कंपोस्ट सूक्ष्म जगत प्रकृति में पाए जाने वाले माइक्रोबियल विविधता को प्रयोगशाला में लाते हैं ताकि केनोरहाब्डिस एलिगेंस में माइक्रोबायोम अनुसंधान की सुविधा मिल सके। यहां सूक्ष्म जगत प्रयोगों की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल दिए गए हैं, प्रयोगों ने पर्यावरणीय माइक्रोबियल विविधता और कृमि आंत माइक्रोबायोम संरचना के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए पर्यावरणीय माइक्रोबियल विविधता को संशोधित करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है।
नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस मेजबानों और उनके आंत माइक्रोबायोम के बीच अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल के रूप में उभर रहा है। जबकि अच्छी तरह से विशेषता वाले बैक्टीरिया या परिभाषित जीवाणु समुदायों के साथ प्रयोग आणविक तंत्र के विश्लेषण की सुविधा प्रदान कर सकते हैं, उनके प्राकृतिक माइक्रोबियल संदर्भ में नेमाटोड का अध्ययन ऐसे तंत्र की विविधता की खोज के लिए आवश्यक है। इसी समय, जंगल से कीड़े का अलगाव हमेशा संभव नहीं होता है, और, यहां तक कि जब संभव हो, जंगल से नमूना लेना सी एलिगेंस अनुसंधान के लिए अन्यथा उपलब्ध आनुवंशिक टूलकिट के उपयोग को प्रतिबंधित करता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल माइक्रोबियल रूप से विविध और प्राकृतिक जैसे वातावरण में इन-लैब विकास के लिए कम्पोस्ट माइक्रोकॉसम का उपयोग करके माइक्रोबायोम अध्ययन के लिए एक विधि का वर्णन करता है।
स्थानीय रूप से सोर्स की गई मिट्टी को माइक्रोबियल समुदायों में विविधता लाने के लिए उपज से समृद्ध किया जा सकता है जिसमें कीड़े उठाए जाते हैं और जिनसे उन्हें बाद के विश्लेषणों के लिए काटा, धोया और सतह-निष्फल किया जाता है। प्रतिनिधि प्रयोग एक आम मिट्टी में माइक्रोबियल समुदाय को विभिन्न उपज के साथ समृद्ध करके संशोधित करने की क्षमता प्रदर्शित करते हैं और आगे प्रदर्शित करते हैं कि इन अलग-अलग वातावरणों में उठाए गए कीड़े अपने संबंधित वातावरण से अलग समान आंत माइक्रोबायोम को इकट्ठा करते हैं, जो एक प्रजाति-विशिष्ट कोर आंत माइक्रोबायोम की धारणा का समर्थन करते हैं। कुल मिलाकर, खाद सूक्ष्म जगत सिंथेटिक माइक्रोबियल समुदायों या जंगली नेमाटोड के अलगाव के विकल्प के रूप में माइक्रोबायोम अनुसंधान के लिए प्राकृतिक जैसे इन-लैब वातावरण प्रदान करते हैं।
नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस मेजबानों और उनके आंत माइक्रोबायोम 1,2 के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल के रूप में उभर रहा है। एक मॉडल के रूप में, यह कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, रोगाणु मुक्त या जीनोबायोटिक जानवरों को प्राप्त करना और बनाए रखना आसान है; ब्लीच का उपयोग ग्रेविड कीड़े और संबंधित रोगाणुओं को मारने के लिए किया जा सकता है, जिससे उनके ब्लीच-प्रतिरोधी अंडे उम्र-सिंक्रनाइज़ आबादी के रूप में बढ़ने के लिए बिना नुकसान के रह जाते हैं जिन्हें रुचि के बैक्टीरिया द्वारा उपनिवेशित किया जा सकता है 3,4. इसके अलावा, जब बैक्टीरिया की उपस्थिति में उगाया जाता है, तो सी एलिगेंस, एक बैक्टेरिवोर, सामने आए बैक्टीरिया को निगलता है, जिसमें अतिसंवेदनशील प्रजातियां पचती हैं या उत्सर्जित होती हैं, जबकि प्रतिरोधी और लगातार प्रजातियां कीड़े आंत को स्थिर रूप से उपनिवेशित करती हैं। एलिगेंस ज्यादातर हेर्मैफ्रोडिटिक होते हैं, जो आनुवंशिक रूप से समान संतान की आबादी का उत्पादन करते हैं, जो भ्रामक आनुवंशिक भिन्नता को कम करता है। उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक कृमि उपभेदों की उपलब्धता के साथ युग्मित, सी एलिगेंस के साथ काम करना शोधकर्ताओं को मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन 5,6,7,8 के आणविक आधार की जांच करने के लिए एक जीनोबायोटिक और आनुवंशिक रूप से वापस लेने योग्य मॉडल प्रदान करता है।
जबकि अच्छी तरह से विशेषता वाले बैक्टीरिया के साथ प्रयोग आणविक तंत्र के विश्लेषण की सुविधा प्रदान कर सकते हैं, उन बैक्टीरिया की पहचान और अध्ययन करना जो प्रकृति में कीड़े के साथ बातचीत करते हैं, ऐसे तंत्र की विविधता की खोज करने, उनके कार्य के लिए प्राकृतिक संदर्भ को उजागर करने और उनके विकास को आकार देने वाले चयनात्मक बलों को समझने के लिए आवश्यक हैं। प्रयोगशाला के बाहर, सी एलिगेंस को विश्व स्तर पर आर्द्र समशीतोष्ण जलवायु में पाया जाता है, जहां आबादी को “बूम-एंड-बस्ट” जीवनचक्र से गुजरना पड़ता है, जो संसाधनों के प्रचुर मात्रा में होने पर तेजी से जनसंख्या वृद्धि की विशेषता है, इसके बाद संसाधनों के कम होने पर अग्रणी, तनाव-सहिष्णु ड्यूरमें विकासात्मक बदलाव होता है। हालांकि मिट्टी के निमेटोड माना जाता है, जंगली-प्रसार सी एलिगेंस आबादी आमतौर पर सड़ने वाले फूलों या फलों जैसे कार्बनिक पदार्थों को विघटित करने पर भोजन करती है, जहां बैक्टीरिया की आबादी प्रचुर मात्रा में और विविध होती है।
जंगली से अलग नेमाटोड में आंत माइक्रोबायोम के अध्ययन ने विविध, अभी तक विशिष्ट, जीवाणु समुदायों10,11 की पहचान की है, जिसकी संरचना को प्राकृतिक जैसे सूक्ष्मजगत के वातावरण में उठाए गए कीड़े के साथ किए गए अध्ययनों द्वारा समर्थित किया गया था। साथ में, इस तरह के अध्ययनों ने कोर वर्म आंत माइक्रोबायोम2 के चित्रण को सक्षम किया। जबकि जंगल में सी एलिगेंस आबादी का नमूना प्राकृतिक कीड़े-माइक्रोब इंटरैक्शन की सबसे प्रत्यक्ष परीक्षा का प्रतिनिधित्व करता है, यह हर जगह और कभी भी संभव नहीं है, क्योंकि यह पर्याप्त वर्षा वाले क्षेत्रों औरमौसमों तक सीमित है। वैकल्पिक रूप से, कीड़े को उनके प्राकृतिक आवास से अलग करने के बजाय, सूक्ष्म जगत का उपयोग करने वाले प्रयोग प्राकृतिक आवास को प्रयोगशाला 6,8,12,13,14,15 में लाते हैं। सूक्ष्म जगत के वातावरण विभिन्न फलों या सब्जियों के साथ खाद बनाई गई मिट्टी से तैयार किए जाते हैं, जो शुरुआती मिट्टी समुदाय के और विविधीकरण को सक्षम बनाता है। वे वापस लेने योग्य प्रयोगात्मक तरीकों की पेशकश करते हैं जो माइक्रोबियल विविधता और त्रि-आयामी जंगली मिट्टी के वातावरण को एक नियंत्रित प्रयोगशाला सुविधा और आनुवंशिक रूप से परिभाषित कृमि उपभेदों के प्रयोगात्मक लाभों के साथ जोड़ते हैं। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में खाद सूक्ष्म जगत के साथ काम करने में शामिल चरणों का विवरण दिया गया है, जो विभिन्न वातावरणों से एक विशिष्ट कृमि आंत माइक्रोबायोम की असेंबली को समझने में उनके उपयोग का प्रदर्शन करता है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्राकृतिक जैसे वातावरण में उठाए गए नेमाटोड के आंत माइक्रोबायोम का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जो प्रकृति से कीड़े के अलगाव के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है या उन्हें सिंथेटिक समुदायों पर उठाता है।
प्रतिनिधि सूक्ष्म जगत प्रयोग में कैप्चर की गई हजारों संभावित जीवाणु प्रजातियां माइक्रोबियल विविधता को दर्शाती हैं जो कीड़े के साथ विकसित हुई हैं और एक मॉडल मेजबान जीव और प्राकृतिक, विविध माइक्रोबियल समुदायों के साथ काम करने के फायदों को संयोजित करने के लिए सूक्ष्म जगत पाइपलाइन की क्षमता का प्रदर्शन करती हैं।
प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है कि विभिन्न उपज प्रकारों के साथ एक आम मिट्टी को समृद्ध करना पर्यावरणीय माइक्रोबियल विविधता को नियंत्रित करता है, इस पाइपलाइन का उपयोग करके अन्वेषण के लिए उपलब्ध माइक्रोबियल विविधता की सीमा को उजागर करता है। उत्पादन विकल्प विशेष रूप से महत्वपूर्ण नहीं है। पिछले काम ने मिट्टी को समृद्ध करने के लिए केले, सेब, संतरे, स्ट्रॉबेरी, हरी चाय की पत्तियों और आलू का उपयोग किया है, जिसके परिणामस्वरूप समान कीड़े बढ़ाने की दक्षता है। मिश्रित उपज का भी प्रभावी ढंग से उपयोग किया गया है। मुख्य विशेषता यह है कि विभिन्न उपज अलग-अलग तरीकों से किसी दिए गए मिट्टी में विविधता लाएगी।
पर्यावरणीय माइक्रोबियल विविधता में व्यापक भिन्नता के बावजूद, कृमि आंत माइक्रोबायोम काफी कम भिन्न होते हैं, जो कृमि आंत आला के महत्व को दोहराते हैं और कोर आंत माइक्रोबायोम की असेंबली के लिए मेजबान फ़िल्टरिंग करते हैं जो इसके मिट्टीके वातावरण से अलग है। इस पैटर्न को भारित यूनिफ्रैक पीसीओए विश्लेषण के साथ सबसे अच्छा देखा जाता है, यह दर्शाता है कि पर्यावरणीय मिट्टी और कृमि आंत माइक्रोबायोम के बीच अंतर ज्यादातर प्रमुख टैक्सा की सापेक्ष बहुतायत में अंतर से उपजा है।
यद्यपि यहां वर्णित प्रोटोकॉल 16 एस अनुक्रमण के लिए कीड़े की कटाई पर केंद्रित है, सूक्ष्म जगत का उपयोग रुचि के अतिरिक्त प्रश्नों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सूक्ष्म जगत से काटे गए कीड़े को बाद में रोगजनकों या विषाक्त पदार्थों सहित विभिन्न प्रतिकूल परिस्थितियों के लिए मेजबान प्रतिरोध पर एक विविध आंत माइक्रोबायोम के प्रभाव के लिए जांच की जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, नए जीवाणु प्रजातियों और उपभेदों को जमीन पर काटे गए कीड़े से अलग और सुसंस्कृत किया जा सकता है, जिससे प्रयोग करने के लिए उपलब्ध बैक्टीरिया की वर्गीकरण और कार्यात्मक विविधता का विस्तार होता है।
जबकि प्रयोगशाला सेटिंग्स में अनुसंधान विधियां स्थिरता और प्रजनन क्षमता की तलाश करती हैं, सूक्ष्म जगत के साथ काम प्राकृतिक जैसे संदर्भ में मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए प्राकृतिक भिन्नता का लाभ उठाता है। फिर भी, यह भिन्नता कुछ चुनौतियां भी पैदा करती है। कुछ मिट्टी जिनमें अंतर्जात अकशेरुकी जीवों के उच्च स्तर शामिल हैं, को सूक्ष्म जगत की तैयारी से अवांछित जीवों को प्रभावी ढंग से खत्म करने के लिए अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन, निस्पंदन और परीक्षा चरणों की आवश्यकता हो सकती है। इसके अतिरिक्त, मिट्टी में कम माइक्रोबियल बहुतायत कृमि आबादी में अवांछित ड्यूअर गठन को प्रेरित कर सकती है, जिससे माइक्रोबियल अर्क में वृद्धि या अधिक मात्रा में उत्पादन के साथ मिट्टी को समृद्ध करने की आवश्यकता होती है। प्रत्येक सूक्ष्म जगत प्रयोग के साथ, शोधकर्ता प्रकृति द्वारा प्रदान की गई पूर्ण टैक्सोनोमिक और कार्यात्मक विविधता का पता लगाना जारी रखते हैं, जिससे संक्रमण प्रतिरोध से लेकर पर्यावरणीय ज़ेनोबायोटिक्स के खिलाफ सुरक्षा तक नए माइक्रोबियल टैक्सा और कार्यात्मक क्षमताओं की खोज को सक्षम किया जा सके।
The authors have nothing to disclose.
इस पांडुलिपि में वर्णित कार्य एनआईएच अनुदान आर01ओडी024780 और आर01एजी061302 द्वारा समर्थित था। केटी को रोज़ हिल्स फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, बर्कले से ग्रीष्मकालीन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। चित्रा 1 में कार्टून डिजाइन BioRender.com से प्राप्त किए गए थे।
AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |