek için bu forsepsleri kullanın. sol pulmoner arter (yukarıda) ve bronş (aşağıda) arasındaki boşluktan prolen sütür.
- PA'da bir tıkanıklık oluşturmak için bir kayma düğümü bağlayarak sol PA'yı çevreleyin. Kan akışının kesilmesi mikroskop altında kolayca görselleştirilir. Bu, iskemik dönemin başlangıcını işaret eder.
- Bir 24G-28G iğnesi kullanarak düğümün serbest ucunu ön sol torakstaki farklı bir giriş noktasından dışsallaştırın ve daha sonra daha kolay tanımlama için dikişin ucunu küçük bir bant parçasıyla sabitleyin.
- Kemirgen ventilatöründe bir PEEP valfi / tüpü kullanarak göğüs boşluğundan mümkün olduğunca fazla hava atmak için akciğeri yeniden şişirin. Ardından, göğüs kafesini iki kesilmiş 4-0 naylon dikişle kapatın.
- Kas ve deri altı tabakasını 4-0 naylon dikişle kapatın. Daha sonra insizyona iki veya üç damla topikal bupivakain (% 0.5) uygulayın. Cilt tabakasını akan bir dikişle kapatmak için 4-0 naylon dikiş kullanın.
- Ameliyat sonrası bakım
- Spontan ventilasyon devam ettiğinde, endotrakeal tüpü ventilatörden ayırın ve fareyi ekstübe edin.
- Anestezi sonrası erken iyileşme sırasında vücut ısısını korumak için fareyi ısıtma pedinin üzerine yerleştirin.
- Genel anesteziden kurtulurken fareyi dikkatlice izleyin. Dışsallaştırılmış kaymayı çekiniskemik dönemin sonunda hafifçe (30 dakika veya 1 saat).
- İyileşme belirtileri gösterdikten sonra fareyi ısıtma pedinden bir kafese taşıyın: kendi kendini düzeltme ve / veya hareket.
- Reperfüzyon döneminden sonra (1 saat veya 3 saat), hayvanı ötenazi yapın ve daha fazla analiz için kardiyak ponksiyon ve akciğer dokusu ile kan toplayın. 1 saatlik reperfüzyon için, ELISA için plazma, RNA için doku ve protein analizi toplayın; 3 saatlik reperfüzyon için, ayrıca histoloji için doku toplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek taraflı ventilasyonlu steril akciğer iskemisi reperfüzyonu (IR) hasarı ile oluşan inflamasyon: 1 saatlik iskemiyi takiben, serumda ve akciğer dokusunda hem ELISA hem de qRT-PCR ile artmış sitokin düzeyleri gözlemledik ve bu da reperfüzyonu takiben 1 saatte zirveye ulaştı ve reperfüzyon13'ten sonra 12-24 saat içinde hızla taban çizgisine geri döndü. Reperfüzyonu takiben 3 saatte toplanan örnekler için, sol akciğer dokusunda yoğun nötrofil infiltrasyonu gözlemledik ve inflamasyonun yoğunluğunun kullanılan farenin suşuna bağlı olduğunu belirttik (Şekil 1). Özellikle, birlikte var olan veya daha sonra bulaşıcı bir sürecin yokluğunda oluşan inflamasyon yavaş yavaş düzelir ve akciğerler, reperfüzyondan 12-24 saat sonra 12-24 saat içinde efferositoz veya nötrofillerin yaralı akciğerlerden çıkışı ile normal akciğer mimarisine (histopatoloji ile) geri döner13. Not olarak, büyük ölçüde nötrofilik olan ve ameliyat dışı sağ akciğerde de gözlenen hafif fakat saptanabilir inflamasyon gözlemledik, bunun hiperperfüzyon hasarına bağlı olduğunu varsayıyoruz14.
Bu akciğer IR modeli için doku örneği toplama, diğer akciğer IR modellerinden farklı değildir: kardiyak ponksiyon veya IVC kanülasyonu yoluyla plazma hazırlığı için kan toplanabilir; akciğer dokusu protein veya RNA preparasyonu için ve daha sonra batı lekesi, ELISA veya qPCR ile daha fazla analiz için toplanabilir.
Şekil 1: İki farklı suşa sahip vahşi tip farelerde akciğer kesitlerinin histolojisi. (A) C3H ve (B) C57BL/6 fareler. Her iki fare suşu da 1 saat iskemi ve 3 saat reperfüzyon aldı ve doku 10x büyütmede gösterildi. 40x büyütme iç kısımda gösterilir. Her iki suşta da nötrofilik infiltrasyon gözlendi, C3H suşu daha önce bildirildiği gibi C57BL / 6'ya kıyasla belirgin şekilde daha fazla inflamasyon seviyeleri gösterdi12. Ölçek çubuğu 200 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: En sık kullanılan üç fare deneysel akciğer IR hasarı (LIRI) modelinin avantajlarının (mavi metin) ve dezavantajlarının (kırmızı metin) karşılaştırılması. Bu karşılaştırma, saf akciğer IR'sini incelemek için ideal model olarak ventilasyonlu akciğer IR'sinin (bu makalede tanımlanmıştır) seçimini vurgulamaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale, Dodd-o ve ark.9 tarafından geliştirilen ventilasyonlu akciğer IR modelinin uygulanmasında yer alan adımları detaylandırmaktadır. Bu model, izolasyonda akciğer IR'sinden inflamasyonun üretilmesi ve çözülmesinde rol oynayan moleküler yolakların tanımlanmasına yardımcı olmuştur 14,15,16,17, birlikte var olan enfeksiyon ile kombinasyon halinde akciğer IR 18 ve bağırsak-akciğer ekseni ile ilişkili akciğer IR'si ve bağırsak mikrobiyomunun katkısı 13,18,19 . Teknik olarak daha zor olsa da, mevcut model, kesintiye uğramış siklik akciğer enflasyonu ve hipoksisinin bileşik etkileri olmadan akciğer IR'sinin değerlendirilmesine izin vermektedir. Ayrıca, akciğer hasarına yol açabilen ex vivo perfüzyon modelinin aksine, mekanik ventilasyon maruziyet süresini en aza indirir20.
Yöntemin sınırlamaları: Fare trakeası, pozitif son ekspiratuar basıncın (PEEP) akciğerlerin genişlemesine izin verecek ve ETT için rahat bir uyum sağlayacak kadar konik olsa da, akciğer mekaniği ve akış hacmi döngü ölçümleri, geri dönüşümlü orotrakeal entübasyonun bu versiyonuyla mümkün olmayabilir. Bu akciğer fizyolojisi ölçümleri, bu yöntemin aksine, hayatta kalma akciğer cerrahisi ile uyumsuz olan bir trakeotomi gerektirebilir. Geri dönüşümlü orotrakeal entübasyon fareler tarafından iyi tolere edilir ve paralitiklerin yokluğunda bile, dakika ventilasyonunun (MV = gelgit hacmi x solunum hızı) nefes alarak doğal CO2 tahrikini önleyecek kadar yüksek olması koşuluyla (yani, apneik eşiğin hemen ötesinde) çok az fare-ventilatör asenkronu vardır.
Bu işlemin iskemi-reperfüzyon (IR) kısmı ile ilgili birkaç husus vardır. İlk olarak, IR prosedürü akciğere mümkün olduğunca az fiziksel travma ile yapılmalıdır. Mekanik ventilasyonu duraklatmanızı ve göğüs boşluğuna girerken farenin kendiliğinden nefes almasına izin vermenizi öneririz. Negatif basınçlı ventilasyon, cerrahın ikinci veya üçüncü kaburgayı kavraması ve göğsüne #11 neşter bıçağı ile dikkatlice girerken akciğerden uzaklaştırması ile birlikte, akciğere neşterle zarar verme şansını azaltacaktır. Alternatif olarak, eğri yukarı bakacak şekilde konumlandırılmış # 12 kavisli bir neşter bıçağı kullanmanın, göğüs boşluğuna daha dikkatli bir giriş yapılmasına izin verdiğini ve potansiyel olarak altta yatan sol akciğer tepe yüzeyindeki yaralanmayı azalttığını bulduk. Ek olarak, sol PA ve bronş arasındaki bağlantı, hiluma daha yakın daha az güvenlidir ve bu iki yapı arasındaki ultra ince forsepslerin geçişini kolaylaştırır.
Bir sonraki kritik adım, PA'yı bir dikiş bağı ile çevrelemek için sol PA'yı aşağıdaki bronştan izole etmektir. Akciğer tepesine travmayı önlemek için bu adımın dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi önemlidir. PA ve bronşa erişmek için yer değiştirmesi veya geri çekilmesi gereken sol akciğer miktarını en aza indirmek için göğüs kafesine mümkün olduğunca sefalad girmenizi öneririz. Akciğerin künt travmayı sürdüren herhangi bir kısmı, izole IR yaralanması için değerlendirme dışı bırakılmalıdır. Genellikle, steril akciğer IR hasarının son analizi için akciğerleri toplarken sol akciğerin tepesi eksize edilir. Akciğerin tepe noktasının yaralanması, kanama punktasının veya kanlı renk değişikliğinin varlığı nedeniyle ameliyat sırasında görselleştirilebilir.
PA ve aşağıdaki bronş arasında, arteri sütür bağı ile çevrelemek için kırılması gereken bir bağ dokusu tabakası vardır. Sol PA'yı yukarı doğru kavrarken ve çekerken (yani, göğüs kafesine doğru ve bronştan uzağa) ne kadar gerginliğe izin verildiğini öğrenmek, sol eldeki düz ince forsepsleri kavrayan tırtıksız, zarar vermeyen kabı kullanmak, ustalaşmak için önemli bir ilk adımdır. Sol PA şaşırtıcı miktarda gerginliği tolere edebilir ve yukarı doğru çekilirken gerilebilir. Görme alanının büyütülmesini maksimuma çıkarmayı ve odağı ayarlamayı yararlı buluyoruz, böylece potansiyel alan (PA'yı bronşa yapıştıran beyaz bir bağ dokusu çizgisi) ultra ince forsepslerle (sağ elde tutulan) birlikte net ve keskin bir şekilde görselleştirilebilir. Alanın odakta kalması için, sol PA'yı bronştan yukarı ve uzağa çekerken sol elin cerrahi yüzeyde stabilize edilmesi önemlidir. Ultra ince forsepsler daha sonra iki yapı arasındaki boşlukta geçirilebilir. Kapalı uçlar gerçek bir direnç olmadan kolayca geçmelidir ve sol PA'nın diğer tarafında bir kez görüldüğünde, dikiş malzemesinin geçişi için daha fazla alan yaratmak için uçlar yavaşça açılabilir. Bunun, uçların malzemede yırtılıp yırtılmadığını gözlemlemek için kapalı uçlardan steril bir alkollü çubuk çekilerek hızlı bir şekilde belirlenebilen tamamen hasarsız ultra ince forseps kullanılarak yapılması çok önemlidir. Hasar uçları, forsepslerin cerrahi mikroskobun maksimum büyütmesi altında açılıp kapatılmasıyla da tanımlanabilir.
Sol PA veya sol ana bronşta meydana gelen hasarı tespit etmek kolaydır. Sol PA'nın hasar görmesi, görme alanının kanla taşmasına neden olur ve hasar PA'nın kendisinde bir delik açarsa, kurtarılamayan bir ameliyatla sonuçlanabilir. Özellikle, PA üzerinde, ultra ince forseps hareketi sırasında yaralanabilecek yüzey mikroskobik kan damarları vardır ve ortaya çıkan kanı emmek için tarlanın üzerine kuru steril pamuk uçlu bir çubuk yerleştirilerek potansiyel olarak yönetilebilir. Kanama durursa, prosedüre devam edilebilir. Sol ana bronştaki hasar her zaman kurtarılamayan bir durumdur, çünkü hava yolu hasarını onarmanın basit veya hızlı bir yolu yoktur.
PA'yı altta yatan bronştan ayırma adımı, başlangıçta zamanın baskısı veya kardiyak aktivitenin ve neden olduğu hareketin dikkatinin dağılması olmadan ölü bir fare üzerinde uygulanabilir. Ek olarak, sol PA'daki kanın durağanlığı, daha kolay görselleştirilmesini sağlar (kalın ve dolgun damar) ve yine de yaralanmayan düz PA forsepsleri tarafından alınabilmesini sağlar. Sol bronştaki hasarı tespit etme yeteneği hala mümkündür, çünkü sol akciğerin ventilasyonu, sol akciğere sağlam bir iletken hava yolunun varlığını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu uygulama durumu, kayma düğümünün oluşturulmasını mükemmelleştirmek için de kullanılabilir.
Sonlu bir oklüzyon süresi vardır, bunun ötesinde kayma notunun çıkarılmasından sonra spontan reperfüzyon garanti edilmez. Pilot çalışmalarda, bu 6 ila 10 saat arasında bir yerde gerçekleşir. Bunun ötesinde, kayma düğümünün çıkarılmasından hemen sonra reperfüzyon daha az meydana gelir. İskemik dönem uzadıkça, reperfüzyon, kan akışını yeniden sağlamak için kayma notunun çıkarılmasından sonra PA'nın manipülasyonunu gerektirir.
Bu makalenin beş ortak yazarından, bu fare cerrahi modelini uyguladıkları dönemde bu prosedürü öğrenme, mükemmelleştirme, sorun giderme ve iyileştirme konusundaki kolektif deneyimlerini temsil eden aşağıdaki gözlemler elde edilmiş ve aşağıdaki noktalarda özetlenmiştir:
Ortalama olarak, bu cerrahi prosedürde ustalaşmak 1-3 ay sürdü. Bir prosedürcü, farklı prosedürlerle kolay hale gelmek için yaklaşık 50 ameliyat gerektiğini tahmin ediyor.
İşlemin başlangıcındaki başarı oranı %20-%40 idi. İşlemi düzenli ve aşinalıkla uyguladıktan sonra başarı oranı %80-%90'lara yükselmiştir.
Ameliyatın en zor kısmı, oybirliğiyle ultra ince forsepslerin sol PA ve sol bronş arasında geçmesi ve daha sonra forseps ile sütür monofilamentinin yakalanması ve iki yapı arasında geçmesiydi.
PA ve sol ana gövde bronşu arasındaki monofilamentin geçişi sırasındaki hatalar, sol PA'nın felaket kanaması veya sol ana bronşta geri dönüşümsüz yaralanma ile kurtarılamaz bir ameliyata yol açabilir.
1 tek günde yapılabilecek maksimum ameliyat sayısının 10 (yaklaşık 35-45 dakika / ameliyatta) olduğu tahmin edilirken, prosedürel konfor ve cerrahi başarı için ideal sayı beş veya altı idi.
Diğer çeşitli ipuçları ve öneriler şunları içerir:
Sabit el pozisyonunu korumak için ameliyat gününe başlamadan önce aşırı kafeinden kaçının.
Dikiş sol PA ve sol ana bronş arasında geçirilirken prosedürün bir kısmı boyunca mikroskoptaki büyütmeyi maksimuma çıkarın.
Sol PA ve sol ana bronş arasında boşluk yaratmak için Dumont forsepslerini ilerletirken nazik ve kademeli / artımlı hareketler kullanın.
Tüm kritik adımları gerçekleştirirken cerrahi yüzeydeki elleri stabilize edin.
Ventilatördeki solunum hızının, özellikle prosedürün anahtar/kritik kısımları (sol PA ile sol ana bronş arasında geçen dikiş) sırasında spontan nefesleri önleyecek kadar yüksek olduğundan emin olun.
Ameliyatları gerçekleştirmek için sessiz ve rahatsız edilmemiş bir ortam, odaklanmış ve dikkati dağılmamış kalmak için çok önemlidir.
Şekil 2 , bu modeli akciğer IR hasarının alternatif modelleriyle karşılaştırmaktadır. Bu ventilasyonlu akciğer iskemisi reperfüzyon modeli, atelektazi, hipoksi ve mekanik ventilasyonu en aza indirmenin avantajlarını sunar. Önemli olarak, bir sağkalım ameliyatı olarak, ikinci yaralanma modelleri (örneğin, deneysel pnömoni modelleri) ve yaralanmanın çözümünün analizi ile uyumludur.
Sonuç olarak, akciğerde saf IR hasarında rol oynayan mekanizmalar ve hücresel yollar hakkında değerli bilgiler sağlayabileceğine inandığımız akciğer iskemisi reperfüzyon hasarının oluşturulmasını içeren bir sağkalım cerrahisini tanımladık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kaliforniya Üniversitesi San Francisco ve San Francisco Genel Hastanesi, Anestezi ve Perioperatif Bakım Bölümü'nün bölüm desteği ve ayrıca bir NIH R01 ödülü (AP'ye): 1R01HL146753 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fiber Optic Light Pipe | Cole-Parmer | UX-41720-65 | Fiberoptic light pipe |
| Fiber Optic Light Source | AmScope | SKU: CL-HL250-B | Light source for fiberoptic lights |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific, Inc. | No.5-1450 | Bead Sterilizer |
| Heating Pad | AIMS | 14-370-223 | Alternative option |
| Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper) | WAHL home products | SKU 09854-600B | To remove mouse hair on surgical site |
| Microscope | Nikon | SMZ-10 | Other newer options available at the company website |
| MiniVent Ventilator | Havard Apparatus | Model 845 | Mouse ventilator |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | Clean tools that been used in operation |
| Warming Pad | Kent Scientific | RT-0501 | To keep mouse warm while recovering from surgery |
| Weighing Scale | Cole-Parmer | UX-11003-41 | Weighing scale |
| Surgery Tools | |||
| 4-0 Silk Suture | Ethicon | 683G | For closing muscle layer |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Industry | EP8734H | Using for making a slip knot of left pulmonary artery |
| Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use) | Aspen Surgical | 372611 | For entering thoracic cavity (option 1) |
| Bard-Parker (12) Scalpel | Aspen Surgical | 372612 | For entering thoracic cavity (option 2) |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | Muscle/rib holding forceps |
| Magnetic Fixator Retraction System | FST | 1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08) |
Small Animal Retraction System |
| Monoject Standard Hypodermic Needle | COVIDIEN | 05-561-20 | For medication delivery IP |
| Narrow Pattern Forceps | FST | 11002-12 | Skin level forceps |
| Needle holder/Needle driver | FST | 12565-14 | for holding needles |
| Needles | BD | 305110 | 26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too) |
| PA/Vessel Dilating forceps | FST | 00125-11 | To hold PA; non-damaging gripper |
| Scissors | FST | 14060-09 | Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery |
| Ultra Fine Dumont micro forceps | FST | 11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm) | For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus |
| Reagents | |||
| 0.25% Bupivacaine | Hospira, Inc. | 0409-1159-02 | Topical analgesic used during surgical wound closure |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg. |
| Buprenorphine | Covetrus North America | 59122 | Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg |
| Eye Lubricant | BAUSCH+LOMB | Soothe Lubricant Eye Ointment | Relieves dryness of the eye |
| Povidone-Iodine 10% Solution | MEDLINE INDUSTRIES INC | SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic) | Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery |
| Materials | |||
| Alcohol Swab | BD brand | BD 326895 | for sterilzing area of injection and surgery |
| Plastic film | KIRKLAND | Stretch-Tite premium | Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective) |
| Rodent Surgical Drapes | Stoelting | 50981 | Sterile field or drape for surgical field |
| Sterile Cotton Tipped Application | Pwi-Wnaps | 703033 | used for applying eye lubricant |
| Top Sponges | Dukal Corporaton | Reorder # 5360 | Stopping bleeding from skin/muscle |
References
- Shen, H., Kreisel, D., Goldstein, D. R.
- Fiser, S. M., et al. Lung transplant reperfusion injury involves pulmonary macrophages and circulating leukocytes in a biphasic response. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 121 (6), 1069-1075 (2001).
- Lama, V. N., et al. Models of lung transplant research: A consensus statement from the National Heart, Lung, and Blood Institute workshop. JCI Insight. 2 (9), 93121 (2017).
- Miao, R., Liu, J., Wang, J. Overview of mouse pulmonary embolism models. Drug Discovery Today: Disease Models. 7 (3-4), 77-82 (2010).
- Mira, J. C., et al. Mouse injury model of polytrauma and shock. Methods in Molecular Biology. 1717, 1-15 (2018).
- Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: Tricks of the trade. The Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Faraday, N., Pearse, D. B. Effect of ischemia and reperfusion without airway occlusion on vascular barrier function in the in vivo mouse lung. Journal of Applied Physiology. 95 (5), 1971-1978 (2003).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702 (2011).
- Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Welsh-Servinsky, L. E., Tankersley, C. G., Pearse, D. B. Strain-specific differences in sensitivity to ischemia-reperfusion lung injury in mice. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1590-1595 (2006).
- Prakash, A., et al. Lung ischemia reperfusion (IR) is a sterile inflammatory process influenced by commensal microbiota in mice. Shock. 44 (3), 272-279 (2015).
- Prakash, A., et al. Alveolar macrophages and toll-like receptor 4 mediate ventilated lung ischemia reperfusion injury in mice. Anesthesiology. 117 (4), 822-835 (2012).
- Dodd-o, J. M., et al. The role of natriuretic peptide receptor-A signaling in unilateral lung ischemia-reperfusion injury in the intact mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (4), 714-723 (2008).
- Prakash, A., Kianian, F., Tian, X., Maruyama, D. Ferroptosis mediates inflammation in lung ischemia-reperfusion (IR) sterile injury in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201, (2020).
- Tian, X., et al. NLRP3 inflammasome mediates dormant neutrophil recruitment following sterile lung injury and protects against subsequent bacterial pneumonia in mice. Frontiers in Immunology. 8, 1337 (2017).
- Tian, X., Hellman, J., Prakash, A. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Frontiers in Microbiology. 10, 159 (2019).
- Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids' immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 65-78 (2021).
- Dodd-o, J. M., et al. Interactive effects of mechanical ventilation and kidney health on lung function in an in vivo mouse model. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (1), 3-11 (2009).
