Summary

Un método para estudiar la toxicidad y agregación de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizado

Published: November 25, 2022
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Summary

Se requiere un modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína para estudiar y comprender la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. Describimos un método para monitorear la citotoxicidad y la formación agregada de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizada.

Abstract

La enfermedad de Parkinson es el segundo trastorno neurodegenerativo más común y se caracteriza por la muerte celular progresiva causada por la formación de cuerpos de Lewy que contienen α-sinucleína mal plegada y agregada. La α-sinucleína es una proteína presináptica abundante que regula el tráfico de vesículas sinápticas, pero la acumulación de sus inclusiones proteicas resulta en neurotoxicidad. Estudios recientes han revelado que varios factores genéticos, incluidas las chaperonas bacterianas, podrían reducir la formación de agregados de α-sinucleína in vitro. Sin embargo, también es importante controlar el efecto antiagregación en la célula para aplicar esto como un tratamiento potencial para los pacientes. Sería ideal usar células neuronales, pero estas células son difíciles de manejar y tardan mucho tiempo en exhibir el fenotipo antiagregación. Por lo tanto, se requiere una herramienta in vivo rápida y eficaz para la evaluación adicional de la actividad antiagregación in vivo. El método descrito aquí se utilizó para monitorear y analizar el fenotipo antiagregación en la levadura humanizada Saccharomyces cerevisiae, que expresaba α-sinucleína humana. Este protocolo demuestra herramientas in vivo que podrían usarse para monitorear la toxicidad celular inducida por α-sinucleína, así como la formación de agregados de α-sinucleína en las células.

Introduction

La enfermedad de Parkinson (EP) es un problema grave para las sociedades que envejecen en todo el mundo. La agregación de α-sinucleína está estrechamente asociada con la EP, y los agregados proteicos de α-sinucleína son ampliamente utilizados como biomarcador molecular para el diagnóstico de la enfermedad1. α-sinucleína es una pequeña proteína ácida (140 aminoácidos de longitud) con tres dominios, a saber, la α-hélice de unión a lípidos N-terminal, el dominio central de unión a amiloide (NAC) y la cola ácida C-terminal2. El plegamiento incorrecto de la α-sinucleína puede ocurrir espontáneamente y eventualmente conduce a la formación de agregados amiloides llamados cuerpos de Lewy3. α-sinucleína puede contribuir a la patogénesis de la EP de varias maneras. En general, se piensa que sus formas oligoméricas anormales y solubles llamadas protofibrillas son especies tóxicas que causan la muerte celular neuronal al afectar diversas dianas celulares, incluyendo la función sináptica3.

Los modelos biológicos utilizados para estudiar las enfermedades neurodegenerativas deben ser relevantes para los seres humanos con respecto a su genoma y biología celular. Los mejores modelos serían las líneas celulares neuronales humanas. Sin embargo, estas líneas celulares están asociadas a varios problemas técnicos, como dificultades en el mantenimiento de cultivos, baja eficiencia de la transfección y alto costo4. Por estas razones, se requiere una herramienta fácil y confiable para acelerar el progreso en esta área de investigación. Es importante destacar que la herramienta debe ser fácil de usar para analizar los datos recopilados. Desde estas perspectivas, varios organismos modelo han sido ampliamente utilizados, incluyendo Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, levadura y roedores5. Entre ellos, la levadura es el mejor organismo modelo porque la manipulación genética es fácil y es más barata que los otros organismos modelo. Lo más importante es que la levadura tiene altas similitudes con las células humanas, como un 60% de homología de secuencia con los ortólogos humanos y un 25% de homología cercana con los genes relacionados con enfermedades humanas6, y también comparten la biología fundamental de las células eucariotas. La levadura contiene muchas proteínas con secuencias similares y funciones análogas a las de las células humanas7. De hecho, la levadura que expresa genes humanos ha sido ampliamente utilizada como un sistema modelo para dilucidar los procesos celulares8. Esta cepa de levadura se llama levadura humanizada y es una herramienta útil para explorar la función de los genes humanos9. La levadura humanizada tiene mérito para estudiar las interacciones genéticas porque la manipulación genética está bien establecida en la levadura.

En este estudio, utilizamos la levadura Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo para estudiar la patogénesis de la EP, particularmente para investigar la formación de agregados de α-sinucleína y la citotoxicidad10. Para la expresión de α-sinucleína en la levadura en ciernes, se utilizó la cepa W303a para la transformación con plásmidos que codifican para las variantes de tipo salvaje y familiares asociadas a la PD de la α-sinucleína. Como la cepa W303a tiene una mutación auxotrófica en URA3, es aplicable para la selección de células que contienen plásmidos con URA3. La expresión de α-sinucleína codificada en un plásmido está regulada bajo el promotor GAL1. Por lo tanto, el nivel de expresión de α-sinucleína puede ser controlado. Además, la fusión de la proteína verde fluorescente (GFP) en la región C-terminal de la α-sinucleína permite el monitoreo de la formación de focos de α-sinucleína. Para comprender las características de las variantes familiares asociadas a la EP de la α-sinucleína, también expresamos estas variantes en levaduras y examinamos sus efectos celulares. Este sistema es una herramienta sencilla para la detección de compuestos o genes que exhiben funciones protectoras contra la citotoxicidad de la α-sinucleína.

Protocol

1. Preparación de medios y soluciones Preparación de los mediosPara preparar YPD medio, disolver 50 g de YPD polvo endH2Opara hacer un volumen final de 1 L. Autoclave para esterilización. Conservar a temperatura ambiente (RT). Para hacer medio de agar YPD, disolver 50 g de polvo YPD y 20 g de agar en 1 L de dH2O. Autoclave para esterilización. Después de enfriar, vierta sobre placas de Petri. Conservar a 4 °C. Para hacer SC con rafinosa …

Representative Results

Se sabe que la alta expresión de α-sinucleína está relacionada con la muerte celular neuronal y la EP en sistemas modelo de EP. Este estudio describe tres métodos para monitorear la citotoxicidad de la α-sinucleína y la formación de focos de α-sinucleína agregada en la levadura. Aquí, la α-sinucleína se sobreexpresó en levaduras, y se examinaron los fenotipos de α-sinucleína de tipo salvaje y tres variantes de α-sinucleína conocidas como mutantes familiares de la EP (Figura 1</stron…

Discussion

Dada la complejidad de varios sistemas celulares en humanos, es ventajoso utilizar la levadura como modelo para estudiar las enfermedades neurodegenerativas humanas. Aunque es casi imposible investigar las complejas interacciones celulares del cerebro humano utilizando levadura, desde una perspectiva unicelular, las células de levadura tienen un alto nivel de similitud con las células humanas en términos de homología de secuencia genómica y procesos celulares eucariotas fundamentales 8,1…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a James Bardwell y Tiago F. Outeiro por compartir amablemente los plásmidos que contienen α-sinucleína. Changhan Lee recibió fondos de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIT) (subvención 2021R1C1C1011690), el Programa de Investigación de Ciencias Básicas a través del NRF financiado por el Ministerio de Educación (subvención 2021R1A6A1A10044950) y el nuevo fondo de investigación docente de la Universidad de Ajou.

Materials

96 well plate SPL 30096
Agarose TAESHIN 0158
Bacto Agar BD Difco 214010
Breathe-easy diversified biotech BEM-1 Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses Marienfeld 24 x 60 mm
Culture tube SPL 40014
Cuvette ratiolab 2712120
D-(+)-Galactose sigma G0625
D-(+)-Glucose sigma G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate Daejung 6638-4105
Incubator (shaking) Labtron model: SHI1
Incubator (static) Vision scientific model: VS-1203PV-O
LiAc sigma L6883
Microplate reader Tecan 30050303 01 Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL gilson FA10011
multichannel pipette 2-20 µL gilson FA10009
Olympus microscope Olympus IX-53
PEG sigma P4338 average mol wt 3,350
Petridish SPL 10090
pRS426 Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir SPL 23050
Spectrophotometer eppendorf 6131 05560
W303a Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids Difco 291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil sigma Y1501
YPD Condalab 1547.00

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Cite This Article
Kim, H., Jeong, J., Lee, C. A Method to Study α-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model. J. Vis. Exp. (189), e64418, doi:10.3791/64418 (2022).

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