アルテミアサリナLを用いた致死性バイオアッセイ。
Summary
この作業は、評価とレビューを目的としています アルテミアサリナ 致死性バイオアッセイ手順、ブラインシュリンプ致死性アッセイとしても識別されます。このシンプルで安価な方法は、サンプル、すなわち天然物の一般的な毒性(予備毒性評価と見なされる)に関する情報を提供します。
Abstract
天然物は古くから医薬品の製造に使用されてきました。今日では、天然資源から入手し、多くの病気に対して使用される化学療法薬がたくさんあります。残念ながら、これらの化合物のほとんどは、全身毒性と副作用を示すことがよくあります。選択された潜在的に生理活性サンプルの忍容性をよりよく評価するために、ブラインシュリンプ(Artemia salina)は一般的に致死性研究のモデルとして使用されます。 A.サリナ テストは、研究された生理活性化合物が幼虫期(ノープリウス)で微小甲殻類を殺す能力に基づいています。この方法は、細胞毒性試験、ならびに合成、半合成、および天然物の一般的な毒性スクリーニングのための便利な出発点となります。これは、前述の目的に一般的に適した他の多くのアッセイ(in vitro 細胞または酵母株、ゼブラフィッシュ、げっ歯類)と比較して、単純、迅速、および低コストのアッセイと見なすことができます。さらに、特別なトレーニングがなくても簡単に実行できます。全体として、 A.サリナ アッセイは、選択された化合物の予備毒性評価および天然物抽出物のバイオガイド分画のための有用なツールである。
Introduction
植物、動物、または微生物からの天然物は、その多様な生物学的および薬理学的活性のために、新しい生理活性分子の開発において長年にわたって関心が高まっている分野です1。しかし、関連する副作用、薬剤耐性、または薬剤の不十分な特異性は、特に抗癌剤として使用される場合、無効な治療につながる可能性のある主要な要因を表しています1,2。
過去数十年にわたって、いくつかの植物由来の細胞傷害剤が発見されており、そのうちのいくつかは抗癌剤として使用されている1,2,3。これに関連して、パクリタキセルは、天然起源の最も有名で最も活性な化学療法薬の1つとして報告されています3,4。現在、市場に出回っているすべての医薬品の35%以上が天然物に由来するか、天然物に触発されていると推定されています5。これらの化合物の潜在的な高い毒性は、植物自体のさまざまな種類の汚染物質または代謝成分でさえ毒性作用を引き起こす可能性があるため、すべての研究段階で考慮する必要があります。このため、薬理学的および毒物学的プロファイルは、新しい潜在的な植物ベースの治療の生物学的活性と安全性を評価するために、予備段階で実施する必要があります。新しい生理活性サンプルの毒性を評価するために、無脊椎動物を研究するのに最適なモデルと見なすことができます。彼らは最小限の倫理的要件を要求し、脊椎動物1,6での次のテストラウンドで最も有望な製品を優先するために、予備的なin vitroアッセイを可能にします。
一般にブラインシュリンプとして知られているA.サリナは、アルテミア属に属する小さな好塩性無脊椎動物です(アルテミダエ科、アノストラカ目、甲殻類亜門;図1)。海洋および水生塩水の生態系では、ブラインシュリンプは微細藻類を食べ、魚の餌に使用される動物プランクトンの成分であるため、重要な栄養的役割を果たします。さらに、それらの幼虫(ノープリウスとして知られている)は、予備研究中の一般的な毒性の評価に広く使用されています1,3,7。
アルテミア属は致死性試験で広く使用されており、実験室で増殖したノープリウスを殺す能力に基づいて潜在的に生理活性化合物の毒性を追跡することにより、毒性評価の便利な出発点でもあります1,8。このため、A. salinaの使用は、動物モデル9の他の試験と比較して、非常に効率的で使いやすい方法であるため、一般的な毒性試験で注目を集めました。
解剖学的構造が単純で、サイズが小さく、ライフサイクルが短いため、1回の実験で膨大な数の無脊椎動物を研究することができます。そのため、遺伝的快適性と低コストの適合性を大規模スクリーニングと組み合わせています1。これに関連して、一般的な毒性アッセイにおけるブラインシュリンプの使用は、急速な成長(孵化から最初の結果まで28〜72時間が必要)、費用対効果、および一年中使用できる市販の卵の長い貯蔵寿命などのいくつかの利点を示しています3,10。一方、無脊椎動物は原始的な器官系を持ち、適応免疫系を持たないため、ヒト細胞の完全で信頼できるモデルではありません1。
ただし、選択したサンプルの一般的な毒性の予備評価方法を提供します。致死性アッセイとして広く使用されているため、潜在的な抗がん剤の毒性作用に関する暫定的な適応症を提供できます。また、 アルテミア エビの中で可能な限り低い死亡率を示すことが不可欠である他の生物学的活性に恵まれた化合物の一般的な毒性についてのフィードバックを得るためにもよく使用されます。
私たちのグループからの進行中の研究では、プレクトランサス種からのさまざまな抽出物が抗酸化作用と抗菌作用を示しました(未発表の結果)。並行して、単離された化合物を抽出物の精製によって得、次いで化学修飾した。次に、抽出物、純粋な化合物、および半合成誘導体を一般的な毒性の観点からテストしました。これに関連して、本研究は、生理活性抽出物およびPlectranthus属の異なる植物からの単離された化合物の一般的な毒性および潜在的な細胞毒性活性の評価のためのアルテミア致死性バイオアッセイの使用の概要を示すことを目的としています11。
図1:顕微鏡下の アルテミアサリナ 。 顕微鏡で見た A.サリナ の新しく孵化したノープリウス(倍率12倍)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
過去数年間、科学界は毒性スクリーニングの代替モデルへの関心を高めてきました21。A. salina致死バイオアッセイの他に、他の方法論が通常、サンプル忍容性の評価のために行われ、脊椎動物バイオアッセイ(げっ歯類など)、無脊椎動物(ゼブラフィッシュなど)、酵母株または細胞を使用するin vitro法、およびインシリコ法が含まれます22,23,24…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アミルカル・ロベルト教授を偲んで。
この作業は、プロジェクトUIDB/04567/2020およびUIDP/04567/2020の下で、CFIOSおよび博士号助成金SFRH/BD/137671/2018(Vera Isca)に起因するFundaçãopara a Ciência e a Tecnologia(FCT、ポルトガル)によって財政的に支援されました。
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |
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