Summary
Denne protokol beskriver en semi-automatiseret metode til medium- til high-throughput organoid drug screenings og mikroskop-agnostisk, automatiseret billedanalyse software til kvantificering og visualisering af multiparametriske, enkeltorganoide lægemiddelresponser til at fange intratumor heterogenitet.
Abstract
Patientafledte tumororganoider (PDTO'er) har et stort løfte om præklinisk og translationel forskning og forudsigelse af patientterapirespons fra ex vivo-lægemiddelscreeninger. Imidlertid fanger nuværende adenosintrifosfat (ATP) -baserede lægemiddelscreeningsassays ikke kompleksiteten af et lægemiddelrespons (cytostatisk eller cytotoksisk) og intratumorheterogenitet, der har vist sig at blive bevaret i PDTO'er på grund af en bulkaflæsning. Levende cellebilleddannelse er et kraftfuldt værktøj til at overvinde dette problem og visualisere lægemiddelresponser mere dybtgående. Imidlertid er billedanalysesoftware ofte ikke tilpasset PDTO'ernes tredimensionalitet, kræver fluorescerende levedygtighedsfarvestoffer eller er ikke kompatibel med et 384-brønds mikropladeformat. Dette papir beskriver en semi-automatiseret metode til såning, behandling og billede af PDTO'er i et højkapacitetsformat med 384 brønde ved hjælp af konventionelle, widefield, live-cellebilleddannelsessystemer. Derudover udviklede vi software til billedanalyse uden levedygtighedsmarkører til at kvantificere væksthastighedsbaserede lægemiddelresponsmålinger, der forbedrer reproducerbarheden og korrigerer væksthastighedsvariationer mellem forskellige PDTO-linjer. Ved hjælp af den normaliserede lægemiddelresponsmetrik, som scorer lægemiddelrespons baseret på væksthastigheden normaliseret til en positiv og negativ kontroltilstand, og et fluorescerende celledødsfarvestof, kan cytotoksiske og cytostatiske lægemiddelresponser let skelnes, hvilket dybt forbedrer klassificeringen af respondenter og ikke-respondenter. Derudover kan lægemiddelresponsheterogenitet kvantificeres fra enkeltorganoid lægemiddelresponsanalyse for at identificere potentielle, resistente kloner. I sidste ende sigter denne metode mod at forbedre forudsigelsen af klinisk terapirespons ved at fange en multiparametrisk lægemiddelresponssignatur, som inkluderer kinetisk vækststop og kvantificering af celledød.
Introduction
I de senere år har in vitro kræftlægemiddelopdagelse, lægemiddelscreening og grundforskning skiftet fra brugen af traditionelle todimensionelle (2D) kræftmodeller med udødeliggjorte cellelinjer til mere fysiologisk relevante tredimensionelle (3D) kræftmodeller. Dette har ansporet vedtagelsen af tumorsfæroider med etablerede kræftcellelinjer, som genskaber mere komplekse celle-til-celle-interaktioner og strukturer, der findes i solide tumorer. I øjeblikket er patientafledte tumororganoider (PDTO'er) den mest avancerede og fysiologisk relevante 3D-kræftmodel, der er tilgængelig til in vitro-kræftforskning , da de giver yderligere fordele i forhold til tumorsfæroider, nemlig heterogeniteten, der findes hos kræftpatienter1. PDTO'er etableres fra tumorvæv, der stammer fra kræftpatienter, og bevarer derfor både tumorfænotypen og genotypen. Som sådan bliver PDTO'er uvurderlige for grundlæggende og translationel kræftforskning og har potentialet til i høj grad at forbedre præcisionsonkologi2.
På trods af deres lovende potentiale er disse sofistikerede 3D in vitro-kræftmodeller ofte underudnyttet på grund af mangel på avancerede analysemetoder. Det mest almindeligt anvendte assay bestemmer antallet af levedygtige celler i PDTO via kvantificering af intracellulær ATP3. Disse analyser er normalt enkelttids-, bulkanalyser, hvorved kritiske tidsafhængige svar overses og klonale responser forsømmes. Specifikt er evnen til at overvåge væksten af PDTO'er (vækstrate) og deres respons på specifikke terapier af høj interesse 4,5. Det normaliserede lægemiddelrespons (NDR), som scorer lægemiddelrespons baseret på vækstraten normaliseret til en positiv (ctrl +) og negativ kontrol (ctrl-) tilstand, er også for nylig blevet rapporteret at være en afgørende måling til evaluering af kræftlægemiddelfølsomhed med cellebaseret screening, selvom dette overvejende blev gjort for 2D-cellelinjer6. Derfor er der behov for mere sofistikerede analysemetoder for fuldt ud at drage fordel af disse mere klinisk repræsentative og komplekse 3D-kræftmodeller. Mikroskopi betragtes som en stærk tilgang til at studere kompleksiteten af disse organoidmodeller7.
Dette papir beskriver en metode til overvågning af kinetiske lægemiddelresponser i 3D-kræftmodeller ved hjælp af konventionelle widefield-mikroskoper og levende cellebilleddannelsessystemer. Der blev foretaget tilpasninger af protokollen beskrevet af Driehuis et al.4 for at være kompatibel med automatisering ved hjælp af en pipetteringsrobot, digital lægemiddeldispenser og levende cellebilleddannelsessystem for at øge reproducerbarheden og reducere antallet af 'hands-on' arbejdstimer. Denne metode muliggør medium til høj gennemstrømning lægemiddelscreening af både tumorsfæroider med etablerede kræftcellelinjer (se supplerende tabel S1 for testede cellelinjer) såvel som PDTO'erne i et 384-brønds mikroplade- og multiorganoidformat. Ved at bruge en convolutional netværksmaskinlæringsproces kunne automatiseret identifikation og sporing af individuelle tumorsfæroider eller PDTO'er udføres udelukkende fra brightfield-billeddannelse og uden brug af fluorescerende levende cellemærkningsfarvestoffer8. Dette er yderst fordelagtigt, da de fleste identifikation med brightfield-billeddannelse kræver manuel annotering (hvilket er besværligt og tidskrævende) eller kræver tilsætning af fluorescerende farvestoffer, som kan forvirre lægemiddelresponser relateret til fotoksicitetsinduceret oxidativt stress9.
Den resulterende billedanalysesoftware, der er udviklet internt, udvider funktionaliteten af konventionelle live-cellebilleddannelsessystemer, da 3D-billedanalysemoduler enten ikke er tilgængelige, platformbegrænsede eller ikke er kompatible med 384-brønds mikroplader og helbrøndsbilleddannelse. Derudover er disse moduler ofte meget dyre og tilbyder begrænsede organoidaflæsninger. Derfor er denne metode yderst relevant for forskere, der har adgang til bredt tilgængelige levende cellebilleddannelsessystemer og sigter mod at udtrække mere information om et lægemiddelrespons sammenlignet med guldstandarden, men rudimentært ATP-baseret assay. Med tilføjelsen af specifikke celledødsindikatorer kan cytostatiske lægemiddelresponser skelnes fra cytotoksiske reaktioner, hvilket giver yderligere indsigt i mekanistiske lægemiddelhandlinger, der i øjeblikket ikke kan opnås fra enkeltpunktsanalyse. Endelig giver levende cellebilleddannelse mulighed for individuel organoidsporing for at opnå enkeltorganoid lægemiddelresponsmålinger for at fange responsheterogenitet og identificere potentielle resistente subkloner.
Målet med denne metode og den tilhørende billedanalysesoftware er at implementere billig automatisering i organoid lægemiddelscreening for at begrænse brugerintervention og reducere variabilitet i håndtering, billedanalyse og dataanalyse. For at gøre denne software tilgængelig for forskere er den mikroskop- og platformagnostisk, og en skybaseret applikation stilles til rådighed. Ved at understøtte konventionelle levende cellebilleddannelsessystemer sigter vi således også mod at forbedre deres funktionalitet til 3D-dyrkningsapplikationer og -analyser.
Protocol
Human pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) patientafledte organoider blev anvendt. Vævsresektionsfragmenter blev opnået fra patienter, der gennemgik helbredende kirurgi på Antwerp Universitetshospital. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af UZA Ethical Committee (ref. 14/47/480). Detaljer relateret til alle materialer, reagenser, udstyr og software, der anvendes i denne protokol, findes i materialetabellen. En oversigt over arbejdsgangen er vist i figur 1. Eksempler på data er angivet i det supplerende materiale for at gengive protokollen.
1. Dag 0: Tilberedning af 2- eller 3-dages gamle organoider
- Forvarm mikropladerne ved 37 °C natten over, og optø den ekstracellulære matrix (ECM) ved 4 °C.
- Forbered fuld PDAC organoid kultur medium: supplement ADF +++ (Advanced DMEM / F12, 1% glutamin supplement, 1% HEPES, og 1% penicillin / streptomycin) med 0,5 nM WNT surrogat-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein konditioneret medium, 4% Rpso3-Fc fusionsprotein konditioneret medium, 1x B27, 1 mM N-acetylcystein (NAC), 5 mM nicotinamid, 500 nM A83-01, 100 ng / ml FGF10, og 10 nM Gastrin).
- Fastlæg PDTO'erne i henhold til den valgte metode.
BEMÆRK: En detaljeret protokol leveres af Driehuis et al., som beskriver den konventionelle metode til at etablere, dyrke og passere PDTO'er i ECM-kupler4. - Enzymatisk dissociere organoiderne i ECM-kupler.
- Opsug mediet og vask 1x med fosfatbufret saltvand (PBS). Tilsæt dissociationsenzym (f.eks. 2 ml i en 6-brønds mikroplade) og pipette op og ned 10x med en 1 ml pipette for mekanisk at adskille organoiderne og ECM-kuplerne.
- Der inkuberes i 10 minutter ved 37 °C, pipetteres op og ned, og det kontrolleres, om organoiderne dissocieres til enkeltceller. Gentag dette trin, hvis det er nødvendigt.
- Celleopslæmningen opsamles i et 15 ml glas, der tilsættes ADF+++ til et volumen på 10 ml, centrifugeres i 5 minutter ved 450 × g ved stuetemperatur, og supernatanten suges til aspiratering med en Pasteur-pipette og sugepumpe.
- Resuspender pellet i 100-200 μL fuldt medium afhængigt af pelletens størrelse og tæl antallet af celler ved hjælp af den valgte metode. For eksempel: bland 10 μL af cellesuspensionen + 10 μL Trypan Blue og tæl med en automatiseret celletæller.
- Plade enkeltceller i ECM-kupler.
- Fortynd cellesuspensionen og tilsæt 2/3 ECM i henhold til tabel 1. Pipette op til ti 20 μL dråber pr. brønd i en forvarmet 6-brønds plade. Vend pladen på hovedet, og inkubér den i 30 minutter ved 37 °C.
- Overlay med fuldt medium suppleret med 10 μM Y-27632 og inkuberes i 2-3 dage i en inkubator.
BEMÆRK: Ti kupler indeholdende 75.000 celler hver er normalt nok til at fylde en 384-brønds mikroplade i en koncentration på 200 organoider / brønd, eksklusive brøndene ved kanten.
2. Dag 2 - 3: Høst og frø 2- eller 3-dages gamle organoider
- Saml intakte organoider fra ECM-kuplerne.
BEMÆRK: Organoider har tendens til at klæbe til plastoverflader (f.eks. Rør, pipettespidser). For at undgå dette kan plastvarer forskylles med en 0,1% bovin serumalbumin (BSA) / PBS-opløsning.- Opsug mediet og vask 1x med PBS. Tilsæt 1-2 ml kold (4 °C) organoid høstopløsning til en 6-brønds plade afhængigt af antallet af ECM-kupler og inkuber på is på en rysteplatform i 10 minutter.
- Pipetter op og ned med en 1 ml pipette for at adskille ECM-kuplerne, inkubere i yderligere 10 minutter på is og visuelt kontrollere under et mikroskop, om ECM er dissocieret.
- Valgfrit: Hvis en mere ensartet størrelsesfordeling foretrækkes, filtreres suspensionen gennem en 70 μm cellesi før centrifugering.
- Organoiderne opsamles i et 15 ml rør, der er præcoatet med 0,1 % BSA/PBS, tilsættes ADF+++ op til 10 ml og centrifugeres i 5 minutter ved 200 × g ved 4 °C. Supernatanten suges op, og pelletpen resuspenderes i op til 1.000 μl fuldt PDAC-organoidmedium afhængigt af pellets størrelse for at opnå en koncentration på >6.000 organoider/ml.
- Tæl organoiderne ved hjælp af en hvilken som helst valgt tællemetode, helst en billedbaseret.
- Frø organoiderne.
BEMÆRK: Se materialetabellen for minimumsvolumen/brønd for to forskellige typer mikroplader med 384 brønde, der anvendes i denne protokol.- Forafkøl alle plastvarer ved -20 °C eller på is i mindst 20 minutter før brug for at undgå størkning af ECM.
- Såopløsningen fremstilles af 1 ml organisk stamopløsning (trin 2.1.6) med fuldt substrat til frø ~200 organoider pr. hul i 50 μL, det mindste volumen, der anvendes til at fylde en brønd. Brug supplerende fil 1 til at beregne mængden af organoid såopløsning. Tilføj et restvolumen på 1.500 μL, når du bruger en 25 ml beholder og multikanalpipette eller pipetteringsrobot.
- Frø organoiderne ved hjælp af en pipetteringsrobot.
BEMÆRK: Både såopløsningen og mikropladen skal afkøles ved 4 °C under pipettering for at undgå størkning af ECM. Derfor blev der 3D-printet et 25 ml reservoir og en mikropladeholder til brug i kombination med pipetteringsrobotten, der kan rumme køleelementer, der er anført i materialetabellen. STL-filer til 3D-udskrivning, de brugerdefinerede labware (supplerende fil 2 og supplerende fil 3) og brugerdefinerede labware JSON-filer til pipetteringsrobotten (supplerende fil 4 og supplerende fil 5) leveres.- Design dispenseringsprotokollen ved hjælp af online Protocol Designer Tool. Der findes et eksempel på en JSON-fil (supplerende fil 6), hvor det brugerdefinerede labware allerede er indlæst, og der anvendes en ottekanals p300 (Gen2) pipette med tilsvarende pipettespidser.
- Åbn pipetteringsrobotstyringsappen, vælg protokoller, klik på Importer, og træk og slip supplerende fil 6 i det udpegede felt.
- Vælg den importerede protokol, og placer alt laboratorieudstyr, herunder køleelementer og plastvarer, i kortene i henhold til layoutet vist i feltet Dækopsætning . Brug den venstre åbning til 25 ml beholderen og køleelementet som vist i supplerende fil 7.
- Klik på Kør protokol og fortsæt til opsætning. Åbn fanen Labware-opsætning, klik på Kør Labware-positionskontrol, og følg instruktionerne for at kalibrere pipetteringsrobotten til den nye hardware.
BEMÆRK: Labware-forskydningsdata kan gemmes til senere, men det anbefales at køre labware-positionskontrollen før hver kørsel. - Fyld 25 ml reservoiret (placeret oven på køleelementet) med den afkølede organoidsåningsopløsning, og klik på Start kørsel.
BEMÆRK: De øverste og nederste huller bliver også fyldt med organoid suspensionsopløsning på grund af brugen af ottekanalpipetten. - Mikropladen centrifugeres i 1 min ved 100 × g ved 4 °C.
- Der inkuberes ved 37 °C i mindst 30 minutter.
- De ydre huller til blindprøven fyldes med mindst 50 μL H2O for at undgå fordampning.
- Der inkuberes ved 37 °C natten over for at fjerne eventuelle bobler i brønden, der kan forstyrre billedanalysen.
3. Dag 4: Lægemiddelbehandling og reagensdispenser med digital medicindispenser
- Opret lægemiddeludleveringsprotokollen ved hjælp af den digitale lægemiddeldispenserstyringssoftware.
- Hold markøren over plade 1 over pladelayoutet, vælg rediger pladeattributter, og udfyld pladetype: 384 brønd, ekstra volumen (μL): 50 og DMSO-grænse (%): 1.
- Tilføj væsker ved at klikke på knappen + ved siden af Væsker. Dobbeltklik på den nyoprettede væske og navngiv den; vælg klasse (DMSO-baseret eller vandig + Tween 20) og koncentration.
BEMÆRK: Alle lægemidler og reagenser skal opløses i 100% DMSO eller 0,3% Tween-20. En 1-10 mM stamopløsning kan anvendes under hensyntagen til en maksimal DMSO-koncentration på <1%. Tabel 2 giver eksempler på de nødvendige fortyndinger for almindelige fluorescerende reagenser og terapier. - Plade layout
- For lægemiddeltitrering skal du vælge brønde og klikke på Titrering. For væske skal du vælge det interessante lægemiddel, vælge den højeste koncentration (f.eks. 2.000 nM) og den laveste koncentration (f.eks. 10 nM); For replikater skal du vælge mindst 2 og vælge det ønskede titreringsmønster.
BEMÆRK: Titreringsmønsteret afhænger af mange faktorer, herunder hvor meget forbindelse der skal være plads til i en enkelt plade, om hullerne skal randomiseres og antallet af replikater og kontroller. - For den positive kontrol skal du vælge tre huller, klikke på Indstil værdi og udfylde 2 μM staurosporin fra 10 mM lager i DMSO, hvilket vil inducere maksimal celledød.
- For Cytotox Green skal du vælge alle de brugte brønde, klikke på Indstil værdi og indtaste 60 nM / brønd.
BEMÆRK: Cytotox Green fluorescerende farvning indikerer celler, der er døde, og vil derfor ikke forstyrre overvågningen af lægemiddelrespons. Her kræves ingen fluorescerende markør for levende celler. - For den negative kontrol og DMSO-normalisering skal du vælge alle brønde med yderligere fire brønde til køretøjsstyringen, højreklikke, vælge normalisering, vælge normaliser væskeklasse: DMSO-baseret og normalisere til det højeste klassevolumen for at opnå en lige DMSO-koncentration i hver brønd.
BEMÆRK: DMSO-koncentrationer bør være <1%. Der findes et eksempel på TDD-lægemiddeltitreringsfil (supplerende fil 8). - Klik på pilen under Kør i øverste venstre hjørne, vælg Simuler altid, og klik på Simuler for at identificere eventuelle fejl og få mængderne af hvert lægemiddel, der skal fremstilles.
BEMÆRK: For at overvinde en advarsel, når det oprindelige dispenservolumen er for lavt, anbefales "Dispenseringsadvarselsbrønd på 30 nL eller derover for hver væske på hver plade", vælg to huller på kanten, der er fyldt med vand, vælg Indstil værdi, og indtast 10 μM af det lægemiddel, som advarslen forekommer for. Dette primer lægemiddelpatronen med et volumen højere end 30 nL. De samme huller kan bruges til at prime DMSO-patronen ved at indstille en normalisering til % af den samlede volumenværdi (f.eks. 0,5%).
- For lægemiddeltitrering skal du vælge brønde og klikke på Titrering. For væske skal du vælge det interessante lægemiddel, vælge den højeste koncentration (f.eks. 2.000 nM) og den laveste koncentration (f.eks. 10 nM); For replikater skal du vælge mindst 2 og vælge det ønskede titreringsmønster.
- Fjern markeringen af Simuler altid under knappen Kør ; klik på Kør for at starte lægemiddeludleveringsprotokollen og følg instruktionerne.
- Påfør tætningsmembranen på mikropladen for at forhindre fordampning.
- Cytotox Green-farvestoffet inkuberes 1-2 timer ved 37 °C i inkubatoren og fortsæt til trin 4.
4. Hent billeder med live-cell imager
BEMÆRK: For væksthastighed og NDR skal en scanning på tidspunktet 0 (T0 = start behandling) erhverves 1-2 timer efter tilsætning af Cytotox Green.
- Åbn live-cell imager Control software, vælg Method Editor New, gå til fil > import, og vælg eksemplet metode XML-fil (supplerende fil 9). Du kan også oprette en ny fil og vælge Plade: (CORE384fb_OpticalImaging) - Corning 384 Flat Black (Corning #4588), Ingen låg og Ingen fugtighedskassette; Anvendelse: Kun billeder; Målsætning: 4x; Mønster: Central; Kontroller kanalerne Brightfield og Green (LED-intensitet (%) = 40; Eksponeringstid (ms) = 200).
BEMÆRK: De grønne kanalindstillinger fungerer godt for en koncentration på 60 nM cytotox Green. Live viewer-indstillingen kan bruges til at justere fokusforskydningen og / eller LED-indstillingerne i realtid. - Klik på Start for at starte scanningen ved T0.
- Gentag scanningen hver 24. time i op til 5 dage ved hjælp af den samme metode. Hvis du vil køre timelapsemålingen automatisk, kan du også justere metoden i live-cell imager Control-softwaren til et kinetisk eksperiment ved at klikke og trække fanen Kinetisk sløjfe til metodefeltet . På samme måde skal fanerne Temperatur og Gas trækkes ind i metodefeltet for at indstille systemet til 37 °C og 5 % CO2 for at sikre de korrekte forhold i live-celle-billeddanneren under eksperimentet.
5. Billed- og dataanalyse
- Fletning og komprimering af data
- Live-cell imager Control-softwaren genererer en mappe for hver scanning på hvert tidspunkt. Opret en ny mappe, kopiér de enkelte eksperimentmapper til denne nye overordnede mappe, og føj _0h, _24h, _48h, _72h, _96h og _120h til de tilsvarende eksperimentmappenavne.
- Forbered et XLSX-pladekort fra den digitale lægemiddeldispenserstyringssoftware ved at højreklikke på pladekortlayoutet fra lægemiddeldispenseringsprotokollen og kopier alle brøndene; indsæt dataene i en XLSX-fil. Fjern Cytotox Green og staurosporin data og tilføj en matrix for cellelinje og replikate. Indtast ctrl- og ctrl+. Se supplerende fil 10 for et eksempel på pladekort.
- Åbn datakomprimeringsværktøjet, klik på Gennemse, vælg den overordnede mappe, og klik på Kør for at starte billeddatakomprimering. Alle TIFF-billedfiler for de forskellige tidspunkter komprimeres til en enkelt HDF5 for hver brønd i en ny datasætmappe i den overordnede mappe.
- Billedanalyse
- Gå til billedanalysewebapp-platformen, log ind, og klik på Tilføj nyt projekt på fanen Hjem . Angiv projektnavnet, fortsæt, vælg Tilføj nyt eksperiment, og upload mappen datasæt, der indeholder HDF5-filerne.
- Efter upload skal du gå til projekt - og eksperimentmappen og klikke på Upload Platemap for yderligere funktioner. Klik på Kør analyse, vælg Multiorganoidanalyse, Standardparametre, og klik på Analysér for at starte billedanalyse.
- Klik på Download resultater for at downloade de rå datatabeller, der indeholder målingerne for hver brønd (f.eks. Samlet lysstyrkeareal, samlet fluorescensgrønt område osv.) og de segmenterede billeder/videoer for at bekræfte nøjagtigheden af analysen og yderligere databehandling.
- Vækstratebaserede lægemiddelresponsmålinger og normaliseret lægemiddelrespons
- Vælg Raw_NDR.xlsx-filen fra resultatmappen (pladeoversigt påkrævet) (supplerende fil 11), og indlæs den i Official_NDR_7point R-script (supplerende fil 12) for automatisk at generere GR (normaliseret til ctrl-) og NDR (normaliseret til ctrl- og ctrl+) værditabeller (supplerende fil 13, supplerende fil 14, supplerende fil 15 og supplerende fil 16 ). GR- og NDR-værdier beregnes ud fra parameteren som vist i ligning (1) ved hjælp af R-scriptet (supplerende fil 12).
Samlet overlevelsesområde = Samlet Brightfield-område - Samlet grønt område (1)
Hvor 0 < NDR <1 = cytostatisk virkning (vækststop), og NDR < 0 = cytotoksisk respons (celledød).
BEMÆRK: R-scriptet blev tilpasset fra Gupta et al.6. - Fra clonal_data.xlsx-tabellen skal du hente enkeltorganoidresponsdata og plotte dem som et bobleplot.
- Brug Z-faktor10 til at vurdere lægemiddelskærmens kvalitet af et løb (se ligning (2)). Kassér et eksperiment med en Z-faktor < 0,5.
(2)
- Vælg Raw_NDR.xlsx-filen fra resultatmappen (pladeoversigt påkrævet) (supplerende fil 11), og indlæs den i Official_NDR_7point R-script (supplerende fil 12) for automatisk at generere GR (normaliseret til ctrl-) og NDR (normaliseret til ctrl- og ctrl+) værditabeller (supplerende fil 13, supplerende fil 14, supplerende fil 15 og supplerende fil 16 ). GR- og NDR-værdier beregnes ud fra parameteren som vist i ligning (1) ved hjælp af R-scriptet (supplerende fil 12).
(2)Representative Results
Den automatiserede pipetteringsprotokol sikrer en jævn fordeling af PDAC_060 PDTO'er i alle kolonnerne i mikropladen med 384 brønde (figur 2A). Som forventet blev der observeret en variation i antallet og det gennemsnitlige areal af PDTO'er mellem brøndene (figur 2A,B). Det samlede overlevelsesområde (samlet brightfield-areal - totalt grønt område) kombinerer den etiketfrie organoidsegmentering med det fluorescensbaserede celledødssignal og er efter vores erfaring den mest robuste parameter til at studere lægemiddelresponser over tid (figur 2C)8. For at tage højde for variationer i cellesåning og organoidstørrelse bør væksthastighedsbaserede målinger anvendes til at reducere variationer mellem replikater, som vist ved de reducerede fejlbjælker i figur 2D versus figur 2C og en højere Z-faktor, der indikerer en stærkt forbedret lægemiddelskærmkvalitet (figur 2E).
NDR-dosis-responskurven (figur 2G), normaliseret til ctrl- og ctrl+, er klart bedre end GR-dosis-responskurven (figur 2F), normaliseret til ctrl-, da den øger adskillelsen af lægemiddelresponskurverne og mere præcist repræsenterer cytotoksiske lægemiddelresponser. Et eksempel på de tilknyttede billeder for ctrl-, ctrl+ og 400 nM gemcitabin/80 nM paclitaxel-behandlet PDTO er vist i figur 3. En interessant observation er, at gemcitabins cytotoksiske virkning var dominerende i kombinationsbehandlingen, da der ikke blev observeret nogen merværdi af paclitaxel.
Dernæst blev der brugt to yderligere PDTO-linjer, PDAC_052 og PDAC_087. Der blev observeret en klar forskel i væksthastigheden mellem disse linjer (figur 4A), hvilket understøtter brugen af GR-målinger. Igen resulterede NDR-dosis-responskurver (figur 4C) i et øget dynamisk område og adskillelse mellem de tre forskellige patienter sammenlignet med GR-kurverne (figur 4B). Desuden giver protokollen mulighed for bestemmelse af NDR over tid og viser, at PDAC_052 og PDAC_060 havde et meget lignende cytostatisk lægemiddelrespons på en lav dosis gem-pac (figur 4D), mens et klart differentielt cytostatisk versus cytotoksisk respons kunne observeres for de midterste (figur 4E) og høje doser (figur 4F) af gem-pac. Disse lægemiddelresponser var i overensstemmelse med det kliniske respons, der blev observeret hos patienterne (figur 4G).
Endelig er en stor fordel ved tilgangen og softwaren, at enkeltorganoide lægemiddelresponser kan kvantificeres for at studere responsheterogenitet og identificere potentielt resistente subkloner. Figur 5 giver et klart overblik over de forskellige patienters klonale dynamik og viser, at PDAC-087 havde de mest resistente subkloner efter behandling, hvilket er i overensstemmelse med den aggressive og meget resistente sygdom, der blev observeret hos patienten. Interessant nok var denne patient også den mindst følsomme over for ctrl+ staurosporin.
Figur 1: Oversigt over arbejdsgang. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Seeding nøjagtighed og drug response metrics . (A) Organoidtællinger/brønd for PDAC_060 PDTO'er podet i en mikroplade med 384 brønde ved hjælp af pipetteringsrobotten. Hver prik repræsenterer antallet i en enkelt brønd, og plottene adskilles af mikropladekolonnerne med 384 brønde. (B) Gennemsnitlig PDTO-areal/brønd. (C) Samlet overlevelsesareal (samlet brightfieldareal - samlet grønt areal) og (D) væksthastighed (samlet overlevelsesareal normaliseret til T0 = 1) af PDAC_060 PDTO'er behandlet med et 5:1-forhold mellem gemcitabin og paclitaxel. E) Z-faktor som målestok for analysekvalitet. (F) Væksthastighed-dosis-responskurve normaliseret til ctrl- og (G) normaliseret lægemiddelresponskurve normaliseret til ctrl- og ctrl+. Fejlbjælker angiver gennemsnitlig ± SD for to brønde. Forkortelser: PDAC = pancreas ductal adenocarcinom; PDTO = patientafledt tumororganoid; GR = vækstrate; NDR = normaliseret lægemiddelrespons. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksempler på billeder. Repræsentative billeder af PDAC_060 PDTO behandlet med vehikel (ctrl-), 400 nM gemcitabin/80 nM paclitaxel og 2 μM staurosporin (ctrl+). Den venstre kolonne viser brightfield-billeder, den midterste kolonne viser Cytotox Green-fluorescerende signal, og den højre kolonne viser de etiketfrie kommenterede brightfield-billeder ved hjælp af organoidanalysemodulet. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: PDAC = pancreas ductal adenocarcinom; PDTO = patientafledt tumororganoid; GemPac = gemcitabin/paclitaxel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sammenligning af lægemiddelrespons mellem patienter. (A) Sammenligning af væksthastighed (baseret på det samlede overlevelsesareal) for PDAC_052, PDAC_060 og PDAC_087 PDTO-linjer. (B) Vækstrate-dosis-responskurve normaliseret til ctrl- og (C) normaliseret lægemiddelresponskurve normaliseret til ctrl- og ctrl+. Kinetisk NDR af en (D) lav, (E) mellem og (F) høj dosis gemcitabin/paclitaxel (5:1 forhold). G) PDAC-patienters kliniske karakteristika. Fejlbjælker angiver gennemsnitlig ± SD for to brønde. Forkortelser: PDAC = pancreas ductal adenocarcinom; PDTO = patientafledt tumororganoid; GR = vækstrate; NDR = normaliseret lægemiddelrespons; FFX = folfirinox. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Enkelte organoidmålinger. Respons med enkelt organoid dosis baseret på celledød (grønt område/brightfield-område) og areal (brightfield) af PDAC_052, PDAC_060 og PDAC_087 PDTO'er behandlet med vehikel (ctrl-), 400 nM gemcitabin/80 nM paclitaxel og 2 μM staurosporin (ctrl+). Grønne regioner angiver levedygtige organoider; blå områder angiver x-as-området for GemPac- og ctrl+-plots. Forkortelser: PDAC = pancreas ductal adenocarcinom; PDTO = patientafledt tumororganoid; GemPac = gemcitabin/paclitaxel. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Cellesuspensionsmateriale | Celler/fald | # Dråber (20 μL) | Lager (1/3) | ECM (2/3) |
| 1,13 × 107 celler/ml | 75,000 | 10 | 75 uL | 150 μL |
| 1,13 × 107 celler/ml | 75,000 | 5 | 40 uL | 80 μL |
Tabel 1: Fortynding til plettering i ECM-kupler. Forkortelse: ECM = ekstracellulær matrix.
| Forbindelse | Lagerkoncentration | Fortynding | Arbejdskoncentration | Opløsningsmiddel | Godt koncentration | Kommentarer |
| Cytotox Grøn | 1 mM (DMSO) | 1/10 | 10 μM | DMSO | 60 nM | Celledødsmarkør |
| Cytotox rød | 1 mM (DMSO) | 1/10 | 10 μM | DMSO | 250 nM | Celledødsmarkør |
| Caspase 3/7 Grøn | 5 mM (DMSO) | 1/2 | 2,5 mM | DMSO | 2,5 μM | Apoptotisk markør |
| Hoechst | 20 mM (H2O) | 1/200 | 100 μM | 0,33% Tween/PBS | 50 nM | Nuklear markør |
| Staurosporin | 10 mM (DMSO) | / | 1 - 10 mM | / | 2 – 5 μM | Positiv kontrol |
| Gemcitabin | 10 mM (DMSO) | / | 1 - 10 mM | / | Titrering | Kemoterapi |
| Paclitaxel | 10 mM (DMSO) | / | 1 - 10 mM | / | Titrering | Kemoterapi |
| Cisplatin | 5 mM (0,9% NaCl) | 1/2 | 2,5 mM | 0,6% Tween/PBS | Titrering | Kemoterapi |
Tabel 2: Eksempel på fortyndinger af hyppigt anvendte lægemidler og fluorescerende reagenser. Hver forbindelse skal opløses i enten 100% DMSO eller 0,3% Tween/PBS.
Supplerende tabel S1: Oversigt over kompatible kræftcellelinjer. Statisk: sfæroider er ikke migrerende. Flet: sfæroider migrerer mod hinanden og smelter sammen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: Beregningsværktøj til organoid såopløsning. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: STL-fil til 3D-udskrivning brugerdefineret labware 'Microplate Holder'. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: STL-fil til 3D-udskrivning brugerdefineret labware '2 x 25 ml reservoirholder'. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: JSON-fil til brugerdefineret labware pipetteringsrobot 'Microplate Holder'. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 5: JSON-fil til brugerdefineret labware pipetting robot '2 x 25 ml Reservoir Holder_WithCooler'. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 6: JSON-fil til pipetteringsrobotprotokol 'Plating_ PDO_384well_Cooled_Row2-23'. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 7: Oversigt over opsætning af pipetteringsrobotbord. (A) Køleelementer og (B) reservoir og mikroplade. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 8: TDD-fil til protokol for den digitale lægemiddeldispenser. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 9: XML-fil til protokol for live-cell imager til brightfield og fluorescensbilleddannelse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 10: Eksempel på pladekort. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 11: Eksempel på inputfil til NDR R-script. Forkortelse: NDR = normaliseret lægemiddelrespons. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 12: Normaliseret lægemiddelrespons NDR R-script. Forkortelse: NDR = normaliseret lægemiddelrespons. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 13: Eksempel på outputfil med NDR R-script GR-værdier. Forkortelser: GR = vækstrate; NDR = normaliseret lægemiddelrespons. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 14: Eksempel på outputfil af NDR R-script med GR-værdier transponeret. Forkortelser: GR = vækstrate; NDR = normaliseret lægemiddelrespons. Klik her for at downloade denne fil.
S upplementary File 15: Eksempel på outputfil med NDR R-script NDR-værdier. Forkortelse: NDR = normaliseret lægemiddelrespons. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 16: Eksempel på outputfil for NDR R-script med NDR-værdier transponeret. Forkortelse: NDR = normaliseret lægemiddelrespons. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Medium til høj gennemstrømning PDTO-lægemiddelscreening er ofte afhængig af udlæsninger, der kun udtrækker en brøkdel af information, som organoider potentielt kan give. Det er blevet mere og mere klart, at for at den hurtigt udviklende organoidteknologi kan realisere større videnskabeligt og klinisk potentiale, er mere avancerede 3D-assays, aflæsninger og analysemetoder kritisk påkrævet. Her beskrives en avanceret screeningspipeline, som ikke kun øger reproducerbarheden, men også forbedrer den kliniske oversættelighed betydeligt ved at inkorporere en AI-drevet, live-celle-billeddannelsesaflæsning. Ud over analysesoftware, der er udviklet internt, implementeres brugen af den normaliserede lægemiddelresponsmetrik (NDR), hvilket tydeligt demonstrerer dens evne til at definere patientspecifikke forskelle i behandlingsrespons6.
Inkluderingen af denne normaliseringsmetrik vil utvivlsomt være af enorm værdi, idet det erindres, at adskillige undersøgelser sigter mod at afgrænse behandlingsrespons baseret på mindre forskelle i areal under kurven (AUC) eller halvmaksimal hæmmende koncentration (IC50) (da de fleste dosis-responskurver overlapper hinanden/er placeret tæt på hinanden)11,12 . Væksthastighedsmålinger er allerede implementeret i screeningsprotokoller for organoidlægemidler ved hjælp af det ATP-baserede assay, men er afhængige af normalisering af referencebrønde lyseret på tidspunktet 04. I modsætning hertil tillader denne metode normalisering af intrawells væksthastighed, som ikke kun tegner sig for interpatientforskelle i PDTO-væksthastighed, men også interwell-forskelle som følge af variationer i såtæthed og pladeplaceringsafhængige virkninger for at øge reproducerbarheden. Desuden tilpassede vi NDR for yderligere at øge adskillelsen af interpatient PDTO-respons ved at inkludere en positiv kontrol for normalisering 6,8.
Desuden kan analysen, som er kompatibel med high-throughput og automatiseringsformater, nøjagtigt detektere individuelle organoidresponser, hvilket muliggør kvantificering af subklonal resistens - den største drivkraft for tumortilbagefald og progression13. For eksempel, selvom PDAC052 og PDAC060 viste et godt respons på behandlingen in vitro (baseret på NDR), var den yderligere enkeltorganoidanalyse i stand til at detektere en lille (større population med PDAC060) population af subkloner, der ikke reagerer på behandlingen. Interessant nok svarede dette meget til den kliniske observation, da PDAC052 og PDAC060 havde et varigt respons (ingen tumoraktivitet detekteret), men til sidst begge blev diagnosticeret med lokal tumorprogression (på grund af tilstedeværelsen af resistente kloner). Sammenlignet med de konventionelle 3D-aflæsninger (ATP-baseret analyse og størrelse/tal) forventes denne avancerede screeningspipeline at øge den prædiktive ydeevne ved at udtrække mere klinisk relevant information ud af disse 'patienter-i-laboratoriet'. Denne hypotese testes nu ved screening af kliniske PDTO-prøver i forfatternes laboratorium med denne metode for at korrelere ex vivo med in vivo-respons og klinisk resultat.
For at opnå mere indsigt i mekanismerne for et lægemiddelrespons er konventionelle fluorescerende levende cellebilleddannelsesreagenser ud over cytotoksicitetsfarvestoffer kompatible med denne metode til at studere mekanismer for celledød. Vi har tidligere vist kompatibiliteten af denne metode med Sartorius Caspase 3/7 Green Reagens til undersøgelse af caspaseafhængig induktion af apoptose efter cisplatinbehandling8. Kompatibiliteten med andre farvestoffer til undersøgelse af oxidativ stress (CellROX-reagenser) eller hypoxi (Image-iT Hypoxi-reagenser) skal stadig testes. Imidlertid er disse reagenser allerede med succes blevet anvendt i 3D in vitro-modeller 14,15.
Billedanalysesoftwaren er også kompatibel med andre pladeformater eller dyrkningsmetoder (f.eks. Mikrokavitetsplader, ECM-kupler), hvis der kan tages klare billeder i fokus af organoiderne. Dette er ofte udfordrende for organoider, der dyrkes i kupler, da de vokser i forskellige z-planer, hvilket kræver z-stablingsfunktionalitet i mikroskopet, der ikke altid er tilgængelig. Derfor anbefaler vi brugen af fladbundede ULA 384-brønds mikroplader for at sikre billeder af tilstrækkelig kvalitet.
Derudover er analysen kompatibel med andre live-celle-billeddannelsessystemer, som tidligere vist for fasekontrastbilleder taget med et IncuCyte ZOOM-system8. En begrænsning af Spark Cyto live-cellebilleddannelsessystemet, der blev brugt i dette manuskript, er enpladekapaciteten til kinetiske målinger. Spark Motion-udvidelsen øger dog sin kapacitet til op til 40 mikroplader, der kan screenes i bulk. Kompatibiliteten af den software, der udvikles internt, vil blive udvidet til disse og andre systemer for at tilbyde en platformagnostisk løsning med det formål at standardisere og automatisere billed- og dataanalyserørledninger. Den webbaserede applikation vil også omfatte interaktive grafværktøjer og automatiserede lægemiddelmetriske beregninger, som vist i dette papir, for at reducere manuel analysetid.
Den etiketfri PDTO-segmenteringsalgoritme blev trænet og testet på forskellige internt dyrkede sfæroid- og PDTO-modeller med forskellige morfologiske forskelle (fast, halvfast, cystisk) og kan derfor detektere disse med høj nøjagtighed8. En begrænsning af modellen er, at inkluderingen af cystiske PDTO'er øgede den uønskede påvisning af bobler, der var til stede i brønden efter såning. Imidlertid var inkubation natten over tilstrækkelig til at fjerne de fleste af disse bobler, hvilket muliggjorde en kvalitativ tidspunkt 0-scanning. Nøjagtigheden af organoidbilledsegmenteringen og metoden skal valideres af andre brugere, og baseret på deres feedback kan softwaren trænes yderligere for at opnå en robust og automatiseret billedanalysealgoritme. Derudover sigter vi mod at opnå flere kliniske data for at korrelere ex vivo-lægemiddelresponset kvantificeret ved denne metode til det kliniske respons hos patienten for at identificere de bedste parametre til at forudsige behandlingsrespons og videreudvikle denne metode til funktionel præcisionskræftmedicin16.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
En del af denne forskning blev finansieret af donationer fra forskellige donorer, herunder Dedert Schilde vzw og Willy Floren. Dette arbejde finansieres delvist af Flamish Research Foundation, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G.), 1S27021N (M.L.) og af Industrial Research Fund ved universitetet i Antwerpen, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.). Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| 8-Channel p300 (GEN 2) pipette | Opentrons | ||
| 300 µL Tips | Opentrons | ||
| 384-well flat-bottom ULA microplate | Corning | 4588 | minimum volume 50 µL |
| 384-well flat-bottom ULA Phenoplate | Perkin Elmer | 6057802 | minimum volume 75 µL |
| A8301 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| ADF+++ | Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin | ||
| Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12634 | |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| Breathe easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | |
| Caspase 3/7 Green | Sartorius | 4440 | |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 | Bio-Rad Laboratories | 1450017 | |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | ATP-assay |
| Cooler for 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 490006-908 | |
| Cooling element 12 x 8 x 3 cm | Bol.com | 9200000107744702 | For custom microplate holder OT-2 |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D systems | 3700-100-01 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D systems | 3533-010-02 | extracellular matrix (ECM) |
| Cytotox Green | Sartorius | 4633 | |
| Cytotox Red | Sartorius | 4632 | |
| D300e | Tecan | Digital drug dispenser | |
| D300e Control v3.3.5 | Tecan | Control software D300e | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Full Medium | ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin | ||
| Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| Gemcitabine | Selleck Chemicals | S1714 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 35050 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62259 | |
| Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids | Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan) | ||
| N-acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N002 | |
| Opentrons App v6.0.1 | Opentrons | OT-2 control software | |
| Opentrons Protocol Designer Tool | Opentrons | https://designer.opentrons.com/ | |
| Orbits data compression tool | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | ||
| Orbits image analysis webapp | University of Antwerp | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | |
| OT-2 | Opentrons | Pipetting robot | |
| Paclitaxel | Selleck Chemicals | S1150 | |
| Pasteur Pipette 230 mm | Novolab | A33696 | |
| Peniciline-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N003 | |
| Spark Cyto 600 | Tecan | Live-cell imaging and multi-mode platereader | |
| SparkControl v3.1 | Tecan | Spark Cyto control software | |
| Staurosporine | Tocris Bioscience | 1285 | |
| Sterile 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 10141-922 | |
| T8 plus cassette | Tecan | ||
| TC20 | Bio-Rad Laboratories | automated cell counter | |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12604-021 | dissociation enzyme |
| Tween-20 | Acros Organics | 233360010 | |
| WNT Surrogate-Fc-Fusion protein | Immunoprecise | N001 | |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 |
References
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Veninga, V., Voest, E. E. Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine. Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).
- Le Compte, M., et al. Patient-derived organoids as individual patient models for chemoradiation response prediction in gastrointestinal malignancies. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 157, 103190 (2021).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nature Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Gupta, A., Gautam, P., Wennerberg, K., Aittokallio, T. A normalized drug response metric improves accuracy and consistency of anticancer drug sensitivity quantification in cell-based screening. Communications Biology. 3 (1), 42 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Deben, C., Cardenas, E., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cellular Oncology. , (2022).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), (2017).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Engel, R. M., et al. Patient-derived colorectal cancer organoids upregulate revival stem cell marker genes following chemotherapeutic treatment. Journal of Clinical Medicine. 9 (1), 128 (2020).
- Hennig, A., et al. Detecting drug resistance in pancreatic cancer organoids guides optimized chemotherapy treatment. The Journal of Pathology. 257 (5), 607-619 (2022).
- D'Alterio, C., Scala, S., Sozzi, G., Roz, L., Bertolini, G. Paradoxical effects of chemotherapy on tumor relapse and metastasis promotion. Seminars in Cancer Biology. 60, 351-361 (2020).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct Vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Godet, I., et al. Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis. Nature Communications. 10 (1), 4862 (2019).
- Letai, A. Functional precision cancer medicine-moving beyond pure genomics. Nature Medicine. 23 (9), 1028-1035 (2017).
