Summary
Un modello chirurgico murino per creare lesioni da ischemia polmonare sinistra (IR) mantenendo la ventilazione ed evitando l'ipossia.
Abstract
Il danno da ischemia da riperfusione (IR) deriva frequentemente da processi che comportano un periodo transitorio di interruzione del flusso sanguigno. Nel polmone, l'IR isolata consente lo studio sperimentale di questo specifico processo con ventilazione alveolare continua, evitando così i processi dannosi composti di ipossia e atelettasia. Nel contesto clinico, il danno da ischemia da riperfusione polmonare (noto anche come IRI polmonare o LIRI) è causato da numerosi processi, inclusi ma non limitati a embolia polmonare, trauma emorragico rianimato e trapianto di polmone. Attualmente ci sono limitate opzioni di trattamento efficaci per LIRI. Qui, presentiamo un modello chirurgico reversibile di IR polmonare che coinvolge prima l'intubazione orotracheale seguita da ischemia unilaterale del polmone sinistro e riperfusione con ventilazione alveolare preservata o scambio gassoso. I topi subiscono una toracotomia sinistra, attraverso la quale l'arteria polmonare sinistra viene esposta, visualizzata, isolata e compressa utilizzando un nodo reversibile. L'incisione chirurgica viene quindi chiusa durante il periodo ischemico e l'animale viene risvegliato ed estubato. Con il topo che respira spontaneamente, la riperfusione viene stabilita rilasciando il nodo scivoloso attorno all'arteria polmonare. Questo modello di sopravvivenza clinicamente rilevante consente la valutazione del danno IR polmonare, della fase di risoluzione, degli effetti a valle sulla funzione polmonare, nonché di modelli a due colpi che coinvolgono la polmonite sperimentale. Sebbene tecnicamente impegnativo, questo modello può essere padroneggiato nel corso di poche settimane o mesi con un eventuale tasso di sopravvivenza o successo dell'80% -90%.
Introduction
La lesione da riperfusione ischemia (IR) può verificarsi quando il flusso sanguigno viene ripristinato in un organo o in un letto di tessuto dopo un certo periodo di interruzione. Nel polmone, l'IR può verificarsi isolatamente o in associazione con altri processi dannosi come infezione, ipossia, atelettasia, volutrauma (da alti volumi correnti durante la ventilazione meccanica), barotrauma (picchi elevati o pressioni sostenute durante la ventilazione meccanica) o contusioni polmonaricontundenti (non penetranti) 1,2,3 . Rimangono diverse lacune nella nostra conoscenza dei meccanismi di LIRI e dell'impatto dei processi concomitanti (ad esempio, infezione) sugli esiti LIRI, e anche le opzioni di trattamento per LIRI sono limitate. È necessario un modello in vivo di LIRI puro per identificare la fisiopatologia del danno IR polmonare in isolamento e per studiare il suo contributo a qualsiasi processo multi-hit di cui il danno polmonare è una componente.
I modelli IR polmonari murini possono essere utilizzati per studiare la fisiopatologia polmonare specifica di più processi, tra cui il trapianto polmonare3, l'embolia polmonare4 e la lesione polmonare a seguito di trauma emorragico con rianimazione5. I modelli attualmente utilizzati includono il trapianto polmonare chirurgico6, il clampaggio ilare7, la perfusione polmonare ex vivo 8 e il polmone ventilato IR9. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per un modello IR polmonare ventilato murino di danno polmonare sterile. Ci sono molteplici vantaggi di questo approccio (Figura 2), tra cui che induce ipossia minima e atelettasia minima, ed è un modello di chirurgia di sopravvivenza che consente studi a lungo termine.
I motivi per scegliere questo modello di LIRI rispetto ad altri modelli come il clampaggio ilare e i modelli di perfusione ex vivo sono i seguenti: questo modello riduce al minimo i contributi infiammatori di atelettasia, ventilazione meccanica e ipossia; preserva la ventilazione ciclica; mantiene intatto un sistema immunitario circolatorio in vivo che può rispondere alla lesione IR; Infine, come procedura di sopravvivenza, consente l'analisi a lungo termine dei meccanismi di generazione di lesioni secondarie (modelli 2-hit) e risoluzione delle lesioni. Nel complesso, riteniamo che questo modello IR polmonare ventilato fornisca la forma "più pura" di lesione IR che possa essere studiata sperimentalmente.
Altre pubblicazioni hanno descritto l'uso dell'intubazione orotracheale dei topi per eseguire iniezioni o installazioni IT10,11, ma non come punto di partenza per un intervento chirurgico di sopravvivenza come in questo modello. Il posizionamento di un tubo orotracheale consente l'esecuzione della chirurgia polmonare consentendo il collasso del polmone operativo. Consente inoltre il regonfiamento del polmone alla fine della procedura, che è fondamentale per il pneumotorace e per la capacità del topo di tornare alla ventilazione spontanea al termine delle procedure. Infine, la rimozione del tubo orotracheale assicurato è una procedura semplice che, a differenza di una tracheotomia invasiva, è compatibile con un intervento chirurgico di sopravvivenza. Ciò consente studi di ricerca a lungo termine incentrati sulla comprensione della progressione e della risoluzione del LIRI e dei disturbi associati, nonché sulla creazione di modelli di lesioni croniche.
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Protocol
Tutte le procedure e le fasi descritte di seguito sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'Università della California di San Francisco. È possibile utilizzare qualsiasi ceppo di topo, sebbene alcuni ceppi abbiano una risposta infiammatoria IR polmonare più robusta rispetto ad altri12. I topi che hanno circa 12-15 settimane di età (30-40 g) o più anziani tollerano e sopravvivono alla chirurgia IR polmonare meglio dei topi più giovani. Sia i topi maschi che le femmine possono essere utilizzati per questi interventi chirurgici.
1. Protocollo di intubazione del topo
- Anestesia e preparazione per l'intubazione
- Pulire l'addome del topo con un tampone di etanolo. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo (250-400 mg/kg). Valutare la profondità appropriata dell'anestesia dalla mancanza di riflesso di ritiro del pedale. Posizionare un unguento lubrificante per gli occhi ora o più tardi (passaggio 2.1.4).
NOTA: Per questa procedura, il tribromoetanolo (e l'etomidato come opzione alternativa) fornisce un piano anestetico stabile senza influire sulle condizioni emodinamiche richieste per questo intervento chirurgico. Questo anestetico viene utilizzato solo una volta per evitare il rischio di aderenze peritoneali. Anche l'isoflurano potrebbe essere usato, ma non lo usiamo qui. Il praticante è libero di usare qualsiasi ricetta anestetica ritenga opportuna. - Posizionare il topo anestetizzato su un supporto per intubazione o un supporto di plastica in posizione supina, sospeso dagli incisivi superiori su suture 4-0 ad anello (seta o altro) su due ancoraggi di supporto.
- Per mantenere il topo immobilizzato durante la procedura di intubazione, fissare liberamente la parte inferiore del torace (o entrambi gli arti superiori) alla piattaforma.
- Posizionare delicatamente la luce flessibile a fibre ottiche sulla trachea del mouse, leggermente al di sotto delle corde vocali. Regolare il livello di illuminazione in modo che sia visibile solo un campo scuro quando si guarda nell'orofaringe del topo, ad eccezione della luce rossa che emana da sotto le corde vocali, dimostrando il bersaglio per l'eventuale posizionamento del tubo endotracheale. Si noti che i movimenti delle corde vocali dovrebbero essere visibili ad occhio nudo o, se necessario, sotto ingrandimento.
- Pulire l'addome del topo con un tampone di etanolo. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo (250-400 mg/kg). Valutare la profondità appropriata dell'anestesia dalla mancanza di riflesso di ritiro del pedale. Posizionare un unguento lubrificante per gli occhi ora o più tardi (passaggio 2.1.4).
- Procedura di intubazione
- Tenere le pinzette con la mano dominante e usarle per afferrare delicatamente e tirare la lingua fuori dalla cavità orale.
- Aprire la mascella inferiore usando una pinza tenuta dalla mano non dominante, quindi spingere la pinza nella laringe per sollevare delicatamente l'epiglottide. In questo momento, rilascia la lingua dalle pinzette.
- Cerca le corde vocali. Dovrebbero aprirsi e chiudersi secondo ogni respiro. Tenendo la cannula con il filo guida precaricato, inserire la punta del filo attraverso le corde vocali.
- Facendo molta attenzione a non muovere il filo tenendo una porzione di esso che si trova all'esterno della cannula ma appena sopra le corde vocali, ritirare la cannula, lasciando solo il filo in posizione con la sua estremità distale all'interno della trachea.
- A questo punto, eseguire una seconda visualizzazione delle corde vocali per confermare che la punta distale del filo rimane passata attraverso le corde vocali illuminate e nella trachea e non si trova nell'esofago spento.
- Tenere il filo fuori dalla bocca con la pinza curva nella mano sinistra, stabilizzata contro una superficie dura, e far avanzare con attenzione il catetere 20G con ali di nastro sul filo.
- Una volta che l'estremità distale del filo emerge dall'estremità posteriore del catetere 20G o del tubo endotracheale, tenere quell'estremità con la pinza curva e far avanzare dolcemente il catetere 20G nella trachea.
- Rimuovere con cautela il filo dall'estremità distale del catetere 20G con la pinza curva senza rimuovere il posizionamento del catetere.
- Collegare brevemente il catetere al ventilatore prima di fissarlo per confermare il corretto posizionamento nella trachea e non nell'esofago. Confermare il posizionamento tracheale osservando i movimenti bilaterali della parete toracica dipendenti dalla ventilazione meccanica e l'assenza di gonfiaggio dello stomaco.
- Post-intubazione
- Scollegare il catetere dal ventilatore. Fissare le ali del nastro (attaccate al catetere) attraverso il labbro inferiore del mouse utilizzando una sutura vicrylica 4-0 per fissare saldamente il tubo endotracheale (ETT) al mouse durante tutte le successive procedure / manipolazioni.
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare nastro di seta o altro nastro per fissare l'ETT, tuttavia è necessario prestare attenzione per evitare lo spostamento dell'ETT durante il movimento dell'animale dalla slitta di intubazione alla superficie chirurgica. - Rimuovere con cautela il mouse dalla slitta di intubazione. Collegare brevemente il catetere al ventilatore impostato a un volume corrente di 0,2-0,225 ml e una frequenza respiratoria di 120-150 respiri al minuto per confermare il corretto posizionamento tracheale del tubo orotracheale e quindi disconnettere con il topo che respira spontaneamente attraverso il tubo orotracheale.
- Non lasciare l'animale incustodito da questo punto in poi fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la sdraiata sternale alla fine della procedura.
- Scollegare il catetere dal ventilatore. Fissare le ali del nastro (attaccate al catetere) attraverso il labbro inferiore del mouse utilizzando una sutura vicrylica 4-0 per fissare saldamente il tubo endotracheale (ETT) al mouse durante tutte le successive procedure / manipolazioni.
2. Ischemia polmonare e protocollo chirurgico di riperfusione (IR)
- Analgesia e preparazione del sito chirurgico
- Pulire l'addome del topo con un tampone etanolo e iniettare buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per via intraperitoneale.
- Rasare i capelli sulla zona del torace sinistro fino alla scapola sinistra. Rimuovere i peli rasati in eccesso con tamponi imbevuti di alcool.
NOTA: I passaggi 2.1.1 e 2.1.2 possono essere eseguiti anche prima dell'intubazione se vi è preoccupazione per lo spostamento dell'ETT quando fissato con nastro di seta. - Posizionare il mouse su un pad riscaldante in posizione laterale sinistra o ruotata di 3/4 e collegare il tubo tracheale sul ventilatore con un volume corrente di 0,2-0,225 ml (~ 8 mg / kg) e una frequenza respiratoria di 120-150 respiri al minuto. Non utilizzare ossigeno supplementare per questa procedura.
- Applicare il lubrificante per gli occhi con un tampone sterile di cotone. Ruotare il mouse a 3/4 del lato sinistro verso l'alto e immobilizzare tutti e quattro gli arti e la coda con nastro da laboratorio.
- Disinfettare la zona della pelle rasata e la pelliccia circostante con povidone-iodio e attendere che la soluzione si asciughi. Quindi coprire il campo chirurgico con un drappo sterile o un film plastico trasparente e creare un'apertura rettangolare nel drappo o nel film plastico per il campo chirurgico.
- Procedura chirurgica
- Confermare il livello appropriato di anestesia (fornito dalla somministrazione di tribromoetanolo e buprenorfina come descritto in precedenza) testando la risposta al pizzico del piede.
- Usando un paio di forbici affilate e un paio di pinze più grandi (pinze a pattern stretto o simili), fai un'incisione cutanea trasversale di 2 cm sotto l'angolo inferiore della scapola nel torace laterale sinistro. Usa le forbici e un paio di pinze più fini (pinze extra fini o simili) per tagliare lo strato muscolare e sezionare fino alle costole.
- Identificare il secondo spazio intercostale e tenere la seconda costola con la pinza extra fine. Tirando la costola verso l'alto, utilizzare una lama sterile #11 o #12 (curva) per bisturi (senza maniglia necessaria) per entrare nello spazio pleurico separando e tagliando attraverso i muscoli intercostali del 2 ° -3° spazio. Prendi in considerazione la sospensione della ventilazione per ridurre le lesioni all'apice del polmone sinistro.
- Inserire tre divaricatori sterilizzati. Utilizzare il riavvolgitore cefalo più piccolo / più stretto lungo l'orientamento delle costole, il divaricatore di medie dimensioni a sinistra lungo la 2 ° costola e il più grande divaricatore a destra lungo la superficie della 3° costola.
- Aprire il torace con una retrazione lenta e progressiva utilizzando le corde elastiche del divaricatore. Esporre e identificare l'arteria polmonare sinistra (PA) spostando l'apice del polmone sinistro con un tampone sterile di cotone.
- Utilizzare le micro pinze, le pinze ultrafini nella mano destra e le pinze dilatatorie PA o vaso nella mano sinistra, per esporre delicatamente e creare il campo in cui il PA sinistro e il bronco sono entrambi visibili.
- Usando la pinza PA, prendi il PA sinistro e tira delicatamente ma saldamente verso l'alto e cefalade per visualizzare il bronco trasparente sottostante. Aumentare l'ingrandimento sul microscopio a dissezione (vedere l'elenco delle apparecchiature per maggiori dettagli) a questo punto al massimo (2x).
NOTA: Sterilizzare tutte le apparecchiature prima dell'uso. Inoltre, per mantenere la sterilità, solo le punte degli strumenti chirurgici dovrebbero entrare nel campo chirurgico sterile. - Mentre si ritrae il PA lontano dal bronco, passare con attenzione la pinza ultrafine chiusa attraverso lo spazio tra il PA sinistro e il bronco. Quindi, usa queste pinze per tenere e tirare un 7-0 o 8-0 sutura di prolene attraverso lo spazio tra l'arteria polmonare sinistra (sopra) e il bronco (sotto).
- Circondare il PA sinistro legando un nodo per creare un'occlusione nel PA. L'interruzione del flusso sanguigno è facilmente visualizzabile al microscopio. Questo segna l'inizio del periodo ischemico.
- Esternare l'estremità libera del nodo attraverso un diverso punto di ingresso nel torace anteriore sinistro utilizzando un ago 24G-28G e fissare l'estremità della sutura con un piccolo pezzo di nastro adesivo per una più facile identificazione in seguito.
- Rigonfiare il polmone per espellere quanta più aria possibile dalla cavità toracica utilizzando una valvola / tubo PEEP sul ventilatore del roditore. Quindi, chiudere la gabbia toracica con due suture di nylon 4-0 interrotte.
- Chiudere lo strato muscolare e sottocutaneo con una sutura di nylon 4-0 in esecuzione. Quindi applicare due o tre gocce di bupivacaina topica (0,5%) all'incisione. Utilizzare una sutura di nylon 4-0 per chiudere lo strato di pelle con una sutura corrente.
- Assistenza post-operatoria
- Quando la ventilazione spontanea è ripresa, scollegare il tubo endotracheale dal ventilatore ed estubare il topo.
- Posizionare il mouse sul pad riscaldante per mantenere la temperatura corporea durante il recupero post-anestesia.
- Monitorare attentamente il mouse durante il recupero dall'anestesia generale. Tirare delicatamente lo slipknot esternalizzato alla fine del periodo ischemico (30 min o 1 h).
- Spostare il mouse dal pad riscaldante a una gabbia una volta che ha mostrato segni di recupero: auto-raddrizzamento e / o movimento.
- Dopo il periodo di riperfusione (1 ora o 3 ore), eutanasia l'animale e raccogliere il sangue mediante puntura cardiaca e tessuto polmonare per ulteriori analisi. Per 1 ora di riperfusione, raccogliere plasma per ELISA, tessuto per RNA e analisi delle proteine; Per 3 ore di riperfusione, raccogliere inoltre il tessuto per l'istologia.
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Representative Results
Infiammazione generata da lesione unilaterale ventilata da ischemia polmonare sterile (IR): dopo 1 ora di ischemia, abbiamo osservato un aumento dei livelli di citochine nel siero e all'interno del tessuto polmonare sia mediante ELISA che qRT-PCR che hanno raggiunto il picco a 1 ora dopo la riperfusione e sono tornati rapidamente al basale entro 12-24 ore dopo la riperfusione13. Per i campioni raccolti a 3 ore dopo la riperfusione, abbiamo osservato un'intensa infiltrazione di neutrofili all'interno del tessuto polmonare sinistro e abbiamo notato che l'intensità dell'infiammazione dipendeva dal ceppo di topo utilizzato (Figura 1). In particolare, l'infiammazione che si genera in assenza di un processo infettivo coesistente o successivo si risolve gradualmente e i polmoni ritornano alla loro normale architettura polmonare (per istopatologia) con efferocitosi o uscita di neutrofili dai polmoni danneggiati entro 12-24 ore dopo la riperfusione13. Da notare, abbiamo osservato un'infiammazione lieve ma rilevabile, che era in gran parte neutrofila ed è stata osservata anche nel polmone destro non operatorio, che ipotizziamo sia dovuta a lesioni da iperperfusione14.
La raccolta di campioni di tessuto per questo modello IR polmonare non è diversa da quella per altri modelli IR polmonari: il sangue può essere raccolto per la preparazione del plasma tramite puntura cardiaca o incannulamento IVC; Il tessuto polmonare può essere raccolto per la preparazione di proteine o RNA e quindi per ulteriori analisi mediante western blot, ELISA o qPCR.
Figura 1: Istologia delle sezioni polmonari in topi wild type di due ceppi diversi. (A) topi C3H e (B) C57BL/6. Entrambi i ceppi di topi hanno ricevuto 1 ora di ischemia e 3 ore di riperfusione e il tessuto è mostrato con un ingrandimento 10x. L'ingrandimento 40x è mostrato nel riquadro. L'infiltrazione neutrofila è stata osservata in entrambi i ceppi, con il ceppo C3H che ha mostrato livelli marcatamente maggiori di infiammazione rispetto a C57BL / 6 come riportato in precedenza12. La barra della scala è di 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Confronto tra vantaggi (testo blu) e svantaggi (testo rosso) dei tre modelli di IR polmonare sperimentale (LIRI) più comunemente usati. Questo confronto evidenzia la scelta dell'IR polmonare ventilato (descritto in questo manoscritto) come modello ideale per lo studio dell'IR polmonare pura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo manoscritto descrive in dettaglio i passaggi coinvolti nell'esecuzione del modello IR polmonare ventilato sviluppato da Dodd-o et al.9. Questo modello ha contribuito a identificare i percorsi molecolari coinvolti nella generazione e risoluzione dell'infiammazione da IR polmonare in isolamento 14,15,16,17, IR polmonare in combinazione con infezione coesistente 18 e IR polmonare in relazione all'asse intestino-polmone e al contributo del microbioma intestinale13,18,19 . Sebbene tecnicamente più impegnativo, il modello attuale consente la valutazione dell'IR polmonare senza gli effetti combinati dell'inflazione polmonare ciclica interrotta e dell'ipossia. Inoltre, riduce al minimo il periodo di esposizione ventilatoria meccanica, a differenza del modello di perfusione ex vivo, che a sua volta può portare a lesioni polmonari20.
Limitazioni del metodo: Mentre la trachea del topo è abbastanza affusolata che la pressione espiratoria positiva (PEEP) consente l'espansione dei polmoni e fornisce una perfetta aderenza per l'ETT, la meccanica polmonare e le misurazioni del ciclo di volume del flusso potrebbero non essere possibili con questa versione di intubazione orotracheale reversibile. Queste misurazioni della fisiologia polmonare possono richiedere una tracheotomia, che, a differenza di questo metodo, è incompatibile con un intervento chirurgico polmonare di sopravvivenza. L'intubazione orotracheale reversibile è ben tollerata dai topi, e anche in assenza di paralitici c'è pochissima asincronia topo-ventilatore a condizione che la ventilazione minuto (MV = volume corrente x frequenza respiratoria) sia sufficientemente alta da impedire che la spinta naturale guidata dalla CO2 prenda il sopravvento (cioè appena oltre la soglia apneica).
Ci sono diverse considerazioni relative alla porzione di ischemia-riperfusione (IR) di questa procedura. In primo luogo, la procedura IR deve essere eseguita con il minor trauma fisico possibile al polmone. Si consiglia di mettere in pausa la ventilazione meccanica e consentire al topo di respirare spontaneamente quando entra nella cavità toracica. La ventilazione a pressione negativa, insieme alla presa del chirurgo della seconda o terza costola e alla sua allontanazione dal polmone mentre entra con attenzione nel torace con una lama di bisturi # 11, ridurrà la possibilità di ferire il polmone con il bisturi. In alternativa, abbiamo scoperto che l'utilizzo di una lama di bisturi curva #12, posizionata in modo che la curva sia rivolta verso l'alto, consente un ingresso più attento nella cavità toracica, riducendo potenzialmente le lesioni alla superficie dell'apice del polmone sinistro sottostante. Inoltre, la connessione tra il PA sinistro e il bronco è meno sicura più vicino all'ilo, rendendo più facile il passaggio della pinza ultrafine tra queste due strutture.
Il prossimo passo critico è isolare il PA sinistro dal bronco sottostante per circondare il PA con una cravatta di sutura. È essenziale che questo passaggio sia eseguito con attenzione per evitare traumi all'apice polmonare. Si consiglia di entrare nella gabbia toracica il più cefalo possibile per ridurre al minimo la quantità di polmone sinistro che deve essere spostato o retratto per accedere alla PA e ai bronchi. Qualsiasi parte del polmone che subisce un trauma contusivo deve essere esclusa dalla valutazione per lesioni IR isolate. Spesso, l'apice del polmone sinistro viene asportato via quando si raccolgono i polmoni per l'analisi finale della lesione IR polmonare sterile. La lesione dell'apice del polmone può essere visualizzata durante l'intervento chirurgico a causa della presenza di puncta di emorragia o scolorimento sanguinante.
Tra il PA e il bronco sottostante esiste uno strato di tessuto connettivo che deve essere violato per circondare l'arteria con la cravatta di sutura. Imparare quanta tensione è consentita mentre si afferra e si tira il PA sinistro verso l'alto (cioè verso la gabbia toracica e lontano dal bronco), usando il vaso non seghettato e non dannoso che afferra una pinza piatta e fine nella mano sinistra, è un primo passo importante da padroneggiare. Il PA sinistro può tollerare una quantità sorprendente di tensione e allungamento mentre viene tirato verso l'alto. Troviamo utile aumentare l'ingrandimento del campo visivo al massimo e regolare la messa a fuoco in modo che lo spazio potenziale (una linea bianca di tessuto connettivo che aderisce il PA al bronco) possa essere visualizzato in modo chiaro e nitido insieme al forcipe ultrafine (tenuto nella mano destra). Affinché il campo rimanga a fuoco, è importante stabilizzare la mano sinistra sulla superficie chirurgica mentre si tira il PA sinistro verso l'alto e lontano dal bronco. La pinza ultrafine può quindi essere passata nello spazio tra le due strutture. Le punte chiuse dovrebbero passare facilmente senza alcuna reale resistenza, e una volta viste dall'altra parte del PA sinistro, le punte possono essere aperte delicatamente per creare ulteriore spazio per il passaggio del materiale di sutura. È fondamentale che ciò venga eseguito utilizzando una pinza ultrafine completamente non danneggiata, che può essere rapidamente determinata tirando un tampone imbevuto di alcool sterile attraverso le punte chiuse per osservare se le punte si strappano sul materiale. Le punte dei danni possono anche essere identificate aprendo e chiudendo la pinza sotto il massimo ingrandimento del microscopio chirurgico.
È facile rilevare i danni che si verificano al PA sinistro o al bronco principale sinistro mentre si tenta di separarli. Il danno alla PA sinistra provoca l'inondazione del campo visivo con sangue e può comportare un intervento chirurgico non recuperabile se il danno crea un buco all'interno del PA stesso. In particolare, ci sono vasi sanguigni microscopici di superficie sul PA che possono essere feriti durante il movimento del forcipe ultrafine e possono potenzialmente essere gestiti posizionando un tampone di cotone sterile asciutto sul campo per assorbire il sangue che appare. Se l'emorragia si interrompe, la procedura può essere ripresa. Il danno al bronco principale sinistro è sempre una situazione non recuperabile poiché non esiste un modo semplice o rapido per riparare i danni alle vie aeree.
Il passo di separare il PA dal bronco sottostante può essere inizialmente praticato su un topo morto senza la pressione del tempo o la distrazione dell'attività cardiaca e del movimento che provoca. Inoltre, la stasi del sangue nella PA sinistra consente di visualizzarlo più facilmente (vaso spesso e paffuto), e tuttavia ancora in grado di essere raccolto dal forcipe PA piatto non ferito. La capacità di rilevare danni nel bronco sinistro è ancora possibile, poiché la ventilazione del polmone sinistro può essere utilizzata per valutare la presenza di una via aerea conduttrice intatta al polmone sinistro. Questa situazione di pratica può essere utilizzata anche per perfezionare la creazione dello slipknot.
Esiste una durata finita dell'occlusione, oltre la quale la riperfusione spontanea dopo la rimozione dello slipknot non è garantita. Negli studi pilota, questo si verifica da qualche parte tra 6 e 10 ore. Oltre a questo, la riperfusione si verifica meno immediatamente dopo la rimozione dello slipknot. Man mano che il periodo ischemico si estende, la riperfusione richiede la manipolazione del PA dopo la rimozione dello slipknot al fine di ristabilire il flusso sanguigno.
Queste seguenti osservazioni sono state ottenute da cinque co-autori di questo articolo che rappresentano la loro esperienza collettiva nell'apprendimento, perfezionamento, risoluzione dei problemi e miglioramento di questa procedura durante il periodo in cui hanno condotto questo modello chirurgico murino e sono state riassunte nei punti seguenti:
In media, ci sono voluti 1-3 mesi per padroneggiare questa procedura chirurgica. Un proceduralista ha stimato che ci vogliono circa 50 interventi chirurgici per diventare facili con le diverse procedure.
Il tasso di successo all'inizio dell'esecuzione della procedura è stato del 20% -40%. Dopo aver eseguito la procedura regolarmente e con familiarità, il tasso di successo è aumentato all'80% -90%.
La parte più difficile dell'intervento è stata all'unanimità il passaggio della pinza ultrafine tra la PA sinistra e il bronco sinistro, e poi la successiva cattura del monofilo di sutura con la pinza e il suo passaggio tra le due strutture.
Errori durante il passaggio del monofilo tra il PA e il bronco principale sinistro possono portare a un intervento chirurgico insalvabile con sanguinamento catastrofico del PA sinistro o lesioni irreversibili al bronco principale sinistro.
Il numero massimo di interventi chirurgici possibili in 1 singolo giorno è stato stimato in 10 (a circa 35-45 minuti / chirurgia), mentre il numero ideale per il comfort procedurale e il successo chirurgico era cinque o sei.
Altri suggerimenti e suggerimenti vari includono:
Evitare l'eccesso di caffeina prima di iniziare la giornata chirurgica per mantenere una posizione stabile della mano.
Aumentare l'ingrandimento sul microscopio al massimo durante la porzione della procedura quando la sutura viene passata tra il PA sinistro e il bronco principale sinistro.
Usa movimenti delicati e graduali / incrementali quando fai avanzare la pinza di Dumont per creare spazio tra il bronco sinistro e il bronco principale sinistro.
Stabilizzare le mani sulla superficie chirurgica durante l'esecuzione di tutti i passaggi critici.
Assicurarsi che la frequenza respiratoria sul ventilatore sia sufficientemente elevata da evitare respiri spontanei, specialmente durante le parti chiave/critiche della procedura (passaggio di sutura tra il PA sinistro e il bronco principale sinistro).
Un ambiente tranquillo e indisturbato per eseguire gli interventi chirurgici è essenziale per rimanere concentrati e non distratti.
La Figura 2 confronta questo modello con modelli alternativi di danno IR polmonare. Questo modello di riperfusione ventilata dell'ischemia polmonare offre i vantaggi di ridurre al minimo l'atelettasia, l'ipossia e la ventilazione meccanica. È importante sottolineare che, come chirurgia di sopravvivenza, è compatibile con i modelli di seconda lesione (ad esempio, modelli sperimentali di polmonite) e l'analisi della risoluzione della lesione.
In conclusione, abbiamo descritto un intervento chirurgico di sopravvivenza che coinvolge la creazione di danno da ischemia polmonare da riperfusione che riteniamo possa fornire preziose informazioni sui meccanismi e sui percorsi cellulari coinvolti nel danno IR puro nel polmone.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal supporto dipartimentale del Dipartimento di Anestesia e Cure Perioperatorie, dell'Università della California di San Francisco e del San Francisco General Hospital, nonché da un premio NIH R01 (ad AP): 1R01HL146753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fiber Optic Light Pipe | Cole-Parmer | UX-41720-65 | Fiberoptic light pipe |
| Fiber Optic Light Source | AmScope | SKU: CL-HL250-B | Light source for fiberoptic lights |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific, Inc. | No.5-1450 | Bead Sterilizer |
| Heating Pad | AIMS | 14-370-223 | Alternative option |
| Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper) | WAHL home products | SKU 09854-600B | To remove mouse hair on surgical site |
| Microscope | Nikon | SMZ-10 | Other newer options available at the company website |
| MiniVent Ventilator | Havard Apparatus | Model 845 | Mouse ventilator |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | Clean tools that been used in operation |
| Warming Pad | Kent Scientific | RT-0501 | To keep mouse warm while recovering from surgery |
| Weighing Scale | Cole-Parmer | UX-11003-41 | Weighing scale |
| Surgery Tools | |||
| 4-0 Silk Suture | Ethicon | 683G | For closing muscle layer |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Industry | EP8734H | Using for making a slip knot of left pulmonary artery |
| Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use) | Aspen Surgical | 372611 | For entering thoracic cavity (option 1) |
| Bard-Parker (12) Scalpel | Aspen Surgical | 372612 | For entering thoracic cavity (option 2) |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | Muscle/rib holding forceps |
| Magnetic Fixator Retraction System | FST | 1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08) |
Small Animal Retraction System |
| Monoject Standard Hypodermic Needle | COVIDIEN | 05-561-20 | For medication delivery IP |
| Narrow Pattern Forceps | FST | 11002-12 | Skin level forceps |
| Needle holder/Needle driver | FST | 12565-14 | for holding needles |
| Needles | BD | 305110 | 26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too) |
| PA/Vessel Dilating forceps | FST | 00125-11 | To hold PA; non-damaging gripper |
| Scissors | FST | 14060-09 | Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery |
| Ultra Fine Dumont micro forceps | FST | 11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm) | For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus |
| Reagents | |||
| 0.25% Bupivacaine | Hospira, Inc. | 0409-1159-02 | Topical analgesic used during surgical wound closure |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg. |
| Buprenorphine | Covetrus North America | 59122 | Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg |
| Eye Lubricant | BAUSCH+LOMB | Soothe Lubricant Eye Ointment | Relieves dryness of the eye |
| Povidone-Iodine 10% Solution | MEDLINE INDUSTRIES INC | SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic) | Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery |
| Materials | |||
| Alcohol Swab | BD brand | BD 326895 | for sterilzing area of injection and surgery |
| Plastic film | KIRKLAND | Stretch-Tite premium | Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective) |
| Rodent Surgical Drapes | Stoelting | 50981 | Sterile field or drape for surgical field |
| Sterile Cotton Tipped Application | Pwi-Wnaps | 703033 | used for applying eye lubricant |
| Top Sponges | Dukal Corporaton | Reorder # 5360 | Stopping bleeding from skin/muscle |
References
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